生物組織血液光譜特性的實(shí)驗(yàn)研究與分析（可編輯）

1、生物組織血液光譜特性的實(shí)驗(yàn)研究與分析 南京航空航天大學(xué) 碩士學(xué)位論文 生物組織血液光譜特性的實(shí)驗(yàn)研究與分析 姓名：辛玉軍 申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士 專業(yè)：物理電子學(xué) 指導(dǎo)教師：趙志敏 20070101 南京航空航天大學(xué)碩士學(xué)位論文 摘 要 近年來(lái)，隨著光譜技術(shù)的迅猛發(fā)展，光譜學(xué)已應(yīng)用于諸多領(lǐng)域，尤其是在生 命科學(xué)方面的應(yīng)用，促成了光生物學(xué)和光醫(yī)學(xué)等邊緣學(xué)科的發(fā)展，目前應(yīng)用廣泛 的是將光譜技術(shù)應(yīng)用于生物組織的疾病診斷上，利用生物組織的光譜特性來(lái)判斷 生物組織是否病變。 根據(jù)國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀，本文選取了典型的生物組織人體血液，對(duì)其光譜 特性進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究與分析，主要研究了血液的微弱熒光的圖像檢測(cè)、吸收光譜

2、 和熒光光譜，通過(guò)研究探索了光譜特性和血液生化指標(biāo)之間的關(guān)系，為醫(yī)學(xué)、醫(yī) 療提供新的診斷技術(shù)，該研究具有重要的學(xué)術(shù)意義和廣闊的應(yīng)用前景。本文的內(nèi) 容主要集中在以下幾個(gè)方面： （1）采用特定波長(zhǎng)的光照射血清和全血，采集血清和全血的微弱熒光圖像， 在一定頻譜范圍內(nèi)研究了血清和全血的熒光圖像與發(fā)射波長(zhǎng)的關(guān)系。 （2 ）在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，研究了正常血清和高血糖血清以及高血脂血清 的微弱熒光圖像特征，并自行編制軟件對(duì)圖像進(jìn)行了分析處理，為微弱熒光圖像 的檢測(cè)分析提供了新方法。 （3 ）在紫外可見(jiàn)光范圍內(nèi)對(duì)正常血清、高血糖血清以及高血脂血清的吸 收光譜進(jìn)行了研究，分析了正常血清和異常血清之間的光譜特征差

3、異。 （4 ）采用不同波段的光照射正常血清及高血糖血清，研究正常血清和異常 血清的熒光光譜，探索正常血清和異常血清的熒光光譜差別。 研究結(jié)果表明，光譜分析技術(shù)應(yīng)用于血液的某些疾病診斷具有方便、快速的 特點(diǎn)，本文為進(jìn)一步通過(guò)血液的分析進(jìn)行疾病的診斷提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 關(guān)鍵詞：血清，光譜，圖像處理，吸收光譜，熒光光譜 資助項(xiàng)目： 1南京航空航天大學(xué)十五學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目光生命科學(xué)，項(xiàng)目號(hào)xk0802 2 南京航空航天大學(xué)科研創(chuàng)新基金，項(xiàng)目號(hào)1008-905704 i 生物組織血液光譜特性的實(shí)驗(yàn)研究與分析 ABSTRACT In recent years, with the rapid developmen

4、t of spectrum technology, spectroscopy has been applied to many fields, especially to life sciences. This application promotes the development of interdisciplinary subjects such as optics-biology and optics-medicine. At present, the technology of spectrum is widely used in diagnosing diseases of bio

5、logical tissue. Spectral characteristic of biological tissue is used to judge whether the tissue is pathological or not. Based on the present research home and abroad, the characteristic of absorption spectrum, fluorescence spectrum and faint fluorescence image detecting of blood is studied experime

6、ntally and analyzed in this paper. New medical diagnostic techniques are offered, and the research has a prospect with very practical applications. This paper mainly focuses on the following areas. 1 Serum and whole blood are illuminated using light of different wave bands, the faint fluorescence im

7、ages of serum and whole blood are detected and the relationship between excitation fluorescence and the wavelength of excitation light source of serum and whole blood is studied in certain frequency range. 2 The faint fluorescence images of normal serum and abnormal serum are researched under the sa

8、me experimental conditions and are analyzed utilizing image processing software self-programming. 3 The absorption spectra of normal serum, hyperglycaemia serum and hyperlipidemia serum in UV-visible range are studied and the spectrum differences between normal serum and abnormal serum are analyzed.

