λ噬菌體的綜述

1、SH ANIXJMG I :NIVh.R54( I、生命科學學院病毒生物學入摘要：噬菌體是一類溫和噬菌體，它們感染大腸桿菌后能進行溶菌性生長(Lytic growth)和溶源性生長(Lysoge nic growth)。其溶源特性對基因重組與遺傳工程研究有很大幫助。本文就入噬菌體的基因組結(jié)構(gòu)、溶源化狀態(tài)的建立 和基因工程應(yīng)用做簡要的綜述，分析存在的問題，并對研究方向進行了展望。病毒生物學關(guān)鍵詞：入噬菌體 溶原性溶菌性 基因克隆引言：大腸桿菌噬菌體 入為長尾噬菌體科，是一類中等大小的大腸桿菌病毒，其基因組為雙鏈線狀DNA，由48502對堿基組成，分子量 3.2 X107，約50個基因，特點是相關(guān)

2、基因成簇排列，形成若干個操縱子?；?組兩端為粘性末端，中間有相當長的 DNA片段是裂解生長非必需的，這就為其作為外源基因的克隆載體提供 了方便。入噬菌體由頭和尾構(gòu)成，其基因組組裝在頭部蛋白質(zhì)外殼內(nèi)部，其序列已被全部測出。感染時吸附位點為 細胞壁。屬溫和性感染；感染的 DNA環(huán)化并整合于宿主基因組中。以 B環(huán)雙向復制，然后通過滾環(huán)機制單向 復制。用于感染大腸桿菌的 入噬菌體改造成的載體應(yīng)用最為廣泛。1、The discovery of bacteriophage lambda1951 年 J. Lederberg 的妻子 Esther Lederberg 第一個證明 了 J. Lederber

3、g 和Tatum用來雜交的 K-12中有原噬菌體，并 命名為入，經(jīng)10年的研究搞清了溶原化的實質(zhì)。從此之后，入噬菌體被廣泛用于模式物種；1962年Esther Lederberg 的同事并且還是她最好的朋友Allan Campbell首次發(fā)現(xiàn)了 入DNA合到細菌 DN A的機制；之后由入噬菌體改造后的載體廣泛的用于基因工程。2、The characteristics of bacteriophage lambda2.1、結(jié)構(gòu)特點：/為大腸桿菌溫和性噬菌體，屬長尾噬菌體科，頭殼為直徑約50nm的二十面體，其內(nèi)包裹一長線狀雙鏈 DNA分子（46500bp ），因分子兩端各有一含 12個核苷酸的 黏

4、性末端，故又可黏合成環(huán)狀分子。有柔韌的管狀長尾，無收縮尾鞘，長約150nm，末端有一根尾絲，蝌蚪狀。病毒毒粒的基本結(jié)構(gòu)是包圍著病毒核酸的蛋白質(zhì)外殼，即殼體（capsid ）或稱衣殼。殼體是由大量同一的殼體蛋白單體分子，即蛋白質(zhì)亞基（protein subunit ）以次級鍵結(jié)合形成的?；谖锢韺W原因和相對簡單的 幾何學原理，由蛋白質(zhì)亞基構(gòu)成的病毒殼體主要取螺旋對稱和二十面體對稱兩種結(jié)構(gòu)形式。如圖1 ,入噬菌體頭部為二十面體對稱結(jié)構(gòu)，而柄部為螺旋對稱結(jié)構(gòu)。由入噬菌體結(jié)構(gòu)可以看出，其屬于復合對稱結(jié)構(gòu)，即具有二十面體對稱的頭部和螺旋對稱的柄部圖1:入噬菌體的結(jié)構(gòu)圖2入噬菌體電鏡照片2.2、基因組特征

5、：入噬菌體的基因組，為兩端不閉合的線型雙鏈DNA，約占粒子重的54%，分子量為30.8 X106道爾頓，48502核苷酸對，長度為17 口m , XDNA分子兩末端的5 '端稱為成熟末端，粘性末端由噬菌體顆粒提取的 DNA，其線性分子與兩端連接呈環(huán)狀的分子，可成一平衡狀態(tài)，但環(huán)狀分子兩條鏈各有一缺口。在DNA分子濃聚的情況，分子末端之間連接，可以發(fā)生聚集現(xiàn)象。由于DNA兩條鏈的堿基差異，得到的分開的兩條單鏈，分別稱為I和r鏈（左和右鏈）。I鏈的走向是從53 '的方向，所以是左向或反時針方向轉(zhuǎn)錄，5'末端稱為m末端，末端堿基為鳥嘌呤（G）。r鏈的5'f 3 

