RACE技術(shù)實(shí)用教案

1、RACE簡(jiǎn)介(jin ji)RACERACE是基于是基于PCRPCR技術(shù)基礎(chǔ)上由已知的一段技術(shù)基礎(chǔ)上由已知的一段cDNAcDNA片段，通過往兩端延伸擴(kuò)增從而獲得完整片段，通過往兩端延伸擴(kuò)增從而獲得完整(wnzhng)(wnzhng)的的33端和端和55端的方法端的方法 。RACE(rapid-amplification ofcDNA ends)RACE(rapid-amplification ofcDNA ends)是通過是通過PCRPCR進(jìn)行進(jìn)行cDNAcDNA末端快速克隆的技術(shù)。末端快速克隆的技術(shù)。 第1頁/共52頁第一頁，共53頁。RACERACE技術(shù)技術(shù)(jsh)(jsh)原理原理 R

2、ACE RACE 是采用是采用PCRPCR技技術(shù)由已知的部分術(shù)由已知的部分cDNA cDNA 順序順序(shnx)(shnx)來來擴(kuò)增出完整擴(kuò)增出完整cDNA5cDNA5和和33末端末端, ,是一種簡(jiǎn)是一種簡(jiǎn)便而有效的方法便而有效的方法, , 又被又被稱為錨定稱為錨定 PCR PCR (anchoredPCR)(anchoredPCR)和單邊和單邊PCR(one2side PCR)PCR(one2side PCR)。 第2頁/共52頁第二頁，共53頁。RACERACE技術(shù)技術(shù)(jsh)(jsh)主要分主要分類類一般分一般分5-5-和和3-RACE3-RACE兩種。兩種。 3-RACE 3-RA

3、CE ：3-RACE3-RACE較簡(jiǎn)單，首先將較簡(jiǎn)單，首先將mRNAmRNA或或總總RNARNA用用PolyTPolyT引物反轉(zhuǎn)錄，根據(jù)引物反轉(zhuǎn)錄，根據(jù)一般基因一般基因(jyn)(jyn)具有具有polyApolyA尾巴的特點(diǎn)，選用特異尾巴的特點(diǎn)，選用特異引物引物( (根據(jù)已知根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)序列設(shè)計(jì)) )和和PolyTPolyT引物引物PCRPCR即可。大多實(shí)驗(yàn)者反映即可。大多實(shí)驗(yàn)者反映一次一次PCRPCR可以搞定。可以搞定。第3頁/共52頁第三頁，共53頁。SMARTTM 3-RACESMARTTM 3-RACE的原理的原理(yunl(yunl) ) 5-RACE 5-RACE ：5-RA

4、CE5-RACE相對(duì)較難，目前流行幾種相對(duì)較難，目前流行幾種5- 5- RACE RACE。其一為加接頭。其一為加接頭(ji tu)(ji tu)(傳統(tǒng)傳統(tǒng)) )，根據(jù)接頭，根據(jù)接頭(ji (ji tu)tu)引物和自引物和自 己設(shè)計(jì)特異引物己設(shè)計(jì)特異引物PCRPCR，可以設(shè)計(jì)巢式，可以設(shè)計(jì)巢式PCRPCR二次擴(kuò)二次擴(kuò) 增。另外，有利用反向增。另外，有利用反向PCRPCR技術(shù)，連接成環(huán)在技術(shù)，連接成環(huán)在 PCR PCR。還有，。還有，GENEGENE公司一種公司一種smartRACEPCRsmartRACEPCR，利利 用反轉(zhuǎn)酶末斷加用反轉(zhuǎn)酶末斷加C C特點(diǎn)特點(diǎn), ,直接加上多直接加上多G G

5、接頭接頭(ji tu)(ji tu)，轉(zhuǎn)換模轉(zhuǎn)換模 板而無需用連接酶加接頭板而無需用連接酶加接頭(ji tu)(ji tu)。利用。利用mRNAmRNA的的33末端的末端的 poly(A) poly(A)尾巴作為一個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn)，以連有尾巴作為一個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn)，以連有SMARTSMART第4頁/共52頁第四頁，共53頁。SMARTTM 3-RACESMARTTM 3-RACE的原理的原理(yunl(yunl) ) 寡核苷酸序列通用接頭引物的寡核苷酸序列通用接頭引物的Oligo(dT)30MNOligo(dT)30MN作為鎖定引物反轉(zhuǎn)錄合成標(biāo)準(zhǔn)第一鏈作為鎖定引物反轉(zhuǎn)錄合成標(biāo)準(zhǔn)第一鏈cDNAcDN

6、A。然后。然后(rnhu)(rnhu)用一個(gè)基因特異引物用一個(gè)基因特異引物GSP1(gene specific primer,GSP)GSP1(gene specific primer,GSP)作為上游引作為上游引物，用一個(gè)含有部分接頭序列的通用引物物，用一個(gè)含有部分接頭序列的通用引物UPM(universal primer,UPM)UPM(universal primer,UPM)作為下游引物，以作為下游引物，以cDNAcDNA第一鏈為模板，進(jìn)行第一鏈為模板，進(jìn)行PCRPCR循環(huán)，把目的基因循環(huán)，把目的基因33末端的末端的DNADNA片段擴(kuò)增出來。片段擴(kuò)增出來。第5頁/共52頁第五頁，共53

7、頁。SMARTTM 3-RACESMARTTM 3-RACE的原理圖的原理圖 第6頁/共52頁第六頁，共53頁。SMARTTM 5-RACESMARTTM 5-RACE的原理的原理(yunl(yunl) )先利用先利用mRNAmRNA的的33末端的末端的polypoly（A A）尾巴作為）尾巴作為(zuwi)(zuwi)一個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn)，以一個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn)，以O(shè)ligoOligo（dTdT）30MN30MN作為作為(zuwi)(zuwi)鎖定引物在反轉(zhuǎn)錄酶鎖定引物在反轉(zhuǎn)錄酶MMLVMMLV作用下，反轉(zhuǎn)錄合成標(biāo)準(zhǔn)第作用下，反轉(zhuǎn)錄合成標(biāo)準(zhǔn)第一鏈一鏈cDNA.cDNA.利用該反轉(zhuǎn)錄酶具有的末端轉(zhuǎn)移酶