9、 4 The fluorescence spectra of normal serum and abnormal serum are measured, and the spectrum differences between normal serum and abnormal serum are discussed. The results of the research indicate that it is convenient and efficient to diagnose certain diseases of blood using spectral analysis tech

10、nology, and all of these provide experimental foundation for diagnosis of diseases through blood analysis. Key Words: serum, spectrum, image processing, absorption spectrum, fluorescence spectrum ii 南京航空航天大學(xué)碩士學(xué)位論文 圖、表目錄清單 1圖目錄清單 圖2.1 光的透射示意圖.7 圖3.1 二能級(jí)系統(tǒng)的激發(fā)熒光原理圖.15 圖3.2 血液的激發(fā)熒光模型.17 圖3.3 熒光強(qiáng)度測(cè)試系統(tǒng)框圖.

11、18 圖3.4 正常血清樣品（4.83 ，1.56）的熒光圖像.19 圖3.5 正常血清樣品（4.01 ，1.00）的熒光圖像.20 圖3.6 正常全血樣品的熒光圖像.20 圖3.7 三種氨基酸的熒光光譜.21 圖3.8 樣品血清在355nm 的熒光圖像.22 圖3.9 樣品血清在355nm 熒光圖像的灰度值.23 圖3.10 樣品血清在367nm 的熒光圖像.23 圖3.11 樣品血清在367nm 熒光圖像的灰度值.24 圖3.12 樣品血清在355nm 的熒光圖像.25 圖3.13 樣品血清在367nm 的熒光圖像.25 圖3.14 血清樣品4 號(hào)熒光圖像的灰度等高線.26 圖3.15 血

12、清熒光圖像的三維灰度等高線（VC+ ）.27 圖3.16 血清熒光圖像的三維灰度等高線和灰度平面等高線.28 圖3.17 平滑后血清熒光圖像的三維灰度等高線和灰度平面等高線.29 圖3.18 光照不均勻修正后樣品血清的熒光圖像.29 圖4.1 血清吸收光譜的測(cè)試光路示意圖.31 圖4.2 血清的吸收光譜.32 圖4.3 吸收光譜電子躍遷.33 圖4.4 正常血清4 號(hào)和高血糖血清5 號(hào)的吸收光譜.34 圖4.5 葡萄糖溶液的吸收光譜.35 圖4.6 正常血清和高血脂血清的吸收光譜.35 v 承諾書(shū) 本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下，獨(dú)立 進(jìn)行研究工作所取得的成果。盡我所知，除

13、文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容 外，本學(xué)位論文的研究成果不包含任何他人享有著作權(quán)的內(nèi)容。對(duì)本 論文所涉及的研究工作做出貢獻(xiàn)的其他個(gè)人和集體，均已在文中以明 確方式標(biāo)明。 本人授權(quán)南京航空航天大學(xué)可以有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件，允 許論文被查閱和借閱,可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù) 據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或其他復(fù)制手段保存論文。 作者簽名： 日 期： 南京航空航天大學(xué)碩士學(xué)位論文 第一章 概述 1.1 研究背景 隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，生命科學(xué)成為當(dāng)前科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域中發(fā)展十 1-2 分迅速、活躍的邊緣學(xué)科，是當(dāng)今世界科技發(fā)展的熱點(diǎn)之一 ，受到 各個(gè)國(guó)家的重視。21 世紀(jì)是生命科學(xué)和生物技術(shù)的

