細(xì)胞及組織培養(yǎng)的準(zhǔn)備工作

1、細(xì)胞及組織培養(yǎng)的準(zhǔn)備工作一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 掌握細(xì)胞培養(yǎng)的基本概念2. 了解細(xì)胞培養(yǎng)的基木條件3 常握清洗和消毒的基本方法4 .學(xué)習(xí)細(xì)胞培養(yǎng)使用液的配制及準(zhǔn)備方法二、實(shí)驗(yàn)原理1. 細(xì)胞培養(yǎng)的基本概念細(xì)胞培養(yǎng)是用酶消化法將組織碎塊分離成單個(gè)細(xì)胞，用培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，在 體外適宜條件下，使細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖，并保留其一定的結(jié)構(gòu)和功能特性。細(xì)胞培養(yǎng) 與組織培養(yǎng)、器官培養(yǎng)主要不同點(diǎn)在于原始培養(yǎng)的對(duì)象不同。細(xì)胞培養(yǎng)使用的是 單個(gè)細(xì)胞懸液，組織培養(yǎng)使用的是組織塊（0.51立方毫米）或薄片（厚0.2毫米）, 而器官培養(yǎng)使用的是器官原基或器官的一部分或整個(gè)器官。2. 組織細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)能排除神經(jīng)體液因素的影響及肝、腎

2、解毒功能的干擾，觀察某些因素或藥物對(duì)培 養(yǎng)細(xì)胞的直接作用。通過(guò)實(shí)驗(yàn)可獲得某一類型細(xì)胞的純培養(yǎng)。在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中能直接觀察到培養(yǎng)細(xì)胞生命活動(dòng)的動(dòng)態(tài)過(guò)程。3. 組織細(xì)胞培養(yǎng)的不足之處培養(yǎng)細(xì)胞失去體內(nèi)細(xì)胞的制約和整體的調(diào)節(jié)作用，細(xì)胞形態(tài)和功能會(huì)發(fā)生一定程 度的改變。培養(yǎng)方法、實(shí)驗(yàn)試劑對(duì)細(xì)胞形態(tài)和功能有一定的影響。長(zhǎng)期體外培養(yǎng)的細(xì)胞，由于反復(fù)傳代、凍存和操作等因素的影響，可能發(fā)生染色 體非整倍體改變，呈永生化或癌變的特征。4. 細(xì)胞及組織培養(yǎng)的基本條件（1）無(wú)污染的環(huán)境條件：物理污染；化學(xué)污染；生物污染。（2）適當(dāng)?shù)臏囟龋?5-37°c（人和哺乳動(dòng)物細(xì)胞）（3）氣體環(huán)境與ph環(huán)境：ph7.2

3、7.4（人和哺乳動(dòng)物細(xì)胞）（4）營(yíng)養(yǎng)條件（5）其它條件：等滲條件、附著底物5. 清洗與滅菌（1）清洗在組織細(xì)胞培養(yǎng)中，體外細(xì)胞對(duì)任何有害物質(zhì)都非常敏感。微生物產(chǎn)品附帶雜物，上次細(xì)胞殘留物 及非背養(yǎng)成分的化學(xué)物質(zhì)，均能蹈響培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此對(duì)新使用玻璃器皿和重新使川的培養(yǎng)器皿都要 嚴(yán)格徹底的清洗，h要根據(jù)器iiil的組成材料不同，選擇不同的清洗方法。玻璃器皿的清洗組織細(xì)胞培養(yǎng)中，使用屋最大的是玻璃器ii1l,故工作最最大的是玻璃器ii1l的清洗。一般玻璃器ii1l的 淸洗包括浸泡、刷洗、浸酸和沖洗四個(gè)步驟。淸洗后的玻璃器皿不僅要求干凈透明無(wú)汕跡，而且不能殘留 任何物質(zhì)。（1）浸泡：初次使用和培