8、活性，在反轉(zhuǎn)錄達(dá)到第一鏈的利用該反轉(zhuǎn)錄酶具有的末端轉(zhuǎn)移酶活性，在反轉(zhuǎn)錄達(dá)到第一鏈的55末端末端時(shí)自動(dòng)加上時(shí)自動(dòng)加上3-53-5個(gè)（個(gè)（dCdC）殘基，退火后（）殘基，退火后（dCdC）殘基與含有）殘基與含有SMARTSMART寡核苷酸序列寡核苷酸序列OliogoOliogo（dGdG）通用接頭引物配對(duì)后，轉(zhuǎn)換為以）通用接頭引物配對(duì)后，轉(zhuǎn)換為以SMARTSMART序列為模板繼續(xù)延伸而連上序列為模板繼續(xù)延伸而連上通用接頭。通用接頭。第7頁/共52頁第七頁，共53頁。SMARTTM 5-RACESMARTTM 5-RACE的原理的原理(yunl(yunl) )用一個(gè)含有部分接頭序列的通用引物用一個(gè)含

9、有部分接頭序列的通用引物UPMUPM（universal primeruniversal primer，UPMUPM）作為上游引物，）作為上游引物，用一個(gè)基因用一個(gè)基因(jyn)(jyn)特異引物特異引物2 2（GSP 2 genespecific primerGSP 2 genespecific primer，GSPGSP）作為下游引物，以）作為下游引物，以SMARTSMART第一鏈第一鏈cDNAcDNA為模板，進(jìn)行為模板，進(jìn)行PCRPCR循環(huán)，把目的基因循環(huán)，把目的基因(jyn)5(jyn)5末端的末端的cDNAcDNA片段擴(kuò)增片段擴(kuò)增出來。最終，從出來。最終，從2 2個(gè)有相互重疊序列的個(gè)

10、有相互重疊序列的3/ 5-RACE3/ 5-RACE產(chǎn)物中獲得全長(zhǎng)產(chǎn)物中獲得全長(zhǎng)cDNAcDNA，或者通過分，或者通過分析析RACERACE產(chǎn)物的產(chǎn)物的3 3和和5 5端序列，合成相應(yīng)引物擴(kuò)增出全長(zhǎng)端序列，合成相應(yīng)引物擴(kuò)增出全長(zhǎng)cDNAcDNA。第8頁/共52頁第八頁，共53頁。SMARTTM 5-RACESMARTTM 5-RACE的原理圖的原理圖第9頁/共52頁第九頁，共53頁。RACERACE的另一種代表的另一種代表(dibi(dibio)o)方法方法-Self-Ligation-Self-Ligation法法1. 1. 反轉(zhuǎn)錄（反轉(zhuǎn)錄（RTRT）反應(yīng)。）反應(yīng)。2. Hybrid RNA

11、2. Hybrid RNA的分解。的分解。3. 3. 單鏈單鏈cDNAcDNA的自身連接。的自身連接。4. PCR4. PCR擴(kuò)增擴(kuò)增5 5未知區(qū)域未知區(qū)域(qy)(qy)。5. 5. 目的目的DNADNA片段的切膠回收。片段的切膠回收。6. DNA6. DNA序列測(cè)定序列測(cè)定 第10頁/共52頁第十頁，共53頁。原理(yunl)Figure 第11頁/共52頁第十一頁，共53頁。三種三種5 5RACERACE技術(shù)技術(shù)(jsh)(jsh)的比較的比較與優(yōu)化與優(yōu)化環(huán)化法環(huán)化法5RACE5RACESMARTSMART反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄(zhun l)(zhun l)酶法酶法 5RACE 5RACE末端脫

12、氧核糖核酸末端脫氧核糖核酸 轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移酶(TDT(TDT酶酶) )法法 5RACE 5RACE第12頁/共52頁第十二頁，共53頁。三種三種5 5RACERACE技術(shù)技術(shù)(jsh)(jsh)的比較的比較與優(yōu)化與優(yōu)化目的目的研究環(huán)化法、末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶法和研究環(huán)化法、末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶法和SMARTSMART反轉(zhuǎn)錄酶法反轉(zhuǎn)錄酶法3 3種常用種常用5RACE5RACE的技術(shù)的特點(diǎn)，并對(duì)它們進(jìn)行了優(yōu)化。的技術(shù)的特點(diǎn)，并對(duì)它們進(jìn)行了優(yōu)化。方法方法以播娘蒿以播娘蒿RNARNA為模板，先按文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行為模板，先按文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行5RACE5RACE，然后通過增加反，然后通過增加反應(yīng)時(shí)間，提高

13、部分反應(yīng)物濃度等方法進(jìn)行優(yōu)化。應(yīng)時(shí)間，提高部分反應(yīng)物濃度等方法進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果結(jié)果(ji gu)(ji gu)未優(yōu)化前環(huán)化法和未優(yōu)化前環(huán)化法和TdTTdT酶法條帶幾乎不酶法條帶幾乎不第13頁/共52頁第十三頁，共53頁。三種三種(sn zh(sn zhn n)5)5RACERACE技術(shù)的技術(shù)的比較與優(yōu)化比較與優(yōu)化可見，可見， SMART SMART反轉(zhuǎn)錄酶法隱約可見條帶，但不清晰。優(yōu)化條件后，環(huán)化法出現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄酶法隱約可見條帶，但不清晰。優(yōu)化條件后，環(huán)化法出現(xiàn)彌散條帶，彌散條帶，TdTTdT酶法勝之，但條帶依舊彌散，而酶法勝之，但條帶依舊彌散，而SMARTSMART反轉(zhuǎn)錄酶法最佳，獲得反轉(zhuǎn)錄酶法最