14、世紀(jì)，生命科學(xué)和 生物技術(shù)的持續(xù)創(chuàng)新和重大突破，是新世紀(jì)科學(xué)技術(shù)發(fā)展的重要標(biāo)志， 3 將對(duì)科技發(fā)展、社會(huì)進(jìn)步和經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)產(chǎn)生極其重要深遠(yuǎn)的影響 。正 因?yàn)槿绱耍瑖?guó)家自然科學(xué)基金委員會(huì)一直大力資助生命科學(xué)和生物技 術(shù)方面的項(xiàng)目，從 2001 年以來(lái)，生命科學(xué)部所獲得的資助面上項(xiàng)目的 項(xiàng)數(shù)和金額均在 30% 以上，是獲得資助最多的科學(xué)部。 近年來(lái)，隨著激光技術(shù)、光譜技術(shù)、顯微技術(shù)以及光纖技術(shù)的發(fā) 展，生命科學(xué)與光子學(xué)交叉發(fā)展，相互融合，逐漸形成了一個(gè)新的學(xué) 4-7 科分支生物醫(yī)學(xué)光子學(xué) ，成為國(guó)際光學(xué)界和生物學(xué)界廣泛關(guān)注 的熱點(diǎn)。 生物醫(yī)學(xué)光子學(xué)是研究光輻射與生物組織相互作用的科學(xué)，涉及 的范圍很廣

15、，包括正常的光生物過(guò)程、紫外和可見(jiàn)光對(duì)生物的刺激與 損傷過(guò)程、生物系統(tǒng)（包括人體組織）以光子形式釋放能量的過(guò)程以 及來(lái)自生物系統(tǒng)的光探測(cè)過(guò)程，包括這些光子所攜帶的有關(guān)生物系統(tǒng) 的結(jié)構(gòu)與功能信息，此外還包括利用光子技術(shù)對(duì)生物系統(tǒng)進(jìn)行加工與 改造等7-8 。光輻射與生物組織相互作用將引起生物組織內(nèi)的分子激 發(fā)，激發(fā)的分子由于比原來(lái)的分子有較高的能量而變得不穩(wěn)定，因此 必然會(huì)發(fā)生一系列的馳豫過(guò)程，將多余能量以不同方式釋放，分子本 身才能回到穩(wěn)定的基態(tài)，這個(gè)過(guò)程包含光的吸收、散射以及發(fā)射等， 研究生物組織對(duì)光的散射、吸收、熒光發(fā)射、激發(fā)能的轉(zhuǎn)移等有助于 對(duì)光與生物組織相互作用過(guò)程及其特性進(jìn)行深入的了解

16、，這也是研究 生物大分子結(jié)構(gòu)與特性的重要手段之一。 目前，國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)及成果主要集中在生物組織的光學(xué)描述 與光傳輸規(guī)律的研究9-12 、生物組織的光子學(xué)檢測(cè)技術(shù)和成像技術(shù) 13-15 、醫(yī)學(xué)圖像處理16-20 、激光與生物組織相互作用的基本原理及應(yīng) 用21-25 、生物組織的光譜特性26-30 以及激光醫(yī)學(xué)31-32 方面。 1 生物組織血液的光譜特性的實(shí)驗(yàn)研究與分析 近幾十年來(lái)，隨著生命科學(xué)越來(lái)越得到長(zhǎng)足的發(fā)展，將光譜分析 技術(shù)應(yīng)用于生物組織的診斷上，即是一種應(yīng)運(yùn)而生的具有良好應(yīng)用前 景的技術(shù)。光譜分析技術(shù)應(yīng)用于生物組織，是由于正常組織和異常組 織在光的作用下會(huì)產(chǎn)生不同的光譜。這些光譜是

