SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量實(shí)用教案

1、【目的(md)】學(xué)習(xí)學(xué)習(xí)SDS-PAGE測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的原理。測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的原理。掌握掌握(zhngw)垂直板電泳的操作方法。垂直板電泳的操作方法。運(yùn)用運(yùn)用SDS-PAGE測(cè)定蛋白質(zhì)分子量及染色鑒定。測(cè)定蛋白質(zhì)分子量及染色鑒定。第1頁(yè)/共27頁(yè)第一頁(yè)，共28頁(yè)。 【原理(yunl)】 在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中，加入一定量的十二烷基硫酸鈉（SDS），使蛋白樣品與SDS結(jié)合形成帶負(fù)電荷的復(fù)合物，由于復(fù)合物分子量的不同，在電泳(din yn)中反應(yīng)出不同的遷移率。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品在該系統(tǒng)電泳(din yn)中所作出的標(biāo)準(zhǔn)曲線，推算出被測(cè)蛋白樣品分子量的近似值。第2頁(yè)/共27頁(yè)第二頁(yè)，共28頁(yè)。 在蛋

2、白質(zhì)混合樣品中各蛋白質(zhì)組分的分子大小和形狀以及所帶電荷多少等因素所造成的電泳遷移率有差別。在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中，加入( jir)一定量的十二烷基硫酸鈉（SDS），形成蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物，這種復(fù)合物由于結(jié)合了大量的SDS，使蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài)，形成了僅保持原有分子大小為特征的負(fù)離子團(tuán)塊，從而降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間的天然的電荷差異，此時(shí)，蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于它的分子量大小，而其它因素對(duì)電泳遷移率的影響幾乎可以忽略不計(jì)。 第3頁(yè)/共27頁(yè)第三頁(yè)，共28頁(yè)。電泳(din yn)過(guò)程中分子遷移的規(guī)律，小分子走在前頭，大分子滯后。電泳(din yn)凝膠相當(dāng)于凝膠過(guò)濾中的一個(gè)

3、帶孔膠粒?；旌?hnh)樣品帶孔膠 按分子(fnz)大小分離電泳方向 電泳 小分子大分子第4頁(yè)/共27頁(yè)第四頁(yè)，共28頁(yè)。夾在兩塊玻璃板之間的凝膠 電泳(din yn)緩沖液 電泳(din yn)緩沖液 加在槽中的經(jīng)SDS處理(chl)的樣品分子量小分子量大電源第5頁(yè)/共27頁(yè)第五頁(yè)，共28頁(yè)。 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量間時(shí)，電泳遷之間時(shí)，電泳遷移率與分子量的自然移率與分子量的自然(zrn)對(duì)數(shù)值呈反比，符合下列方程：對(duì)數(shù)值呈反比，符合下列方程： lnMr =bmR+K 式中：式中：Mr為蛋白質(zhì)分子量，為蛋白質(zhì)分子量，mR為相對(duì)遷移率，為相對(duì)遷移率，b為斜率

4、，為斜率，K為為截距。在條件一定時(shí)，截距。在條件一定時(shí)，b 和和K均為常數(shù)。均為常數(shù)。 若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對(duì)分子量的對(duì)數(shù)作若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對(duì)分子量的對(duì)數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。 第6頁(yè)/共27頁(yè)第六頁(yè)，共28頁(yè)。標(biāo)準(zhǔn)(biozhn)蛋白分子量未知蛋白(dnbi)在一定的凝膠濃度下，多肽鏈分子量的對(duì)數(shù)與多肽鏈的相對(duì)遷移率成線性關(guān)系，所以可以(ky)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線求未知多肽鏈分子量。 相

5、對(duì)遷移率第7頁(yè)/共27頁(yè)第七頁(yè)，共28頁(yè)?！緦?shí)驗(yàn)(shyn)器材】 直流穩(wěn)壓電泳儀直流穩(wěn)壓電泳儀 垂直垂直(chuzh)平板電泳槽平板電泳槽 移液器移液器 微量注射器微量注射器 燒杯、試管、滴管、培養(yǎng)皿、直尺等燒杯、試管、滴管、培養(yǎng)皿、直尺等第8頁(yè)/共27頁(yè)第八頁(yè)，共28頁(yè)。第9頁(yè)/共27頁(yè)第九頁(yè)，共28頁(yè)。第10頁(yè)/共27頁(yè)第十頁(yè)，共28頁(yè)。第11頁(yè)/共27頁(yè)第十一頁(yè)，共28頁(yè)。第12頁(yè)/共27頁(yè)第十二頁(yè)，共28頁(yè)。【實(shí)驗(yàn)(shyn)試劑】 凝膠貯備液凝膠貯備液 分離分離(fnl)膠緩沖液膠緩沖液 濃縮膠緩沖液濃縮膠緩沖液 10%SDS 2倍還原緩沖液倍還原緩沖液第13頁(yè)/共27頁(yè)第十三頁(yè)，

