腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因kai1-cd82在順鉑作用下的卵巢癌細(xì)胞中表達(dá)的變化

1、腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因ka 11 /cd82在順餡作用下的卵巢癌細(xì)胞中表達(dá)的變化作者：韓秋峪陸曉媛閆洪超【摘要】目的研究順鎧(cddp)作用下人卵巢上皮性癌細(xì)胞株 3a0中腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因kai1/cd82的表達(dá)的變化，初步探討其作用 機(jī)制。方法采用倒置顯微鏡觀察cddp作用后3a0細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化; 四甲基偶氮吐藍(lán)(mtt)法觀察cddp對細(xì)胞增殖的影響；運(yùn)用免疫細(xì) 胞化學(xué)方法檢測不同濃度cddp(l、3、9 mg/l 3個(gè)濃度組)作用的3a0 細(xì)胞株中kai1/cd82表達(dá)情況，并與細(xì)胞對照組(未經(jīng)藥物處理)進(jìn) 行比較。結(jié)果cddp作用后細(xì)胞體積縮小、細(xì)胞內(nèi)顆粒增多，細(xì)胞核 固縮、深染，細(xì)胞凋亡

2、；cddp對3a0細(xì)胞的生長抑制作用呈明顯的 劑量依賴關(guān)系；cddp作用后卵巢癌細(xì)胞中kai1/cd82基因的表達(dá)較 對照組明顯增強(qiáng)。結(jié)論cddp不僅能增加對卵巢癌細(xì)胞的生長抑制率, 而且能上調(diào)卵巢癌細(xì)胞中腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因kai1/cd82的表達(dá)，為臨 床上藥物抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的深入研究提供了有利的實(shí)驗(yàn)依據(jù)?！娟P(guān)鍵詞】卵巢腫瘤；腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因；kai1/cd82；卵巢上皮 性癌細(xì)胞3a0；順鉗abstract： objective to investigate the effect of cisplatin (cddp) on variations of the expression of me

3、tastasis suppressor gene kai1/cd82 in human ovarian epithelial cancer cell line 3a0 and to make a preliminary study of the mechanism of cddp.methods following cddp administration, the 3a0 cells was visualized morphologically by inverted microscopy. methyl thiazolyl tetrazolium (mtt) assay was employ

4、ed to observe the effects on cellular proliferation. a wide range of cddp concentrations (1 mg/l, 3mg/l and 9 mg/l) were used to detect the expression levels of kai1 gene in 3a0 cell lines by immunocytochemistry (ich) and to make comparisons with the control group (untreated with the drug) results t

5、reated with all concentrations of cddp, 3a0 cells shrinked, cellular granule number increased, resulting in nuclear pycnosis, deep-staining and cell apoptosis mtt assay demonstrated that cddp could partially inhibit the growth of 3a0 cells, with a marked dose-dependent tendency the kai1/cd82 protein

6、 expression in different 3a0 cells treated with cddp was significantly upregulated compared wi th the control (p&it；0.05). conclusion not only does cddp have a significant inhibitory effect on the growth of human ovarian cancer cell line , but also could effectively up-regulate kai1/cd82 express

7、ion in human ovarian cancer cell line, which provides beneficial experimental evidence for clinical chemotherapy for tumor metastasis.key words： ovarian neoplasms； tumor metastasis suppressor gene； kai1/cd82； ovarian cancer cell line 3ao； cisplatin卵巢上皮性癌在所有的婦科惡性腫瘤中具有較高的病死率，其5 年生存率始終徘徊在30%左右，而局部浸潤和轉(zhuǎn)移

8、則是導(dǎo)致患者死亡 的主要原因。我們在研究中發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因kai1/cd82在卵巢 上皮性癌中的表達(dá)與腫瘤的臨床分期、腫瘤分化、轉(zhuǎn)移、癌性腹水密 切相關(guān)，并且kai1/cd82基因表達(dá)下調(diào)是腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因 素之一 lo因此，在此基礎(chǔ)上，我們期望通過分析能夠激活kai1 基因表達(dá)的特異性抗腫瘤藥物，為臨床上藥物治療腫瘤轉(zhuǎn)移提供理論 依據(jù)。順苗(cisplatin, cddp)自從問世以來已成為卵巢癌化療的 核心藥物，其化療效果廣泛得到公認(rèn)，但對其在抑制腫瘤轉(zhuǎn)移方面的 研究目前尚鮮見報(bào)道。本研究通過觀察cddp對卵巢上皮性癌細(xì)胞株 3a0中腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因kai1表達(dá)的影響，進(jìn)而對k