6、9;走向與I鏈相反為右向或順時針方向轉(zhuǎn)錄，鏈 的5 '末端稱為m '末端，其末端堿基為腺嘌呤（A）。感染進入菌細胞的XDNA兩互補端聯(lián)結(jié)，成為環(huán)狀 DNA分子，并由宿主細胞的連接酶將兩端的缺口封閉成環(huán)狀DNA分子，噬菌體進行復制、轉(zhuǎn)錄和整合。如在離體的條件下，用 DNA聚合酶將此單鏈的黏性末端補平成雙鏈，DNA就失去其生物活性，不再能有復制和溶原化的能力。 19 DMA .鼻口第瞇 SO«««/-* V*4 AWBDEF UVCiTHMLiaM nl »Nef cm O P Q SRcm 匸 _-: p 1 rrst B >c35*

7、 E r F£屯FEcsRJJ綣艮：r*»13nwS S«mWin Eun圖3:入噬菌體的DNA線狀圖譜/基因組可分為四大簇，它們分別是調(diào)節(jié)區(qū)、重組區(qū)、復制區(qū)和結(jié)構(gòu)基因區(qū)（包括與頭、尾部合成及組裝、裂解有關(guān)的基因）整個基因組如圖所示，可分為三個部分，左臂：長約20kb，其中的基因編碼構(gòu)成頭部、尾部、尾絲對組裝完整噬菌體所需要的蛋白質(zhì)。中段：長約20kb，是XDNA整合和切出，溶原生長所需的序列。右臂：長約10kb，是調(diào)控區(qū)，控制溶菌和溶原生長最重要的調(diào)控基因和序列、以及ADNA復制起始均在這區(qū)域內(nèi)。左右臂包含 XDNA復制、噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白合成、組裝成熟噬菌體、溶菌

8、生長所需全部序列;對溶菌生長來說，中段是非必需的根據(jù)入DNA勺環(huán)狀結(jié)構(gòu)，可將 66個可編碼的基因分成 3個功能區(qū)(function block ):右邊的功能區(qū)參與 衣殼形成和DNA的復制，稱為右操縱子區(qū)；左邊的功能區(qū)與裂解生長和溶源化功能有關(guān)，稱為左操縱子區(qū)；中央功能區(qū)是 入基因組調(diào)控操縱子區(qū)，也稱為免疫操縱子區(qū)。A map of phage showing che rnajor genes.StabHizer of ctl proteinPhage recombination proteins (盤* ExcisionaseA(for excision from / chromosome!

9、 *工治 /Integraseinf(for integration i ntQ chrome some)ReguHator of Regulator cI gene 、 Of ear'V 莎加.k repre33Orl eraPhage DNA / replicattan *<proteinsORegulator/ of late genes r Lysis proteinsEarly promoters and operatorsrAQ/、Late gene promoter gNulA TerminaseCutting of DNA at few site for pack

10、agingRegulator of k fj, and mi gene expressionGenes for hed proteins and assemblvGenes for tail proteins $nd assembly圖4: Z基因組環(huán)狀圖譜及主要的基因入噬菌體基因組的最大特點是在雙鏈線狀DNA兩端各有12bp的粘性末端，可以環(huán)化，該粘性末端形成的雙鏈區(qū)域稱為cos位點(cohensive-end site )。如果將左右臂和中段都去除，僅留下XDNA而端包裝噬菌體所必需的cos序列，再加上質(zhì)粒的復制序列、標志基因、多克隆位點等，就可構(gòu)成cos質(zhì)粒或稱為粘粒的載體。粘?？刹迦?