14、佳，獲得清晰特異性條帶。結(jié)論清晰特異性條帶。結(jié)論SMART5RACESMART5RACE效果效果(xiogu)(xiogu)最好，其次為最好，其次為TdTTdT酶法，酶法，環(huán)化法效果環(huán)化法效果(xiogu)(xiogu)有待改進(jìn)，同時(shí)通過優(yōu)化條件可以明顯增加產(chǎn)物的特異性，有待改進(jìn)，同時(shí)通過優(yōu)化條件可以明顯增加產(chǎn)物的特異性，為實(shí)驗(yàn)研究中為實(shí)驗(yàn)研究中5RACE5RACE方法的選擇提供了依據(jù)。方法的選擇提供了依據(jù)。第14頁/共52頁第十四頁，共53頁。RACERACE的優(yōu)點(diǎn)的優(yōu)點(diǎn)(yudi(yudin)n)與篩庫法相比較，有許多方面的優(yōu)點(diǎn)：與篩庫法相比較，有許多方面的優(yōu)點(diǎn)：此方法是通過此方法是通過P

15、CRPCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)的，無須建立技術(shù)實(shí)現(xiàn)的，無須建立cDNAcDNA文庫，可以在很短的時(shí)間文庫，可以在很短的時(shí)間(shjin)(shjin)內(nèi)獲得內(nèi)獲得有利用價(jià)值的信息。有利用價(jià)值的信息。 節(jié)約了實(shí)驗(yàn)所花費(fèi)的經(jīng)費(fèi)和時(shí)間節(jié)約了實(shí)驗(yàn)所花費(fèi)的經(jīng)費(fèi)和時(shí)間(shjin)(shjin)。 只要引物設(shè)計(jì)正確，在初級(jí)產(chǎn)物的基礎(chǔ)上可以獲得大量的感興趣基因的全長(zhǎng)只要引物設(shè)計(jì)正確，在初級(jí)產(chǎn)物的基礎(chǔ)上可以獲得大量的感興趣基因的全長(zhǎng)第15頁/共52頁第十五頁，共53頁。實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有(xin y(xin yu)u)的的RACERACE試劑試劑盒的簡(jiǎn)介盒的簡(jiǎn)介 RACERACE是一種從一個(gè)相同的是一種從一個(gè)相同的cD

16、NAcDNA模板進(jìn)行模板進(jìn)行55和和33末端快速克隆的方法。末端快速克隆的方法。此方法會(huì)產(chǎn)生較少的錯(cuò)誤條帶。此過程中使用的酶混合物非常適合長(zhǎng)鏈此方法會(huì)產(chǎn)生較少的錯(cuò)誤條帶。此過程中使用的酶混合物非常適合長(zhǎng)鏈PCRPCR。使用此方法的要求是必須知道至少使用此方法的要求是必須知道至少23232828個(gè)核苷酸序列信息，以此來設(shè)計(jì)個(gè)核苷酸序列信息，以此來設(shè)計(jì)(shj)5(shj)5末端和末端和33末端末端RACERACE反應(yīng)的基因特異性引物（反應(yīng)的基因特異性引物（GSPsGSPs）。）。RACERACE引物的設(shè)計(jì)引物的設(shè)計(jì)(shj)(shj)：第16頁/共52頁第十六頁，共53頁?；蚧?jyn)(j

17、yn)特異性引物（特異性引物（GSPsGSPs）應(yīng)該是應(yīng)該是 232328nt 28nt 50507070GC GC TmTm值值6565度，度，TmTm值值7070度可以獲得好的結(jié)果度可以獲得好的結(jié)果 需要實(shí)驗(yàn)者根據(jù)已有的基因序列設(shè)計(jì)需要實(shí)驗(yàn)者根據(jù)已有的基因序列設(shè)計(jì)55和和3RACE3RACE反應(yīng)的基因特異性引物（反應(yīng)的基因特異性引物（GSP1GSP1和和 GSP2).GSP2).由于兩個(gè)由于兩個(gè)(lin )(lin )引物的存在，引物的存在，PCRPCR的產(chǎn)物是特異性的。的產(chǎn)物是特異性的。 第17頁/共52頁第十七頁，共53頁。反應(yīng)中涉及反應(yīng)中涉及(shj)(shj)到的一些事到的一些事項(xiàng)

18、項(xiàng)cDNAcDNA的合成起始于的合成起始于polyA+RNApolyA+RNA。如果使用其。如果使用其 它的基因組它的基因組DNADNA或總或總RNARNA，背景會(huì)很高。，背景會(huì)很高。 RACE PCRRACE PCR的效率還取決于總的的效率還取決于總的mRNAmRNA中目的中目的(md) (md) mRNA mRNA的量和不同的引物有不同的退火和延的量和不同的引物有不同的退火和延 伸溫度。伸溫度。 第18頁/共52頁第十八頁，共53頁。反應(yīng)中涉及反應(yīng)中涉及(shj)(shj)到的一些事到的一些事項(xiàng)項(xiàng)在進(jìn)行在進(jìn)行55和和3RACE PCR3RACE PCR的時(shí)候應(yīng)該使用熱的時(shí)候應(yīng)該使用熱 啟動(dòng)