9、ai1基因的激活 途徑、作用機(jī)制作初步探討。1材料和方法1.1材料1. 1. 1細(xì)胞株 人卵巢黏液性囊腺癌細(xì)胞株3a0購自atcc (the american type culture collection),由徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中心 實(shí)驗(yàn)室凍存。細(xì)胞復(fù)蘇后培養(yǎng)于含10%新生小牛血清、100ku/l青霉 素、100 ku/l鏈霉素的rpmi-1640培養(yǎng)液中，在37°c、5% c02培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)并傳代。1. 1.2試劑rpmi-1640細(xì)胞培養(yǎng)基為gibco brl公司產(chǎn)品。二甲 基亞飆(dmso)及四甲基偶氮口坐藍(lán)(mtt)為sigma公司產(chǎn)品。新生 小牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品

10、，使用前經(jīng)56c滅活30 min,置于 -20£冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。cddp注射液為貴州漢方制藥有限公司產(chǎn)品， 相對分子質(zhì)量為300. 05,劑型規(guī)格為每50 ml注射液含50 mg cddp 及450 mg氯化鈉；鼠抗人kai1/cd82單克隆抗體為neomarkers公司 產(chǎn)品，購于深圳晶美生物工程有限公司。sp免疫組織化學(xué)試劑盒購 于福建邁新生物工程有限公司。1. 2方法1.2. 1細(xì)胞的藥物處理將cddp注射液用生理鹽水溶解成0. 05 g/l的儲存液,-20°c避光保存。根據(jù)臨床化療使用cddp的血藥濃度, 處理細(xì)胞的cddp濃度梯度分別為1 mg/l、3 mg/l、

11、9 mg/lo1.2.2倒置顯微鏡下觀察不同濃度cddp作用后細(xì)胞形態(tài)變化 取 對數(shù)生長期的3a0細(xì)胞常規(guī)傳代培養(yǎng)于25 cm2培養(yǎng)瓶中，23天換 液1次，待長至60%融合時(shí)，分別加入含上述3種濃度藥物的 rpmi-1640小牛血清培養(yǎng)液5 ml,對照組為不含藥物的小牛血清培養(yǎng) 液，37°c. 5% c02條件下繼續(xù)孵育2448 h,吉姆薩染色固定細(xì)胞, 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并記錄。1.2.3 mtt法檢測cddp對細(xì)胞的生長抑制作用細(xì)胞對照組：取 對數(shù)生長期的3a0細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液， 調(diào)整細(xì)胞濃度為5x107/l,以每孔100卩1接種于96孔培養(yǎng)板

12、中， 加培養(yǎng)液使每孔體積200 hl； cddp組：將上述的單細(xì)胞懸液100 u 1接種于96孔培養(yǎng)板中，另外加各不同濃度藥物至200 ul；空白對 照組：與實(shí)驗(yàn)孔平行設(shè)不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液200卩1的空白對照孔， 比色時(shí)以空白孔調(diào)零。將細(xì)胞移入co2培養(yǎng)箱中，在37°c. 5% co2 及飽和濕度條件下，培養(yǎng)2472 ho培養(yǎng)終止前，每孔加入mtt溶 液（5 g/l） 20 hl, 37°c,繼續(xù)孵育4 h,終止棄上清。每孔加入 150 u 1 dms0,振蕩10 min,使結(jié)晶物充分溶解。選擇490 nm波長, 在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光密度值（d值）。實(shí)驗(yàn)設(shè)4個(gè)平行樣

13、 本，6個(gè)復(fù)孔，結(jié)果取平均值。細(xì)胞存活率二（細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組d值/細(xì)胞 對照組d值）x100%；細(xì)胞抑制率二1一細(xì)胞存活率。1.2.4免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察cddp作用下kai1基因表達(dá)的情況 在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)平鋪經(jīng)多聚賴氨酸（pll）處理過的無菌蓋玻片。 取單細(xì)胞懸液（細(xì)胞濃度為108/l） 1ml接種于蓋玻片上，對照組加 入1 ml含15%新生小牛血清的培養(yǎng)液，cddp組加入各不同濃度cddp 100 后，用培養(yǎng)液補(bǔ)充至2 mlo將培養(yǎng)板置37°c. 5% c02條件 下孵育24 h,取出玻片，冷丙酮固定20 min,按sp試劑盒進(jìn)行免疫 細(xì)胞化學(xué)染色，抗體工作濃度為1 : 50o運(yùn)用