4、養(yǎng)使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附著物軟化或被溶液掉。新 的初次使用的玻璃器iiil,在生產(chǎn)及運(yùn)輸過(guò)程中，玻璃表面帶冇大量的干固的灰塵，且玻璃表面常呈堿性及 帶冇一些對(duì)細(xì)胞冇害的物質(zhì)等。新瓶使用麗應(yīng)先用白來(lái)水簡(jiǎn)單刷洗，然后用稀鹽酸液浸泡過(guò)夜，以中和其 中的堿性物質(zhì)。再次使用的玻璃器皿則常附有人量剛使用過(guò)的蛋白質(zhì)，干固后不易洗掉，故用后要立即浸 入水中，且要求完全浸入，不能留有氣泡或浮在液面上。（2）刷洗：浸泡后的玻璃器皿一般要用毛刷沾洗滌劑刷洗，以除去器皿表面附著較牢的雜質(zhì)。刷洗 要適度，過(guò)度會(huì)損害器iiil表面光澤度。（3）浸酸：清潔液是由重銘酸鉀、濃硫酸和蒸飾水按一定比例配制而成，

5、其處理過(guò)程稱為浸酸。清潔液對(duì)玻璃器皿無(wú)腐蝕作用，而其強(qiáng)氧化作用可除掉刷洗不掉的微量雜質(zhì)。請(qǐng)潔液左污能力很強(qiáng)。是淸洗 過(guò)程中關(guān)鍵的一環(huán)。浸泡時(shí)器皿要充滿清潔液，勿留氣泡或器皿露出淸潔液面。浸泡時(shí)間一般為過(guò)夜，不 應(yīng)少于6小時(shí)。清潔液可根據(jù)需要，配制成不同的強(qiáng)度，常用的下列三種：匝倂酸鉀（g）濃硫酸（ml） 蒸t®水（ml）（a）強(qiáng)清潔液63 : 1000 : 200000 （b）次強(qiáng)清洗液120 : 200 : 1000 （c）弱淸潔液100 : 100 :100o請(qǐng)潔液配制時(shí)應(yīng)注意安全，須穿戴耐酸手套和圍裙，并要保護(hù)好而部及身體裸露部分。配制過(guò)程中 可使重鋸酸鉀溶于水中，然后慢慢加濃

6、硫酸。并不停的川玻璃棒攪拌，使產(chǎn)生的熱量揮發(fā)，配制過(guò)程中可 使匝珞酸鉀溶于水屮，然后慢慢加濃硫酸。并不停的用玻璃棒攪拌，使產(chǎn)生的熱量揮發(fā)，配制溶液應(yīng)選擇 犁料制品。配成后清潔液一般為棕紅色。（4）沖洗：玻璃器皿在使用后，刷洗及浸泡后都必須用水充分沖洗。使z盡量不田污染或沽液的殘 跡。沖洗最好用洗滌裝置。即省力、效果乂好。如用手工操作，則需流水沖洗十次以上,每天水須灌滿及 倒干凈，最好川蒸憎水淸洗3-5次，晾干備用。膠塞的清洗細(xì)胞培養(yǎng)中所用的橡膠制品主耍是瓶塞。新購(gòu)置的瓶塞帶有大量滑石粉及朵質(zhì)，應(yīng)先用自來(lái)水沖洗, 再做常規(guī)處理，簾規(guī)消洗方法是：每次川后立即置入水中浸泡，然后jij 2% naoh

7、或洗衣粉煮沸10-20分 鐘，以除掉培養(yǎng)屮的蛋白質(zhì)。自來(lái)水沖洗后，再用1%稀鹽酸浸泡30分鐘或蒸謂水沖洗后再煮沸10-20分 鐘，晾干備用。塑料制品的清洗塑料自制品現(xiàn)多是采用無(wú)毒并已經(jīng)特殊處理的包裝，打開包裝即可用，多為一次性物品。必要時(shí)用 2% naoh浸泡過(guò)夜，用口來(lái)水充分沖洗，再用5%鹽酸溶液浸泡30分鐘，最后用口來(lái)水和蒸幫水沖洗干 凈，晾干備用。（2）細(xì)胞及組織培養(yǎng)用詁的包裝（3）細(xì)胞及組織培養(yǎng)用品的消毒與滅菌細(xì)胞培養(yǎng)的最人危險(xiǎn)是發(fā)生培養(yǎng)物的細(xì)啣，真菌和病毒等微生物的污染。污染主要是由于操作者的 疏忽而引起，常見的原因有操作間或周圍空間的不潔，培養(yǎng)器皿和培養(yǎng)液消毒不合格或不徹底。由于有