17、不同組織和細(xì)胞，不 同的結(jié)構(gòu)，不同的生化和物化特性等生物組織本質(zhì)信息的真實(shí)反映， 根據(jù)正常組織與異常組織的光譜特性可以判斷被測(cè)組織是否病變，它 從分子生物的角度將微觀病變宏觀化，能夠直觀地早期地發(fā)現(xiàn)病變， 從而進(jìn)行早期治療。該方法是利用組織的光學(xué)特性來(lái)判別組織性質(zhì)， 以無(wú)損或微損的方式進(jìn)行組織診斷，實(shí)時(shí)地提供組織內(nèi)部信息，為臨 床提供方便可靠的生理參數(shù)指標(biāo)，因而具有較高的診斷可靠性和研究 33 價(jià)值，日益得到重視 。 1.2 光譜分析法在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用 光譜分析法是通過(guò)物質(zhì)對(duì)光的吸收和發(fā)射，來(lái)研究光與物質(zhì)相互 作用的一種方法。它是基于物質(zhì)與輻射能作用時(shí)，測(cè)量由物質(zhì)內(nèi)部發(fā) 生量子化的能級(jí)之間的

18、躍遷而產(chǎn)生的發(fā)射、吸收或散射輻射的波長(zhǎng)和 強(qiáng)度進(jìn)行分析的方法。 光譜分析法的主要優(yōu)點(diǎn)有：（1 ）不用做復(fù)雜的前期處理；（2 ）分 析時(shí)間短與操作步驟簡(jiǎn)單；（3 ）靈敏度高；（4 ）能檢測(cè)的對(duì)象范圍廣。 所以，光譜技術(shù)作為一種檢測(cè)方法，早在上個(gè)世紀(jì)中葉就得到廣泛應(yīng) 用；近年來(lái)，隨著分光器件、光電探測(cè)器和信號(hào)處理技術(shù)的發(fā)展，光 譜分析法更是得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用，為我們能夠較精確的分析和了 解物質(zhì)結(jié)構(gòu)、成分及其含量提供了行之有效的方法，從而能使其應(yīng)用 于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，成為研究生物分子、細(xì)胞、生命過(guò)程及醫(yī)療診斷和 檢測(cè)的重要手段。 近幾十年來(lái)，很多學(xué)者通過(guò)光譜診斷技術(shù)對(duì)生物組織進(jìn)行了研究， 包括體液3

19、4-36 （如血液、唾液、尿液、汗液等）、皮膚37-38 、指甲39 等人體組織以及植物（如綠豆）的胚芽和葉片等4041 的光譜特性，采 用的光譜方法也很多，并且取得了一定成果。 原子吸收光譜法作為分析化學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛的定量分析方法 之一，是測(cè)量物質(zhì)所產(chǎn)生的蒸氣中原子對(duì)電磁輻射的吸收強(qiáng)度的一種 2 南京航空航天大學(xué)碩士學(xué)位論文 分析方法，在臨床醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用研究很多，用來(lái)測(cè)量生物組織中的微 42 量元素。王芬等 利用不同的石墨管，以全血為基體測(cè)定了全血中的 鉛，李立等43采用石墨爐原子吸收法測(cè)定了人體指甲中的微量鎘，李 44 勇軍等 研究了微量元素和癌組織的關(guān)系，對(duì)消化系統(tǒng)癌組織中的 12

20、種微量元素的含量進(jìn)行了分析。 拉曼光譜可以無(wú)損傷的定性定量分析，所以目前利用拉曼光譜法 對(duì)生物組織的研究比較多，北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院的李維紅等 人45-46 率先在國(guó)內(nèi)利用傅立葉變換拉曼光譜研究了正常腮腺組織及腮 腺惡性腫瘤組織的傅立葉變化拉曼光譜，研究它們的光譜差異，他們 還用拉曼光譜和紅外光譜研究了胃癌和直腸癌組織等，也從光譜上發(fā) 現(xiàn)了癌組織和正常組織的一些差異。在用光譜對(duì)乳腺癌的研究方面， 也有很多學(xué)者做了不少研究47-48 。 正常組織和異常組織在一定波長(zhǎng)的激光激發(fā)下會(huì)發(fā)出不同的自體 熒光，這種熒光是生物組織更為本質(zhì)的反映，通過(guò)分析自體熒光光譜 的形態(tài)和強(qiáng)度可以區(qū)分不同的組織，達(dá)