14、ipp 4. 1統(tǒng)計(jì)軟件對免 疫細(xì)胞化學(xué)圖像進(jìn)行灰度測量，由測試區(qū)的灰度級（ga）和面積（m+n） 及陽性反應(yīng)區(qū)的灰度級（ga）和面積（n）,即可求得陽性單位（pu）。測算公式為：pu=100x | ga-ga | / （aab.gmax）。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用spss 10.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組 間均數(shù)的比較采用單因素方差分析和兩兩比較的q檢驗(yàn)。組間細(xì)胞抑 制率的比較采用方差分析。以p&lt；0. 05為差異有顯著性。2. 1 cddp作用后卵巢癌3a0細(xì)胞株形態(tài)觀察 細(xì)胞經(jīng)各不同濃度 的cddp處理24 h后均可見部分細(xì)胞變圓，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞內(nèi)顆 粒增多。培養(yǎng)48

15、h大多數(shù)細(xì)胞細(xì)胞體積縮小，核固縮、深染，部分 細(xì)胞崩解形成凋亡小體(apoptotic body)0上述改變呈明顯的劑量 依賴性。2.2不同劑量cddp對卵巢癌3a0細(xì)胞增殖抑制率的影響 結(jié)果表 明，cddp組的細(xì)胞抑制率除1 mg/l組與細(xì)胞對照組差異無顯著性(p >0. 05)外，其余各濃度組的細(xì)胞抑制率均明顯高于細(xì)胞對照組 (p&lt；0. 05)； cddp組各組間的細(xì)胞抑制率隨著藥物濃度的增加而 增加，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性，兩兩比較差異亦有顯著性 (p&lt；0. 05) o 見表 lo2.3 cddp對卵巢癌3a0細(xì)胞中kai1/cd82表達(dá)的影響 免疫細(xì)胞

16、化學(xué)sp法染色顯示細(xì)胞對照組3a0細(xì)胞的胞膜上出現(xiàn)散在分布的淡 棕黃色細(xì)顆粒，細(xì)胞邊界著色不連續(xù)(圖1)。而各cddp各濃度組均 可見明顯的的kai1/cd82蛋白陽性表達(dá)，呈不同程度的棕黃色粗顆粒 分布于細(xì)胞膜上或散在于細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞輪廓清晰，邊界連續(xù)。即使 細(xì)胞的凋亡小體中亦表現(xiàn)為kai1/cd82蛋白的強(qiáng)表達(dá)(圖24)。免 疫細(xì)胞化學(xué)圖像分析結(jié)果見表2,統(tǒng)計(jì)分析表明各cddp各濃度組與 細(xì)胞對照組相比，kai1基因的表達(dá)明顯增強(qiáng)(p&lt；0.05)。表1不 同劑量cddp對人卵巢癌3a0細(xì)胞的生長抑制作用 表2 cddp對卵巢 癌3a0細(xì)胞中kai1表達(dá)影響的圖像分析3討論ka

17、i1基因最初是以前列腺癌轉(zhuǎn)移抑制基因而被認(rèn)識的。研究表明， kai1/cd82蛋白對腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制作用主要源于該基因?qū)δ[瘤細(xì)胞運(yùn) 動、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響，這主要與其調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附功能有關(guān)。 kai1/cd82蛋白主要存在于白細(xì)胞和組織細(xì)胞表面，屬于跨膜4超家 族（tm4sf）成員。其分子結(jié)構(gòu)的共同特點(diǎn)是有4個(gè)疏水跨膜區(qū)和一 個(gè)大的包括3個(gè)潛在氨基末端糖基化位點(diǎn)在內(nèi)的細(xì)胞外親水區(qū)，通過 介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間的黏附，在腫瘤細(xì)胞的浸潤 和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用。國內(nèi)有學(xué)者利用脂質(zhì)體介導(dǎo)kai1 cdna 轉(zhuǎn)染高轉(zhuǎn)移性人卵巢癌細(xì)胞株ho-8910pm后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染后的癌細(xì)胞黏 附率明顯下降

18、，穿透人工基底膜的能力也顯著降低2,也有力地證 實(shí)了這一點(diǎn)。進(jìn)一步的臨床研究發(fā)現(xiàn)，kai1基因不僅隨著腫瘤的臨 床進(jìn)展在組織中的表達(dá)逐漸缺失，而且與卵巢上皮性癌患者的預(yù)后密 切相關(guān)3。我們推測這可能與kai1基因抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)，該 基因的作用可以限制腫瘤向浸潤轉(zhuǎn)移階段的發(fā)展。由此可見，激活腫 瘤轉(zhuǎn)移抑制基因kai1的表達(dá)對于有效地控制腫瘤的擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移和復(fù) 發(fā)，延長荷瘤機(jī)體的生存期，改善腫瘤患者的預(yù)后具有重要的臨床意 義。cddp為鉗的金屬絡(luò)合物。作為一種細(xì)胞周期非特異性藥 物，它可以選擇性地攻擊dna堿基的氮原子，特別是鳥嚓吟的第7位 氮原子，它也可與胞嚨噪的第3位氮原子結(jié)合。由于和dna