11、5kb長的外源DNA,然后用入噬菌體外殼蛋白包裝成噬菌體，感染大腸桿菌后，粘粒的 DNA 能以質(zhì)粒的形式在細菌中繁殖而被克隆。所以粘粒主要用于DNA文庫的構(gòu)建。圖5:通過cos位點，可形成雙鏈環(huán)狀復制型DNA ( RF DNA)2.3、入噬菌體的侵染過程(1) 吸附吸附是病毒表面蛋白與細胞受體特異性的結(jié)合，導致病毒附著于細胞表面，這是啟動病毒感染的第一階段。病毒吸附蛋白病毒吸附蛋白(viral attachment protein, VAP )是病毒毒粒表面能夠特異性地識別細胞受體并與之結(jié)合的結(jié)構(gòu)蛋白分子，亦稱作反受體(antireceptor )。無包膜毒粒的反受體往往是殼體的組成部分，有包

12、膜病毒的 反受體為包膜糖蛋白。編碼反受體的基因的突變、能夠滅活或破壞反受體的蛋白水解酶、卩-糖苷酶及中和抗體等均可導致反受體與受體相互作用能力的喪失，進而影響病毒的感染性。細胞受體病毒的細胞受體亦稱病毒受體，是指能被病毒吸附蛋白特異性地識別并與之結(jié)合，介導病毒進入細胞，啟動感染發(fā)生的一組細胞膜表面分子，其大多數(shù)為蛋白質(zhì)，亦可能是糖蛋白或磷脂。不同種系的細胞具有不同病毒的細胞受體，病毒受體的細胞種系特異性決定了病毒的宿主范圍。病毒的吸附過程病毒毒粒與宿主細胞的初始結(jié)合往往涉及一個VAP分子于一個受體蛋白分子的結(jié)合，這種結(jié)合并不緊密，是一可逆過程。當毒粒上的多個位點與多個受體結(jié)合時就可能發(fā)生不可逆

13、的結(jié)合，即發(fā)生吸附增強作用，這 種增強作用使得毒粒與細胞的結(jié)合更加穩(wěn)定、牢固。病毒吸附蛋白與細胞受體間的結(jié)合力來源于空間結(jié)構(gòu)的 互補性，相互間的電荷、氫鍵、疏水性作用及范德華力。(2) 侵入侵入又稱病毒的內(nèi)化，這是一個病毒吸附后幾乎立即發(fā)生，依賴于能量的感染步驟。入噬菌體采取注射的方式將噬菌體核酸注入宿主細胞。(3) 脫殼脫殼是病毒侵入后，入噬菌體的殼體除去而釋放出病毒基因組的過程，它是病毒基因組進行復制和功能表達所 必需的感染事件。入噬菌體脫殼與侵入是一起發(fā)生的，僅有病毒核酸及結(jié)合蛋白進入細胞，殼體留在細胞外。(4) 病毒大分子的合成入噬菌體多數(shù)情況下進行溶源型感染，因此原噬菌體整合至宿主細

14、胞染色體上，隨其進行復制和轉(zhuǎn)錄。在這 一過程中多發(fā)生的各種病毒復制事件存在著強烈的時序性。病毒復制的時序性主要表現(xiàn)為基因組轉(zhuǎn)錄的時間 組織，即病毒基因組的轉(zhuǎn)錄是分期進行的。根據(jù)病毒大分子合成過程中所發(fā)生事件的時間順序，可以將此過 程劃分為3個連續(xù)的階段：病毒早期基因的表達；病毒基因組的復制；病毒晚期基因的表達。入噬菌體DNA合成后腺嘌呤和胞嘧啶被甲基化，或形成由數(shù)個單位長度DNA以相同方向連接形成的 DNA復制分子，即多連體(concatemers )，以保護入噬菌體DNA免遭宿主細胞核酸酶降解。整合有原噬菌體的宿 主細胞不能夠再次接受同源噬菌體的感染。(5) 裝配與釋放特定情況下，整合于宿主

15、細胞染色體上的原噬菌體會從上面分離下來，表達出入噬菌體必需的結(jié)構(gòu)蛋白以及多種物質(zhì)后，裝配成為完整的入噬菌體病毒毒粒，進入溶菌階段，將宿主細胞裂解開而釋放出來，再次侵染其他正常的宿主細胞。3、Lysogenic and lytic process ofZ-phage當DNA侵入宿主細胞后。溶原和裂解途徑的最初過程是相同的。兩者均要求前早期和晚早期基因的表達。然后發(fā)生歧化前早期和晚早期基因表達最終產(chǎn)生cl蛋白，使 進入溶原狀態(tài)，而晚期基因表達使就入裂解循環(huán)。兩個途徑不是截然分開的溶原化循環(huán)包括3個階段：溶原的建立、保持和噬菌體的釋放第一個階段是DNA整合到宿主染色體上。成為前噬菌體狀態(tài)第二個階段是