19、。啟動(dòng)。 表表4 4中給出了所有引物的相互關(guān)系中給出了所有引物的相互關(guān)系(gun x)(gun x)。重疊引。重疊引 物的設(shè)計(jì)會(huì)對(duì)全長(zhǎng)的產(chǎn)生有幫助。另外，重物的設(shè)計(jì)會(huì)對(duì)全長(zhǎng)的產(chǎn)生有幫助。另外，重 疊的引物可以為疊的引物可以為PCRPCR反應(yīng)提供一個(gè)對(duì)照。并反應(yīng)提供一個(gè)對(duì)照。并 不是絕對(duì)的要利用設(shè)計(jì)的引物產(chǎn)生重疊片段。不是絕對(duì)的要利用設(shè)計(jì)的引物產(chǎn)生重疊片段。 第19頁/共52頁第十九頁，共53頁。反應(yīng)中涉及到的一些反應(yīng)中涉及到的一些(yxi)(yxi)事項(xiàng)事項(xiàng)引物引物GSPGSP中的中的GCGC含量要在含量要在50507070之間。這之間。這 樣可以使用降落樣可以使用降落PCRPCR。避免使用自

20、身互補(bǔ)。避免使用自身互補(bǔ)性性 的引物序列，否則會(huì)產(chǎn)生回折和形成分子的引物序列，否則會(huì)產(chǎn)生回折和形成分子內(nèi)內(nèi) 氫鍵。另外，避免使用與氫鍵。另外，避免使用與AP1AP1互補(bǔ)的引物，互補(bǔ)的引物， 尤其尤其(yuq)(yuq)是在是在33末端。末端。 如果要用重疊片段來檢測(cè)設(shè)計(jì)的引物，如果要用重疊片段來檢測(cè)設(shè)計(jì)的引物，GSp1GSp1和和 GSp2 GSp2之間至少是之間至少是100100200200堿基。只有這樣堿基。只有這樣才可才可 以用擴(kuò)增的產(chǎn)物來鑒定設(shè)計(jì)的引物是否正以用擴(kuò)增的產(chǎn)物來鑒定設(shè)計(jì)的引物是否正確。確。第20頁/共52頁第二十頁，共53頁。反應(yīng)中涉及到的一些反應(yīng)中涉及到的一些(yxi)(

21、yxi)事項(xiàng)事項(xiàng)降落降落PCRPCR可以明顯的增加可以明顯的增加RACE PCRRACE PCR產(chǎn)物的特異性。在最開始產(chǎn)物的特異性。在最開始(kish)(kish)的循環(huán)中，退的循環(huán)中，退火溫度高于火溫度高于AP1AP1引物的引物的TmTm值，可以增加對(duì)特異性條帶的擴(kuò)增。隨后的退火和延伸的值，可以增加對(duì)特異性條帶的擴(kuò)增。隨后的退火和延伸的溫度降回到溫度降回到AP1AP1的溫度，可以進(jìn)行隨后的的溫度，可以進(jìn)行隨后的PCRPCR循環(huán)。循環(huán)。 第21頁/共52頁第二十一頁，共53頁。驗(yàn)證基因驗(yàn)證基因(jyn)(jyn)特異性引物的對(duì)特異性引物的對(duì)照照 單個(gè)引物的陰性對(duì)照：只用一個(gè)引物單個(gè)引物的陰性對(duì)

22、照：只用一個(gè)引物GSPGSP來進(jìn)行陰性對(duì)照。這樣不應(yīng)該來進(jìn)行陰性對(duì)照。這樣不應(yīng)該(ynggi)(ynggi)產(chǎn)生任何的條帶。如果可以看到明顯的產(chǎn)物，應(yīng)該產(chǎn)生任何的條帶。如果可以看到明顯的產(chǎn)物，應(yīng)該(ynggi)(ynggi)改變循環(huán)的參數(shù)，改變循環(huán)的參數(shù)，或重新設(shè)計(jì)原始引物?；蛑匦略O(shè)計(jì)原始引物。 第22頁/共52頁第二十二頁，共53頁。驗(yàn)證基因驗(yàn)證基因(jyn)(jyn)特異性引物的對(duì)特異性引物的對(duì)照照 利用兩個(gè)利用兩個(gè)GSPSGSPS進(jìn)行陽性對(duì)照：（只有兩個(gè)進(jìn)行陽性對(duì)照：（只有兩個(gè)GSPGSP可以產(chǎn)生重疊的時(shí)候才可以采用此可以產(chǎn)生重疊的時(shí)候才可以采用此步。）為了確定步。）為了確定RNARNA

23、樣品中目的基因確實(shí)表達(dá)，利用兩個(gè)樣品中目的基因確實(shí)表達(dá)，利用兩個(gè)GSPGSP和接頭連接和接頭連接(linji)(linji)的的cDNAcDNA來產(chǎn)生陽性對(duì)照。可以產(chǎn)生兩個(gè)引物之間的重疊大小的片段。如果沒有這個(gè)來產(chǎn)生陽性對(duì)照?？梢援a(chǎn)生兩個(gè)引物之間的重疊大小的片段。如果沒有這個(gè)片段，應(yīng)該重復(fù)片段，應(yīng)該重復(fù)cDNAcDNA的合成，或者從一個(gè)不同的組織或細(xì)胞來源進(jìn)行的合成，或者從一個(gè)不同的組織或細(xì)胞來源進(jìn)行cDNAcDNA的合成。的合成。 第23頁/共52頁第二十三頁，共53頁。制備制備(zhbi)(zhbi)和抽提和抽提 polyA+RNA polyA+RNA 不要使用不要使用DEPCDEPC處理

24、過的水。處理過的水。 純化完純化完mRNAmRNA之后，利用瓊脂糖凝膠電泳之后，利用瓊脂糖凝膠電泳 檢測(cè)檢測(cè)mRNAmRNA的質(zhì)量。哺乳動(dòng)物的的質(zhì)量。哺乳動(dòng)物的mRNAmRNA樣品樣品(yngpn) (yngpn) 是是12kb12kb的拖帶，在其中有和的的拖帶，在其中有和的 rRNA rRNA的條帶。非哺乳動(dòng)物的的條帶。非哺乳動(dòng)物的mRNAmRNA應(yīng)略小應(yīng)略小 第24頁/共52頁第二十四頁，共53頁。具體的實(shí)驗(yàn)具體的實(shí)驗(yàn)(shyn)(shyn)步驟步驟 cDNAcDNA第一條鏈的合成：第一條鏈的合成： 我們建議進(jìn)行我們建議進(jìn)行cDNAcDNA合成的對(duì)照反應(yīng)，這樣可以對(duì)樣品的合成的對(duì)照反應(yīng)，這