19、呈交叉聯(lián) 結(jié)，cddp對dna的構(gòu)型有明顯影響，可使雙螺旋解旋，dna分子變短 或斷裂。不僅如此，cddp還可以通過使dna模板作用的失活，抑制 dna的合成。目前在誘導(dǎo)卵巢上皮性癌細(xì)胞凋亡、抑制癌性腹腔積液的形成以 及控制腹腔積液的增長等方面，cddp的作用已經(jīng)達(dá)到國內(nèi)外學(xué)者的 廣泛共識。但是，有關(guān)cddp參與抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的研究，尤其是與腫 瘤轉(zhuǎn)移抑制基因的關(guān)系，報(bào)道甚少。houle等4通過建立裸鼠卵 巢癌腹腔播散模型，用cddp協(xié)同y射線照射進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，低劑量 cddp （為裸鼠用藥量）單獨(dú)或聯(lián)合y射線可部分抑制卵巢癌的腹腔播 散，而高劑量cddp聯(lián)合y射線則可完全抑制腫瘤播散。作者認(rèn)為

20、cddp 聯(lián)合y射線有協(xié)同抑制卵巢癌播散的作用。同時(shí)，該研究還觀察到經(jīng) cddp處理后的卵巢癌細(xì)胞中，cd44含量有所增加。黏附分子cd44是 cd44基因指導(dǎo)編碼合成的跨膜蛋白。它可作為透明質(zhì)酸的受體，與 其結(jié)合并"錨定"在宿主細(xì)胞外間質(zhì)和基底膜上，從而抑制腫瘤細(xì)胞脫 落和新生血管發(fā)生，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移，這與ka11基因 抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制不謀而合。然而cd44基因表達(dá)水平的上調(diào)是否 為cddp的作用效應(yīng)，cddp上調(diào)cd44表達(dá)的機(jī)制又是如何，這些都 有待進(jìn)一步研究。此外，還有學(xué)者在實(shí)驗(yàn)中觀察到cddp能增強(qiáng)卵巢 癌細(xì)胞中mhc基因的表達(dá)。mhc基因是一組編碼

21、細(xì)胞表面蛋白分子或 抗原的基因，其抑制腫瘤轉(zhuǎn)移主要是增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的腫瘤抗原和mhc- i類抗原，而轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞則不表達(dá)mhc- i類抗原，由此導(dǎo)致癌細(xì) 胞免疫原性降低，不能有效地將腫瘤抗原遞呈給t細(xì)胞，逃避細(xì)胞殺 傷而發(fā)生轉(zhuǎn)移5o我們在實(shí)驗(yàn)中觀察到，cddp對卵巢癌3a0細(xì)胞的生長具有明顯的 抑制作用，高劑量組(9mg/l)可見明顯的細(xì)胞腫脹、細(xì)胞核染色質(zhì) 模糊不清，呈均質(zhì)狀，核固縮或破碎，出現(xiàn)典型的凋亡小體，這種變 化與國內(nèi)外的文獻(xiàn)報(bào)道是一致的。更重要的是，我們通過免疫細(xì)胞化 學(xué)染色觀察到cddp的各不同劑量組均能誘導(dǎo)kai1/cd82蛋白的表達(dá), 與未經(jīng)cddp處理的細(xì)胞對照組相比，kai

22、1/cd82蛋白的表達(dá)明顯增 強(qiáng)。而且其表達(dá)水平呈明顯的劑量依賴性，高濃度組的表達(dá)明顯強(qiáng)于 低濃度組。我們推測cddp對kai1基因表達(dá)的激活作用是一個(gè)極其復(fù) 雜的多途徑的過程，涉及到多種基因的參與、調(diào)控及信號傳導(dǎo)。目前 已有報(bào)道認(rèn)為在腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因的激活過程中，cddp對野生型p53 基因和bax基因的上調(diào)應(yīng)該起著舉足輕重的作用6,其中是否還同 時(shí)存在著其他黏附分子的協(xié)同作用以及cddp是發(fā)揮了直接作用還是 間接作用，仍將是我們今后研究的重點(diǎn)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1韓秋峪，張向?qū)?，李小翠，?kai1/cd82和e-cadherin 蛋白在卵巢上皮性癌中表達(dá)的臨床意義j.山東大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2006,