6、共28頁(yè)。【實(shí)驗(yàn)(shyn)試劑】 電極電極(dinj)緩沖液緩沖液 10%過(guò)硫酸銨過(guò)硫酸銨 染色液染色液 脫色液脫色液第14頁(yè)/共27頁(yè)第十四頁(yè)，共28頁(yè)?！緦?shí)驗(yàn)(shyn)試劑】低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白(dnbi)： 兔磷酸化酶兔磷酸化酶B Mr=97,400 牛血清白蛋白牛血清白蛋白(dnbi) Mr=66,200 兔肌動(dòng)蛋白兔肌動(dòng)蛋白(dnbi) Mr=43,000 牛碳酸酐酶牛碳酸酐酶 Mr=31,000 胰蛋白胰蛋白(dnbi)酶抑制劑酶抑制劑 Mr=20,100 雞蛋清溶菌酶雞蛋清溶菌酶 Mr=14,400第15頁(yè)/共27頁(yè)第十五頁(yè)，共28頁(yè)。一、裝板一、裝板 將垂直板型

7、電泳裝置內(nèi)的板狀凝膠模子將垂直板型電泳裝置內(nèi)的板狀凝膠模子取出，將玻璃片洗凈、涼干、嵌入凹槽取出，將玻璃片洗凈、涼干、嵌入凹槽中，形成一個(gè)中，形成一個(gè)“夾心夾心(jixn)”凝膠腔，凝膠腔，把裝好的凝膠腔置于仰放的電極上槽。把裝好的凝膠腔置于仰放的電極上槽。將電泳槽、凝膠模子串成一體的垂直板將電泳槽、凝膠模子串成一體的垂直板型電泳裝置，垂直放置在水平臺(tái)面上，型電泳裝置，垂直放置在水平臺(tái)面上，灌注膠液。灌注膠液。【操作方法】第16頁(yè)/共27頁(yè)第十六頁(yè)，共28頁(yè)。二、分離二、分離(fnl)膠的配制膠的配制（12%）第17頁(yè)/共27頁(yè)第十七頁(yè)，共28頁(yè)。三、分離膠的灌注和聚合三、分離膠的灌注和聚合

8、用移液管將所配制的分離膠用移液管將所配制的分離膠緩沖液沿著凝膠腔的長(zhǎng)玻璃板的內(nèi)緩沖液沿著凝膠腔的長(zhǎng)玻璃板的內(nèi)面緩緩注入，留出梳齒面緩緩注入，留出梳齒(sh ch)的的齒高加齒高加1cm的空間以便灌注濃縮膠，的空間以便灌注濃縮膠，然后加滿蒸餾水。待分離膠凝固后，然后加滿蒸餾水。待分離膠凝固后，倒出蒸餾水，用濾紙吸干。倒出蒸餾水，用濾紙吸干。第18頁(yè)/共27頁(yè)第十八頁(yè)，共28頁(yè)。四、濃縮四、濃縮(nn su)膠的膠的配制（配制（5%）第19頁(yè)/共27頁(yè)第十九頁(yè)，共28頁(yè)。五、濃縮膠的灌注和聚合五、濃縮膠的灌注和聚合(jh) 用移液管將所配制的濃縮膠緩用移液管將所配制的濃縮膠緩沖液沿著凝膠腔的長(zhǎng)玻璃