25、樣可以對(duì)樣品的cDNAcDNA的合成進(jìn)行鑒定。加的合成進(jìn)行鑒定。加入入(jir)(jir)各種試劑之后，在水浴中各種試劑之后，在水浴中4242度保溫一個(gè)小時(shí)。度保溫一個(gè)小時(shí)。 第25頁/共52頁第二十五頁，共53頁。具體具體(jt(jt) )的實(shí)驗(yàn)步驟的實(shí)驗(yàn)步驟 注意注意(zh y)(zh y)：在水浴或酒精浴中保溫會(huì)減少反應(yīng)體積，從而降低第一鏈的合成效：在水浴或酒精浴中保溫會(huì)減少反應(yīng)體積，從而降低第一鏈的合成效率。率。 將管放于冰上，以終止第一鏈的合成反應(yīng)。將管放于冰上，以終止第一鏈的合成反應(yīng)。 直接進(jìn)行第二鏈的合成。直接進(jìn)行第二鏈的合成。 第26頁/共52頁第二十六頁，共53頁。cDNAc

26、DNA第二第二(d r)(d r)鏈的合成鏈的合成 第二鏈合成的酶混合物中，含有聚合酶、第二鏈合成的酶混合物中，含有聚合酶、RNaseHRNaseH和連接酶。和連接酶。T4 DNAT4 DNA聚合酶的功能是補(bǔ)聚合酶的功能是補(bǔ)平平dscDNAdscDNA的末端。我們建議做陽性對(duì)照，試劑盒中提供人類骨骼肌的的末端。我們建議做陽性對(duì)照，試劑盒中提供人類骨骼肌的mRNAmRNA。 建議進(jìn)行陽性對(duì)照建議進(jìn)行陽性對(duì)照,cDNA,cDNA的質(zhì)量取決于制備的的質(zhì)量取決于制備的polyA+RNApolyA+RNA的質(zhì)量。非哺乳動(dòng)物樣品的的質(zhì)量。非哺乳動(dòng)物樣品的mRNAmRNA大約大約(dyu)(dyu)在在3k

27、b3kb之間。之間。 通過電泳檢測(cè)通過電泳檢測(cè)cDNAcDNA的產(chǎn)量，與對(duì)照進(jìn)行對(duì)比，的產(chǎn)量，與對(duì)照進(jìn)行對(duì)比，第27頁/共52頁第二十七頁，共53頁。cDNAcDNA第二第二(d r)(d r)鏈的合成鏈的合成這樣可以有利于在以后的步驟這樣可以有利于在以后的步驟(bzhu)(bzhu)中對(duì)中對(duì)cDNAcDNA進(jìn)行稀釋。進(jìn)行稀釋。 接頭的連接及連接產(chǎn)物的稀釋接頭的連接及連接產(chǎn)物的稀釋 按照程序進(jìn)行連接反應(yīng)。按照程序進(jìn)行連接反應(yīng)。 如果沒有對(duì)比樣品和對(duì)照的產(chǎn)量，利用如果沒有對(duì)比樣品和對(duì)照的產(chǎn)量，利用TricineTricineEDTA bufferEDTA buffer制備接頭連接的制備接頭連接的

28、dscDNAdscDNA的的1/501/50和和1/2501/250的稀釋物，用兩種稀釋物進(jìn)行以下的的稀釋物，用兩種稀釋物進(jìn)行以下的RACE PCRRACE PCR反應(yīng)，直到鑒定出哪一種稀反應(yīng)，直到鑒定出哪一種稀釋可以得到好的效果。釋可以得到好的效果。 第28頁/共52頁第二十八頁，共53頁。RACERACE技術(shù)技術(shù)(jsh) - PCR(jsh) - PCR擴(kuò)增擴(kuò)增第29頁/共52頁第二十九頁，共53頁。RACERACE技術(shù)技術(shù)(jsh) - PCR(jsh) - PCR擴(kuò)增擴(kuò)增 我們建議我們建議(jiny)(jiny)使用降落使用降落PCRPCR反應(yīng)，這就要求反應(yīng)，這就要求GSPGSP的的

29、TmTm值值7070度。度。 當(dāng)循環(huán)結(jié)束時(shí)，利用當(dāng)循環(huán)結(jié)束時(shí)，利用1.2%1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析每一個(gè)管中的產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析每一個(gè)管中的產(chǎn)物5l5l，使用適當(dāng)?shù)姆肿?，使用適當(dāng)?shù)姆肿恿苛縨arkermarker。 第30頁/共52頁第三十頁，共53頁。RACERACE技術(shù)技術(shù)(jsh) - PCR(jsh) - PCR擴(kuò)增擴(kuò)增 可以根據(jù)你的基因可以根據(jù)你的基因(jyn)(jyn)的特異性來設(shè)計(jì)最理想的循環(huán)參數(shù)。如果看不到帶或者只有微的特異性來設(shè)計(jì)最理想的循環(huán)參數(shù)。如果看不到帶或者只有微弱的帶，在弱的帶，在6868度多加度多加5 5個(gè)循環(huán)。最佳的延伸時(shí)間取決于擴(kuò)增條帶的長(zhǎng)度。如果片斷的長(zhǎng)