16、阻遏白操縱子的表達。其產(chǎn)物cI蛋白與cI基因左、右兩邊操縱子(即早左操縱子和早右操縱子)的操縱基因(0L和OR)結(jié)合，抑制它們的轉(zhuǎn)錄。阻斷 整個溶菌途徑。溶原狀態(tài)得以保持但在紫外線等因素作用下，CI蛋白被鈍化，前噬菌體又被切割下來，進入裂解途徑的基因調(diào)控程序.圖6:入噬菌體的溶菌和溶原繁殖方式溶菌途徑的建立過程按時間順序可劃分為3個階段，前早期，晚早期和晚期這三個階段實質(zhì)是由三個操縱子，即早左、早右操縱子和晚期操縱子的相繼激活，合成了三種重要的調(diào)節(jié)蛋白，即N蛋白、Cro蛋白和Q蛋白當溶原化細菌進入溶菌狀態(tài)時，c I基因即行關(guān)閉，CI蛋白不再合成，解除了 CI蛋白對早左、早右兩個操縱子的控制，這

17、就是前早期基因的表達前早期基因表達產(chǎn)物為N蛋白和Cro蛋白.Cro蛋白阻遏CI蛋白的合成，從而使 得以進入裂解循環(huán)，而 N蛋白使前早期基因的轉(zhuǎn)錄越過終止信號而進入晚早期基因，為 溶原和裂解的歧化做好準備.RiRi3人Alt int xh red oil tLi N dUtL PtQi clOrPx cio 1Ri flutR cfl o p tRt Q iRj PR： put tR< S R 和T71yL>圖7 :噬菌體的調(diào)節(jié)基因和轉(zhuǎn)錄次序圖晚早期主要是使早左與早右操縱子表達完全，包括早左操縱子的整合基因、割離基因和重組基因的表達，以及早右操縱子的調(diào)節(jié)蛋白基因Q、Cro、ell、c

18、m和復制基因0、P的表達，這些基因的完全表達即為溶原和溶菌的歧化做好了準備.入噬菌體對兩個生活史周期的選擇取決于CI蛋白和Cro蛋白兩者相拮抗的結(jié)果前早期和晚早期基因的表達使Cro蛋白和CI蛋白均積累起來，CI蛋白抑制除自身外的一切基因的轉(zhuǎn)錄如果CI蛋白占優(yōu)勢，它就阻止泊勺復制，促進整合作用的發(fā)生，使溶原狀態(tài)得以建立和維持.Cro蛋白則抑制e I基因的轉(zhuǎn)錄，因此是一種抗阻遏物如果 Cro蛋白占優(yōu)勢，CI蛋白不能合成，噬菌體即進入營養(yǎng)繁殖周期晚早期的Q基因產(chǎn)物是晚期基因表達的激活蛋白，Q蛋白積累到一定程度，基因表達便進入晚期階段，這個階段已不再需要早期基因表達，這時由于 Cro蛋白的積累而將之關(guān)

19、閉.晚期表達的基因主要是晚期操縱子基因這個操縱子上有20個結(jié)構(gòu)基因，它們占XDNA基因的一半左右因此，晚期操縱子作為一個獨立的操縱子十分重要，這些基因的獨立開啟和調(diào)節(jié)，更有利于這些蛋白的 合成，使整個溶菌過程得以完全實現(xiàn).因此，入的溶原和溶菌途徑是在 入的四個操縱子控制下依次完成的在這四個操縱子中，阻遏蛋白操縱子是 一個起總控制作用的操縱子，是Z基因組的總開關(guān)，它決定 入噬菌體潛伏或裂解的命運有人把泊勺四個操縱子的這種活像接力賽似的，單線聯(lián)系的調(diào)控程序又比喻為瀑布式調(diào)控，既形象又客觀。每一個操縱子就像一 個臺階，入的遺傳信息流就是這樣一瀉到底，蛋白質(zhì)合成了，成熟的噬菌體裝配好了，裂解途徑也就結(jié)