9、板的內(nèi)面沖液沿著凝膠腔的長(zhǎng)玻璃板的內(nèi)面緩緩注入，將梳子插入膠液頂部，緩緩注入，將梳子插入膠液頂部，放置室溫下待其聚合放置室溫下待其聚合(jh)。第20頁(yè)/共27頁(yè)第二十頁(yè)，共28頁(yè)。六、樣品的準(zhǔn)備六、樣品的準(zhǔn)備 在低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)和待在低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)和待測(cè)樣品中分別加入適量還原緩沖液，測(cè)樣品中分別加入適量還原緩沖液，放入沸水浴中加熱放入沸水浴中加熱(ji r)35min，取出冷至室溫。取出冷至室溫。第21頁(yè)/共27頁(yè)第二十一頁(yè)，共28頁(yè)。七、加樣七、加樣 加 入 電 極加 入 電 極緩沖液，小緩沖液，小心 拔 出心 拔 出 (b ch)梳齒，梳齒，用微量注射用微量注射器向凝膠梳器向凝膠梳

10、孔內(nèi)加樣?？變?nèi)加樣。同 時(shí) 加 入同 時(shí) 加 入Marker。加樣樣品(yngpn)遷移方向第22頁(yè)/共27頁(yè)第二十二頁(yè)，共28頁(yè)。八、電泳八、電泳 上槽接負(fù)極，下槽接正極，打上槽接負(fù)極，下槽接正極，打開(kāi)開(kāi)(d ki)直流電源，剛開(kāi)始時(shí)，電直流電源，剛開(kāi)始時(shí)，電壓控制在不高于壓控制在不高于100V，樣品進(jìn)入分離，樣品進(jìn)入分離膠后，電壓控制在不高于膠后，電壓控制在不高于140V。待指。待指示劑染料靠遷移至下沿示劑染料靠遷移至下沿1處停止電處停止電泳。泳。第23頁(yè)/共27頁(yè)第二十三頁(yè)，共28頁(yè)。九、染色和脫色九、染色和脫色(tu s)小心將膠取出，放入一大培養(yǎng)皿中。小心將膠取出，放入一大培養(yǎng)皿中。

11、染色：加入染色液，置于搖床上染色染色：加入染色液，置于搖床上染色2h。脫色脫色(tu s)：染色完畢，倒出染色液，：染色完畢，倒出染色液，加入脫色加入脫色(tu s)液，置于搖床上脫液，置于搖床上脫色色(tu s)，數(shù)小時(shí)更換一次脫色，數(shù)小時(shí)更換一次脫色(tu s)液，直至背景清晰，拍照。液，直至背景清晰，拍照。第24頁(yè)/共27頁(yè)第二十四頁(yè)，共28頁(yè)。十、相對(duì)分子質(zhì)量的計(jì)算十、相對(duì)分子質(zhì)量的計(jì)算 量出分離膠頂端距溴酚藍(lán)間的量出分離膠頂端距溴酚藍(lán)間的距 離距 離 ( c m ) 以 及 各 蛋 白 質(zhì) 樣 品以 及 各 蛋 白 質(zhì) 樣 品(yngpn)區(qū)帶中心與分離膠頂端區(qū)帶中心與分離膠頂端的距

12、離的距離(cm)，按下式計(jì)算相對(duì)遷移，按下式計(jì)算相對(duì)遷移率率mR:相對(duì)遷移率相對(duì)遷移率mR= 以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量的對(duì)以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量的對(duì)數(shù)對(duì)相對(duì)遷移率作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲數(shù)對(duì)相對(duì)遷移率作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)待測(cè)樣品線，根據(jù)待測(cè)樣品(yngpn)相對(duì)相對(duì)遷移率，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出其分遷移率，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出其分子量。子量。 蛋白質(zhì)樣品距分離膠頂端遷移(qiny)距離(cm)溴酚藍(lán)區(qū)帶中心距分離膠頂端距離(cm)第25頁(yè)/共27頁(yè)第二十五頁(yè)，共28頁(yè)。思考題思考題在不連續(xù)體系SDS-PAGE中，當(dāng)分離膠加完后，需在其上加一層水，為什么?電極緩沖液中甘氨酸的作用?在不連續(xù)體系SDS-PAGE中，分離膠與濃縮膠中均含有TEMED和AP，試述其作用?樣品液為何(wih)在加樣前需在沸水中加熱幾分鐘?第26頁(yè)/共27頁(yè)第二十六頁(yè)，共28頁(yè)。感謝您的觀看(gunkn)！第27頁(yè)/共27頁(yè)第二十七頁(yè)，共28頁(yè)。NoImage內(nèi)容(nirng)總結(jié)【目的】。在蛋白質(zhì)混合樣品中各蛋白