30、個(gè)循環(huán)。最佳的延伸時(shí)間取決于擴(kuò)增條帶的長(zhǎng)度。如果片斷的長(zhǎng)度在度在2 25kb5kb的時(shí)候，經(jīng)常使用的時(shí)候，經(jīng)常使用4min4min，的時(shí)候?qū)⒀由鞎r(shí)間減到，的時(shí)候?qū)⒀由鞎r(shí)間減到2 23min3min，對(duì)于，對(duì)于5 510kb10kb的的條帶，延伸時(shí)間增加到條帶，延伸時(shí)間增加到10min10min。 第31頁/共52頁第三十一頁，共53頁。RACERACE產(chǎn)物產(chǎn)物(ch(chnw)nw)的驗(yàn)證的驗(yàn)證 應(yīng)該對(duì)應(yīng)該對(duì)RACERACE的片段進(jìn)行驗(yàn)證的片段進(jìn)行驗(yàn)證, ,以此來確定是否已經(jīng)擴(kuò)增了理想的產(chǎn)物。如果得以此來確定是否已經(jīng)擴(kuò)增了理想的產(chǎn)物。如果得到的是多條帶或者研究的是多基因家族的成員到的是多條帶或

31、者研究的是多基因家族的成員(chngyun)(chngyun)，驗(yàn)證是非常有用的。，驗(yàn)證是非常有用的。 第32頁/共52頁第三十二頁，共53頁。有有3 3種驗(yàn)證種驗(yàn)證RACERACE產(chǎn)物產(chǎn)物(ch(chnw)nw)的方法的方法 比較比較(bjio)(bjio)由由GSPGSP和和NGSPNGSP獲得獲得RACERACE產(chǎn)物。產(chǎn)物。 Southern blot Southern blot 克隆并測(cè)序克隆并測(cè)序 第33頁/共52頁第三十三頁，共53頁。有有3 3種驗(yàn)證種驗(yàn)證(ynzhng)RACE(ynzhng)RACE產(chǎn)物產(chǎn)物的方法的方法 我們建議我們建議(jiny)(jiny)最好測(cè)得最好測(cè)得

32、RACERACE產(chǎn)物的部分序列。有的時(shí)候需要嵌套引產(chǎn)物的部分序列。有的時(shí)候需要嵌套引物物 的存在。的存在。 比較由比較由GSPGSP和和NGSPNGSP獲得獲得RACERACE產(chǎn)物：產(chǎn)物： 對(duì)于對(duì)于55末端的末端的RACERACE產(chǎn)物，比較由產(chǎn)物，比較由AP1AP1和和GSP1GSP1擴(kuò)增出來的產(chǎn)物和由擴(kuò)增出來的產(chǎn)物和由AP1AP1和和NGSP1NGSP1擴(kuò)增出來的產(chǎn)物。擴(kuò)增出來的產(chǎn)物。 第34頁/共52頁第三十四頁，共53頁。有有3 3種驗(yàn)證種驗(yàn)證(ynzhng)RACE(ynzhng)RACE產(chǎn)產(chǎn)物的方法物的方法 對(duì)于對(duì)于33末端的末端的RACERACE產(chǎn)物，比較由產(chǎn)物，比較由AP1AP1

33、和和GSP2GSP2擴(kuò)增出來的產(chǎn)物和由擴(kuò)增出來的產(chǎn)物和由AP1AP1和和NGSP2NGSP2擴(kuò)增出來的產(chǎn)物。這對(duì)于鑒定多條帶是否是上一個(gè)擴(kuò)增出來的產(chǎn)物。這對(duì)于鑒定多條帶是否是上一個(gè)PCRPCR的特異性產(chǎn)物是的特異性產(chǎn)物是非常有用的。非常有用的。 如果條帶是正確的，在嵌套如果條帶是正確的，在嵌套PCRPCR反應(yīng)反應(yīng)(fnyng)(fnyng)中的條帶應(yīng)該是略微小一些?；械臈l帶應(yīng)該是略微小一些?；颈綪CRPCR和嵌套和嵌套PCRPCR產(chǎn)物的遷移率的不同取決于結(jié)構(gòu)中產(chǎn)物的遷移率的不同取決于結(jié)構(gòu)中GSP1GSP1和嵌套引物和嵌套引物的位置。的位置。 第35頁/共52頁第三十五頁，共53頁。RACE

34、RACE技術(shù)技術(shù)(jsh) - (jsh) - 克隆和測(cè)序克隆和測(cè)序1. 1.對(duì)于可以利用膠回收試劑盒來回收對(duì)于可以利用膠回收試劑盒來回收RACERACE產(chǎn)物，此產(chǎn)物，此試劑盒適合回收以下的試劑盒適合回收以下的RACERACE產(chǎn)物；片段，可以通過產(chǎn)物；片段，可以通過電洗脫獲得好的結(jié)果。如果電洗脫獲得好的結(jié)果。如果(rgu)(rgu)你選擇使用其他你選擇使用其他的純化方法，最后用的純化方法，最后用TricineTricineEDTAbuffer30lEDTAbuffer30l重新重新懸浮懸浮DNADNA樣品。樣品。2 .2 .電泳電泳5l5l回收的樣品來鑒定回收的質(zhì)量?；厥盏臉悠穪龛b定回收的質(zhì)量

35、。3 .3 .將回收的將回收的PCRPCR產(chǎn)物直接克隆到產(chǎn)物直接克隆到/A/A型的型的PCRPCR克隆載體克隆載體中。另外還可以利用接頭和中。另外還可以利用接頭和/ /或或cDNAcDNA合成引物中的合成引物中的Not1Not1、Srf1Srf1、Xma1Xma1、ECOR1ECOR1等酶切位點(diǎn)，將產(chǎn)物克等酶切位點(diǎn)，將產(chǎn)物克隆到常規(guī)載體中。隆到常規(guī)載體中。第36頁/共52頁第三十六頁，共53頁。RACERACE技術(shù)技術(shù)(jsh) - (jsh) - 克隆和測(cè)序克隆和測(cè)序3 .3 .將回收的將回收的PCRPCR產(chǎn)物直接克隆到產(chǎn)物直接克隆到/A/A型的型的PCRPCR克隆載體中。另外還可以利用接頭