21、到組織診斷的目的。目前比較 成熟的是腫瘤組織或癌組織的光譜診斷，如楊遠(yuǎn)龍49 等通過(guò)對(duì) 50 例腫 瘤離體樣品及近百名口腔部位癌癥患者用氮分子和氙離子激光器誘發(fā) 自體熒光，觀察到在口腔、食管、胃、肺、膀胱、乳腺等部位的癌組 織的熒光光譜中，除了肺癌以外，所測(cè)的惡性腫瘤除了同正常組織一 樣在 560nm 處有一主峰外，在 630nm 和 690nm 附近還有一特征峰，而 良性腫瘤或潰瘍的熒光光譜則和正常組織光譜一樣，無(wú)這兩個(gè)熒光峰， 利用這種特征峰，可以判別這些部位的惡性腫瘤。上海生化所連少輝50 等人于 1995 年用 N 2 激光器 337nm 激光（通過(guò)光纖傳輸）來(lái)激發(fā)宮頸 癌組織，獲得了

22、宮頸癌組織的熒光光譜。 國(guó)外的很多學(xué)者對(duì)生物組織的光譜特性進(jìn)行了研究，采用近紅外 光譜法測(cè)定血糖的濃度51-52 ，利用生物組織的熒光光譜等診斷組織是 否發(fā)生病變29-30 ，目前研究較為成熟的是癌組織和腫瘤組織的光譜特 征53-55 。 美國(guó)紐約大學(xué) R.Alfano 56 等人于 1990 年公布了一項(xiàng)用自體熒光診 斷乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌和子宮癌的專利，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織與良性腫 瘤或正常組織的熒光光譜有明顯的區(qū)別，為診斷婦科腫瘤提供了一種 新方法。R.Alfano 和其小組還首次用近紅外激發(fā)拉曼光譜的方法檢測(cè) 3 生物組織血液的光譜特性的實(shí)驗(yàn)研究與分析 正常的乳房組織和乳腺癌，也測(cè)量了正常的

23、及癌變的宮頸組織和卵巢 組織，發(fā)現(xiàn)正常的和癌變的組織拉曼光譜也有差別。 Tang 57 等人用連續(xù) Ar+ 激光研究了癌組織的激光誘導(dǎo)熒光光譜，他 們發(fā)現(xiàn)正常組織和癌組織熒光光譜的區(qū)別在于：在波長(zhǎng) 540nm 和 576nm 處光譜強(qiáng)度調(diào)制的有無(wú)和強(qiáng)弱，并認(rèn)為這是由于人體組織中含 血紅蛋白的多少造成的。 Gniadecka 58 認(rèn)為惡性腫瘤和正常組織的蛋白質(zhì)和脂肪的分子結(jié)構(gòu) 是不同的，對(duì)照選擇鄰近的皮膚，分別測(cè)定它們的傅立葉變換拉曼光 譜，發(fā)現(xiàn)病變組織的顯著損害可以通過(guò)傅立葉變換拉曼光譜譜帶的綜 合分析表現(xiàn)出來(lái)，而這些譜帶可以表明蛋白質(zhì)的形態(tài)和結(jié)構(gòu)的變化以 及脂質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的變化，認(rèn)為傅立葉變