20、束 了因而， 廛因調(diào)控的線性規(guī)則，既簡單又科學.4、入噬菌體在生物學中的應(yīng)用4.1、XDNA作為外源基因的克隆載體/基因組中間部分占30%的DNA(包括重組和溶源化基因)并不是噬菌體裂解生長所必需的，裂解生長所需 的基因都在基因組的左側(cè)和右側(cè)，而典型的入克隆載體在部分或全部非必需基因的兩側(cè)含有限制酶位點，這就賦予了入載體克隆大片段的能力，外源基因插入到限制酶位點之間，在體外包裝成噬菌體，雖然包裝效率僅達 10%，但一經(jīng)包裝，在大腸桿菌中形成噬菌斑的效率可達100%。目前由/衍生的許多載體被廣泛地應(yīng)用于基因克隆中，尤其是在構(gòu)建基因文庫中的應(yīng)用產(chǎn)生了非常好的效果。4.2、入類噬菌體載體構(gòu)建構(gòu)建入噬

21、菌體載體的基本原理是多余限制位點的刪除。按照這一基本原理構(gòu)建的 入噬菌體的派生載體，可以歸納成兩種不同的類型：一種是插入型載體(insertionvectors )，只具有一個可供外源 DNA插入的克隆位點。另一種是替換型載體(replacementvectors )，具有成對的克隆位點，在這兩個位點之間的人DNA區(qū)段可以被外源插入的DNA片段所取代。在基因克隆中的二者的用途不盡相同。插入型載體只能承受較小分子量(一般在10kb以內(nèi))的外源DNA片段的插入，廣泛應(yīng)用于 cDNA及小片段DNA的克隆。而替換型載體則可承受較大分子量的外源DNA片段的插入，所以適用于克隆高等真核生物的染色體 DNA

22、。(i)插入型載體夕卜源的DNA克隆到插入型的/載體分子上，會使噬菌體的某種生物功能喪失效力，即所謂的插入失活效 應(yīng)。插入型的/載體又可以分為免疫功能失活的(inactivatiortofimmunityfunction)和大腸桿菌 卩-半乳糖苷酶失活的(inactlvatlonofE . coli galactosidase )兩種亞型。 免疫功能失活的插入型載體：在這類插入型載體的基因組中有一段免疫區(qū)，其中帶有一兩種核酸內(nèi)切限制酶的單切割位點。當外源DNA片段插入到這種位點上時，就會使載體所具有的合成活性阻遏物的功能遭受破壞，而不能進入溶源周期。因此，凡帶有外源DNA插入的 涯組體都只能形

23、成清晰的噬菌斑，而沒有外源DNA插入的親本噬菌體就會形成混濁的噬菌斑。 件半乳糖苷酶失活的插入型載體：它們的基因組中含有一個大腸桿菌的lac5區(qū)段，其中編碼著 卩半乳糖著酶基因lacZ。由這種載體感染的大腸桿菌lac-指示菌，涂布在補加有IPTG和Xgal的培養(yǎng)基平板上，會形成藍色的噬菌斑。如果外源DNA插入到lac5區(qū)段上，阻斷了卩-半乳糖著酶基因lacZ的編碼序列，不能合成&半乳糖昔酶，只能形成無色的噬菌斑。(ii)替換型載體替換型載體又叫做取代型載體(substitutionvector )，是一類在入噬菌體基礎(chǔ)上改建的、在其中央部分有一 個可以被外源插入的 DNA分子所取代的D

24、NA片段的克隆載體。ZNM781便是其中的一個代表。在這個替換型載體中，可取代的EcoRI片段，編碼有一個supE基因(大腸桿菌突變體tRNA基因)，由于這種ANM781噬菌體的感染，寄主細胞lacZ基因的琥珀突變更被抑制了，能在 乳糖麥康基氏(MacConkey )瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生出紅色的噬菌斑，或是在Xgal瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生出藍色的噬菌斑。如果這個具有supE基因的EcoRI片段被外源DNA取代了，那么所形成的重組體噬菌體，在上述這兩 種指示培養(yǎng)基上都只能產(chǎn)生出無色的噬菌斑。用替換型載體克隆外源 DNA包括三個步驟：第一，應(yīng)用適當?shù)暮怂醿?nèi)切限制酶消化/載體，除去基因組中可取代的 DNA區(qū)段。第二，將上述所得的人 DNA臂同外源DNA片段連接。第三，對重組體的XDNA分子進行包裝和增殖，以得到有感染性的連組噬菌體白我連接我體與.ftDNA連接5、小結(jié)噬菌體對分子生物學的發(fā)展起到了重要的作用。很多噬菌體是目前了解最清楚的，研究最深入的有機體。自從1974年第一次證明入噬菌體作為克隆載體的可能性