36、和克隆載體中。另外還可以利用接頭和/ /或或cDNAcDNA合成引物中的合成引物中的Not1Not1、Srf1Srf1、Xma1Xma1、ECOR1ECOR1等酶切位點(diǎn)，將產(chǎn)物克隆到常規(guī)載等酶切位點(diǎn)，將產(chǎn)物克隆到常規(guī)載體中。體中。4 .4 .對(duì)于對(duì)于55端的端的RACERACE產(chǎn)物，我們產(chǎn)物，我們(w men)(w men)建議挑取至少建議挑取至少8 81010個(gè)不同的克隆以獲得個(gè)不同的克隆以獲得55端的最大可能性的序列。（反轉(zhuǎn)錄并不總是進(jìn)行到端的最大可能性的序列。（反轉(zhuǎn)錄并不總是進(jìn)行到mRNAmRNA模板的模板的55末端，尤其是末端，尤其是長(zhǎng)模板。另外，長(zhǎng)模板。另外，T4DNAT4DNA聚合

37、酶會(huì)移走聚合酶會(huì)移走55末端的末端的0 02020個(gè)堿基。）個(gè)堿基。）第37頁/共52頁第三十七頁，共53頁。RACERACE技術(shù)技術(shù)(jsh) - (jsh) - 克隆和測(cè)序克隆和測(cè)序5 .5 .一旦鑒定了含有插入片斷一旦鑒定了含有插入片斷(pindun)(pindun)的克隆，應(yīng)該獲得多的序列信息。理想的是，可的克隆，應(yīng)該獲得多的序列信息。理想的是，可以對(duì)整個(gè)開放讀碼框進(jìn)行測(cè)序。包括以對(duì)整個(gè)開放讀碼框進(jìn)行測(cè)序。包括55和和33的非翻譯區(qū)。的非翻譯區(qū)。第38頁/共52頁第三十八頁，共53頁。RACERACE技術(shù)技術(shù)(jsh) - cDNA(jsh) - cDNA的獲得的獲得通過部分或全部測(cè)序

38、鑒定通過部分或全部測(cè)序鑒定(jindng)(jindng)了了RACERACE產(chǎn)物后，可以通過兩種選產(chǎn)物后，可以通過兩種選擇獲得全長(zhǎng)的擇獲得全長(zhǎng)的cDNAcDNA。通過。通過PCRPCR和和克隆的方法?？寺〉姆椒?。 第39頁/共52頁第三十九頁，共53頁。通過通過(tnggu)PCR(tnggu)PCR的方法獲得的方法獲得全長(zhǎng)全長(zhǎng)cDNA cDNA 1. 1.擴(kuò)增長(zhǎng)的擴(kuò)增長(zhǎng)的cDNAcDNA需要較長(zhǎng)的延伸需要較長(zhǎng)的延伸(ynshn)(ynshn)時(shí)間，但是如果延伸時(shí)間，但是如果延伸(ynshn)(ynshn)的時(shí)間過長(zhǎng)，可的時(shí)間過長(zhǎng)，可以產(chǎn)生拖帶，所以要慎重的設(shè)計(jì)引物。以產(chǎn)生拖帶，所以要慎重的

39、設(shè)計(jì)引物。2 .2 .根據(jù)從根據(jù)從55和和3RACE3RACE產(chǎn)物獲得序列信息設(shè)計(jì)產(chǎn)物獲得序列信息設(shè)計(jì)55和和3GSP3GSP引物。這些引物應(yīng)該來自引物。這些引物應(yīng)該來自cDNAcDNA的的33或者或者55的末端，應(yīng)該是的末端，應(yīng)該是232328nt28nt長(zhǎng)。不應(yīng)該在引物的末端加上限制性位點(diǎn)，長(zhǎng)。不應(yīng)該在引物的末端加上限制性位點(diǎn)，這樣會(huì)導(dǎo)致高背景。在某些時(shí)候可以設(shè)計(jì)這樣會(huì)導(dǎo)致高背景。在某些時(shí)候可以設(shè)計(jì)33和和55的嵌套引物。但是還是應(yīng)該先利用一的嵌套引物。但是還是應(yīng)該先利用一對(duì)引物進(jìn)行對(duì)引物進(jìn)行PCRPCR反應(yīng)。反應(yīng)。 第40頁/共52頁第四十頁，共53頁。通過通過(tnggu)PCR(tn

40、ggu)PCR的方法獲得的方法獲得全長(zhǎng)全長(zhǎng)cDNAcDNA3 .3 .進(jìn)行如下進(jìn)行如下(rxi)(rxi)的熱循環(huán)：的熱循環(huán)：9494度度3030秒秒2525個(gè)循環(huán)：個(gè)循環(huán)： （1 1）9494度度5 5秒秒（2 2）7272度度2 21515分鐘分鐘第41頁/共52頁第四十一頁，共53頁。通過通過(tnggu)PCR(tnggu)PCR的方法獲得的方法獲得全長(zhǎng)全長(zhǎng)cDNA cDNA 1. 1.擴(kuò)增長(zhǎng)的擴(kuò)增長(zhǎng)的cDNAcDNA需要較長(zhǎng)的延伸時(shí)間，但是如果延需要較長(zhǎng)的延伸時(shí)間，但是如果延伸的時(shí)間過長(zhǎng)，可以產(chǎn)生拖帶，所以要慎重的設(shè)計(jì)伸的時(shí)間過長(zhǎng)，可以產(chǎn)生拖帶，所以要慎重的設(shè)計(jì)引物。引物。2 .2