24、換拉曼光譜對(duì)于皮膚病的診斷 是有價(jià)值的。 二十多年來(lái)，人們用不同的激發(fā)波長(zhǎng)，應(yīng)用光譜分析技術(shù)，對(duì)生 物體的激光誘發(fā)光譜進(jìn)行了大量的研究和觀察，初步發(fā)現(xiàn)了正常組織 與異常組織的不同光譜特征，并對(duì)光譜差別的來(lái)源作了一些探索。然 而，由于各研究工作使用的儀器不同，提供的特征參數(shù)不同，判據(jù)計(jì) 算也各有不同，致使諸多結(jié)果難以進(jìn)行比較，更缺乏統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn)； 尤其是對(duì)正常組織與異常組織光譜差異產(chǎn)生的機(jī)制，現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果 并沒(méi)有在這個(gè)方面給出令人滿意的關(guān)于病變組織分子水平上有明顯特 異性光譜來(lái)源的證據(jù)。要想使光譜技術(shù)真正應(yīng)用于臨床診斷，還需大 量的實(shí)驗(yàn)，為臨床診斷提供依據(jù)。 1.3 血液光譜的研究現(xiàn)狀 人的

25、疾病大都能在其某些生化指標(biāo)上得到反映，比如人的血液或 尿液。觀察病人的某些生化反映在疾病輔助診斷方面有一定的意義， 所以在臨床上一直倍受重視。 由于血液在人體中的地位非常重要，其狀態(tài)的變化直接反映了人 的生理狀態(tài)，研究血液生化指標(biāo)的方法有很多，近年來(lái)，光譜技術(shù)應(yīng) 用于血液診斷成為眾多學(xué)者研究的熱點(diǎn)。當(dāng)光照射到血液，會(huì)發(fā)生散 射、吸收和發(fā)射等現(xiàn)象，通過(guò)檢測(cè)和分析血液的散射光譜、吸收光譜 和發(fā)射光譜，分析這些譜線的結(jié)構(gòu)，能夠獲得一些反映血液狀態(tài)和內(nèi) 部物質(zhì)構(gòu)成的信息，以及光子與血液相互作用過(guò)程的有關(guān)信息。 血液是一種強(qiáng)散射介質(zhì)，當(dāng)光作用于血液時(shí)會(huì)發(fā)生散射現(xiàn)象，如 4 南京航空航天大學(xué)碩士學(xué)位論文

26、Rayleigh 散射、Tyndall 散射和 Raman 散射，其中 Rayleigh 散射、Tyndall 散射屬于彈性散射，散射光與入射光頻率相同59-60 ；Raman 散射是非 彈性散射，散射光的頻率相對(duì)入射光的頻率有位移。關(guān)于血液或血細(xì) 胞的散射特性61-63 ，國(guó)內(nèi)外研究得比較多，這方面的理論相對(duì)比較成 64 熟，根據(jù)血細(xì)胞的散射特性理論制成的血細(xì)胞計(jì)數(shù)器 也已成功用于 醫(yī)學(xué)。 血液的吸收光譜表示血液對(duì)于光的吸收隨波長(zhǎng)的變化情況，吸收 曲線上各峰值的位置和相對(duì)強(qiáng)度能夠反映血液中生物分子的部分能級(jí) 63 結(jié)構(gòu)，很多學(xué)者對(duì)血細(xì)胞 以及疾病對(duì)血液吸收光譜的影響進(jìn)行了研 究65-66 。

27、 血液的熒光光譜則可以部分地反映血液分子吸收光子能量以后發(fā) 生的能量轉(zhuǎn)移情況，由于其靈敏度更高，選擇性強(qiáng)，樣品用量少，能 提供較多的物理參數(shù)，因此，該方法在研究中被大多學(xué)者采用，其中 比較有實(shí)用價(jià)值的是利用含有癌細(xì)胞的血液或血清的熒光光譜特征來(lái) 診斷癌癥67-68 ，通過(guò)人體血液的熒光光譜來(lái)分析診斷人體疾病如鮮紅 69 斑痣 。 有關(guān)血液光譜特征研究方面，趙志敏、姚紅兵、王樂(lè)新等也做了 一些探索工作，并取得了一些研究成果70-72 。 1.4 本文的主要研究工作及創(chuàng)新點(diǎn) 隨著人們生活水平的提高，飲食條件得到了改善，使得高血糖、 高血脂及高膽固醇等疾病的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，而這些疾病會(huì)導(dǎo) 致糖