8、關(guān) 培養(yǎng)的每個(gè)環(huán)節(jié)的失謀均能導(dǎo)致培養(yǎng)失敗，故細(xì)胞培養(yǎng)的毎個(gè)環(huán)節(jié)祁應(yīng)嚴(yán)格遵守操作常規(guī)，防止發(fā)生污染。消進(jìn)方法分為三類：物理滅菌法（紫外線、濕熱、干烤、過(guò)濾等），化學(xué)滅菌法（各種化學(xué)消密劑） 和抗生素。（1）紫外線消毒：用丁空氣，操作臺(tái)表而和不能使用其它法進(jìn)行消毒和培養(yǎng)器皿。紫外線直接照射 方便、效果好，經(jīng)一定的時(shí)間照射后，可以消火空氣中大部分細(xì)菌，培養(yǎng)室紫外線燈應(yīng)距地面不超過(guò)2.5米, 且消每進(jìn)物品不宜相互遮檔，照射不到的地方起不到消每作用。紫外線可產(chǎn)生臭氧,瀉染空氣，試劑及培 養(yǎng)液都有不良影響，對(duì)人皮膚也有傷害，不宜近照射。（2）熱消毒：即高壓蒸氣消毒，是一種使用最廣泛、效果最好的消毒方法。溫

9、熱消毒時(shí)，消毒物 品不能裝得過(guò)滿，以防止消毒器內(nèi)氣體阻塞而千百萬(wàn)危險(xiǎn)，保證其內(nèi)氣體的流通。在加熱升壓z前，先耍 打開排氣閥門排放消無(wú)器內(nèi)的冷空氣，冷氣空氣排出后，關(guān)閉排氣閥門，同時(shí)檢驗(yàn)安全閥活動(dòng)口如，繼后 開始升壓，當(dāng)達(dá)到所需壓力時(shí)，開始記算消毒時(shí)間。消毒過(guò)程中，操作者不能離開工作崗位，要定時(shí)檢查 斥力及安全，防止消進(jìn)及表皮意外事件發(fā)生。常用物品消毒壓力及時(shí)間：培養(yǎng)液、平衡鹽溶液及其它船要滅菌的液體：121°c,15磅,20分鐘；布類、玻璃制品、金屬器械等物品：先12160,15磅,20分鐘，然后在烘箱中烘干；玻璃瓶:干熱滅菌170 c, 4小時(shí)。(3) 化學(xué)消壽法：最常見的是70%

10、酒粘及1%。的新潔而滅，前者主要用于操作者的皮膚，操作臺(tái)表血及無(wú)菌室內(nèi)的壁面處理。后者則主要川器械的浸泡及皮膚和操作室壁廁的擦試消毒。化學(xué)消毒法操作簡(jiǎn) 單、方便有效。(4) 抗生素消毒：主要用于培養(yǎng)用液滅菌或預(yù)防培養(yǎng)物污染。三、實(shí)驗(yàn)材料1 細(xì)胞培養(yǎng)用詁：玻璃器皿；濾器；濾膜；鞍料及橡膠制品；酒精棉球；酒精燈 等。2. 藥品及試劑：kc1, kh2po4, nacl, na2hpo4, nahco3,酒精，新潔爾滅四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1. 儀器使用注意事項(xiàng)。2. 針頭濾器的安裝與使用。3. pbs緩沖液的配制及滅菌處理pbs： naci 8 g, kc1 0.2 g, kh2po4 0.2 g , na2hpo412h2o 3.634g,力u dh2o至900ml,調(diào)ph至7.4,補(bǔ)水至il,分裝到5個(gè)藍(lán)蓋瓶，滅菌。4. 練習(xí)包瓶子、塞子、插槍頭、切蓋玻片，移液管塞棉花等。5. 75%酒精配置、酒精棉球制作以及酒精燈內(nèi)酒精添加。6. 配新潔而滅消毒水