41、.根據(jù)從根據(jù)從55和和3RACE3RACE產(chǎn)物獲得序列信息設(shè)計(jì)產(chǎn)物獲得序列信息設(shè)計(jì)55和和3GSP3GSP引物。這些引物應(yīng)該來自引物。這些引物應(yīng)該來自cDNAcDNA的的33或者或者55的末端，應(yīng)該是的末端，應(yīng)該是232328nt28nt長(zhǎng)。不應(yīng)該在引物的末長(zhǎng)。不應(yīng)該在引物的末端加上限制性位點(diǎn)，這樣會(huì)導(dǎo)致高背景。在某些端加上限制性位點(diǎn)，這樣會(huì)導(dǎo)致高背景。在某些(mu xi)(mu xi)時(shí)候可以設(shè)計(jì)時(shí)候可以設(shè)計(jì)33和和55的嵌套引物。但是的嵌套引物。但是還是應(yīng)該先利用一對(duì)引物進(jìn)行還是應(yīng)該先利用一對(duì)引物進(jìn)行PCRPCR反應(yīng)。反應(yīng)。 第42頁/共52頁第四十二頁，共53頁。通過通過(tnggu)P

42、CR(tnggu)PCR的方法獲得全的方法獲得全長(zhǎng)長(zhǎng)cDNAcDNA4 .4 .延伸的時(shí)間應(yīng)該等于預(yù)期的延伸的時(shí)間應(yīng)該等于預(yù)期的cDNAcDNA長(zhǎng)度加上長(zhǎng)度加上2 2分鐘。例如：預(yù)期得到分鐘。例如：預(yù)期得到6kb6kb的條帶，用的條帶，用6 62 28 8分鐘的延伸時(shí)間。注意：如果分鐘的延伸時(shí)間。注意：如果(rgu)(rgu)沒有條帶或者條帶弱，增加沒有條帶或者條帶弱，增加5 5個(gè)循環(huán)；或者優(yōu)化個(gè)循環(huán)；或者優(yōu)化PCRPCR的條件。的條件。5 .5 .在在1.2%1.2%的瓊脂糖凝膠上分析的瓊脂糖凝膠上分析5l5l的樣品。通常情況下，可以見到一條單一帶，如果的樣品。通常情況下，可以見到一條單一帶

43、，如果(rgu)(rgu)這樣，利用膠來純化全長(zhǎng)的這樣，利用膠來純化全長(zhǎng)的cDNAcDNA第43頁/共52頁第四十三頁，共53頁。通過通過PCRPCR的方法的方法(fngf(fngf) )獲得全獲得全長(zhǎng)長(zhǎng)cDNAcDNA6 .6 .制備制備1.2%1.2%的的TAEbufferTAEbuffer制備瓊脂糖凝膠。不使用制備瓊脂糖凝膠。不使用TBEbufferTBEbuffer，TBETBE的膠很難制備全長(zhǎng)的膠很難制備全長(zhǎng)的的cDNAcDNA。7 .7 .將剩下的將剩下的45l45l反應(yīng)物點(diǎn)樣，選用適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)物點(diǎn)樣，選用適當(dāng)?shù)膍arkermarker。8 .8 .利用長(zhǎng)波利用長(zhǎng)波(chngb)(c

44、hngb)紫外觀察紫外觀察cDNAcDNA（300nm300nm）切下全長(zhǎng)的）切下全長(zhǎng)的cDNAcDNA。注意：應(yīng)該盡量。注意：應(yīng)該盡量減少紫外對(duì)減少紫外對(duì)cDNAcDNA的照射。的照射。第44頁/共52頁第四十四頁，共53頁。通過通過PCRPCR的方法的方法(fngf(fngf) )獲得全獲得全長(zhǎng)長(zhǎng)cDNAcDNA9 .9 .利用膠回收試劑盒回收利用膠回收試劑盒回收cDNAcDNA。此試劑盒適合回收以下的。此試劑盒適合回收以下的RACERACE產(chǎn)物；對(duì)于長(zhǎng)的片段，產(chǎn)物；對(duì)于長(zhǎng)的片段，可以通過可以通過(tnggu)(tnggu)電洗脫獲得好的結(jié)果。如果你選擇使用其他的純化方法，最后用電洗脫獲得

45、好的結(jié)果。如果你選擇使用其他的純化方法，最后用TricineTricineEDTAbuffer30lEDTAbuffer30l重新懸浮重新懸浮DNADNA樣品。樣品。10 .10 .將全長(zhǎng)的將全長(zhǎng)的cDNAcDNA克隆到克隆到T/AT/A型的型的PCRPCR克隆載體中?？寺≥d體中。 第45頁/共52頁第四十五頁，共53頁。通過通過(tnggu)(tnggu)克隆產(chǎn)生全長(zhǎng)的克隆產(chǎn)生全長(zhǎng)的cDNAcDNA：1. 1.如果你已經(jīng)獲得了含有重疊部分的如果你已經(jīng)獲得了含有重疊部分的55和和3RACE3RACE產(chǎn)物產(chǎn)物(chnw)(chnw)，同時(shí)在，同時(shí)在cDNAcDNA的重疊的重疊部分含有一個(gè)酶切位點(diǎn)的話，通過克隆技術(shù)可以獲得全長(zhǎng)的部分含有一個(gè)酶切位點(diǎn)的話，通過克隆技術(shù)可以獲得全長(zhǎng)的cDNAcDNA。2. 2.利用酶切獲得的利用酶切獲得的33和和55擴(kuò)增產(chǎn)物擴(kuò)增產(chǎn)物(chnw)(chnw)，并且利用，并且利用T4DNAT4DNA連接酶將它們連接起來。連接酶將它們連接起來。利用接頭和利用接頭和cDNAcDNA合成引物中的內(nèi)切酶將最終的全長(zhǎng)合成引物中的內(nèi)切酶將最終的全長(zhǎng)cDNAcDNA克隆到載體中。克隆到載體中。第46頁/共52頁第四十六頁，共53頁。通過通過(tnggu)(tnggu)克隆產(chǎn)生全長(zhǎng)的克隆產(chǎn)生