28、尿病、動(dòng)脈硬化等疾病的發(fā)生，極大地危害人們的健康。充分利 用生物組織攜帶的光譜信息，進(jìn)行疾病的有效分析和診斷，尤其是血 液的光譜分析技術(shù)是具有廣闊應(yīng)用前景的一項(xiàng)課題。 傳統(tǒng)的血液檢測(cè)技術(shù)由于操作復(fù)雜、周期長(zhǎng)，已經(jīng)越來(lái)越不能滿 足人們的需要。因此，發(fā)展一種新的血液檢測(cè)技術(shù)成為了一項(xiàng)迫切的 任務(wù)，引起了各相關(guān)領(lǐng)域的重視，并成為研究熱點(diǎn)。 根據(jù)國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀，本文開(kāi)展對(duì)生物組織人體血液的光譜 特性進(jìn)行研究，主要研究了正常血液和異常血液的微弱熒光圖像、吸 收光譜和熒光光譜，并采用自編制軟件對(duì)微弱熒光圖像進(jìn)行處理，分 析組織的吸收光譜和熒光光譜與組織的生化參數(shù)之間的聯(lián)系，為醫(yī)學(xué) 檢測(cè)提供新的方法。 5

29、生物組織血液的光譜特性的實(shí)驗(yàn)研究與分析 本文的工作主要有： （1 ）測(cè)定血清和全血的微弱熒光圖像，研究了在一定頻譜范圍內(nèi) 血清和全血的激發(fā)熒光與發(fā)射光波長(zhǎng)的關(guān)系；利用自行編制的軟件實(shí) 現(xiàn)了對(duì)正常血清和異常血清的微弱熒光圖像的分析處理。 （2 ）在紫外可見(jiàn)光范圍內(nèi)對(duì)正常血清、高血糖血清以及高血脂 血清的吸收光譜進(jìn)行研究，分析了正常血清和異常血清之間的光譜差 異。 （3 ）研究血清的熒光光譜，探索正常血清和異常血清的熒光光譜 特征及差別。 本文的特色與創(chuàng)新之處在于：（1 ）采用自行編制的軟件對(duì)微弱熒 光圖像進(jìn)行了分析，有效地解決了微弱熒光圖像處理分析的問(wèn)題，為 微弱熒光圖像分析提供了新方法。（2

30、）采用灰度值等高線的方法對(duì)微 弱熒光圖像進(jìn)行了處理，使微弱熒光圖像更加形象直觀，分析更為方 便。（3 ）探索了采用熒光光譜分析血糖異常血樣的光譜特征，為血糖 異常的血液分析提供了新的測(cè)量與分析方法。 本文研究得到了趙志敏教授主持的南京航空航天大學(xué)“十五”學(xué) 科建設(shè)項(xiàng)目光生命科學(xué)和科研創(chuàng)新基金的資助。 6 南京航空航天大學(xué)碩士學(xué)位論文 第二章 光譜分析技術(shù)的理論基礎(chǔ) 2.1 紫外可見(jiàn)光吸收光譜的基本理論 吸收光譜測(cè)量的是樣品對(duì)電磁波（光）的吸收的大小。當(dāng)入射光 與樣品分子相互作用并產(chǎn)生對(duì)入射光的吸收時(shí)，測(cè)量到的透射光的強(qiáng) 度與入射光強(qiáng)度之差即為樣品對(duì)入射光的吸收。紫外-可見(jiàn)光吸收光譜 是樣品對(duì)紫

31、外-可見(jiàn)光的吸收。紫外-可見(jiàn)光吸收光的能量對(duì)應(yīng)電子能級(jí) 之間的能量差，因此吸收紫外-可見(jiàn)光引起的是樣品分子電子能級(jí)之間 73 的躍遷，從這個(gè)意義上說(shuō)，紫外-可見(jiàn)光吸收光譜是一種電子光譜 。 光輻射如通過(guò)透明或半透明介質(zhì)，就是光的透射，如圖 2.1 。但光 在透射過(guò)程中常會(huì)有部分輻射被介質(zhì)吸收，這就稱為光的吸收，其本 質(zhì)是光量子與物質(zhì)分子發(fā)生碰撞時(shí)的能量轉(zhuǎn)移。假定光透過(guò)介質(zhì)的截 圖 2.1 光的透射示意圖 面為 S ，厚度為db 的物質(zhì)層，吸收的光強(qiáng)度為dI x ，入射光強(qiáng)度為I 0 ， 出射光強(qiáng)度為I ，則 ?dI kI （2-1 ） x x 這里I 是輻射在介質(zhì)截面 S 上的光強(qiáng)度，k 是光

32、量子在與物質(zhì)分子碰撞 x 時(shí)被俘獲的概率。由于每一個(gè)分子都有一個(gè)對(duì)光量子的俘獲截面，設(shè) 其為a ，則總俘獲面積（有效面積）為a ?N ，這里N 為截面 S 中的分子 數(shù)。因此 k 有效面積/ 總面積 a ?N / S N N c ?3 S db ? ?10 ? ? （2-2 ） A N A 是阿伏加德羅常數(shù)，c 是物質(zhì)的量濃度（單位為 mol/L ），S 是截面 積（單位為 cm2 ），db 是截面厚度（單位為 cm ）。所以 7 生物組織血液的光譜特性的實(shí)驗(yàn)研究與分析 ?3 ?dI kI a ?N ?c ?10 ?SI / S db a ?N ?cI / 1000 db x x A x A

33、x 兩邊取積分， I dI b aN ? x A c ?db I 0 0 I 1000 x 有 ln I 0 I aN A cb / 1000 （2-3 ） 兩邊取常用對(duì)數(shù)，得 lg I 0 I aN A cb / 2.303 ×1000 2.64 ×1020 acb （2-4 ） 如果定義lg I 0 I 為吸光度A ，2.64 ×1020 a 為摩爾吸收系數(shù) ，則有 A bc （2-5 ） 這就是光的吸收定律，又叫比爾（Beer ）定律，其中b 是吸光物質(zhì)的厚 度。 根據(jù)比爾（Beer ）定律，由于待測(cè)物的厚度b 是可以固定的，摩爾 吸收系數(shù)對(duì)于某一種物質(zhì)是一

34、個(gè)定值，所以只要測(cè)得吸光度A ，就可 以求得被測(cè)物質(zhì)的量。 一、 紫外-可見(jiàn)光吸收光譜具有的特點(diǎn) （1 ）靈敏度較高。一般可以測(cè)定的濃度下限為 10-6 mol ?L-1 ，適用于 微量、痕量分析。 （2 ）精密度和準(zhǔn)確度高。與其它儀器分析法相比，紫外- 可見(jiàn)光譜法 的相對(duì)誤差較小，一般為 2%-5% ，因而能滿足微量分析對(duì)準(zhǔn)確 度的要求。 （3 ）應(yīng)用范圍廣。不但能直接或間接定量測(cè)定幾乎所有的無(wú)機(jī)物質(zhì)和 許多有機(jī)物質(zhì)，還可以做官能團(tuán)鑒定、結(jié)構(gòu)分析、相對(duì)分子質(zhì)量 測(cè)定、配合物組成以及穩(wěn)定常數(shù)、酸堿離解常數(shù)的測(cè)定等。 （4 ）儀器操作簡(jiǎn)單、快速、價(jià)格較低，測(cè)定方法易于推廣。 二、 紫外-可見(jiàn)光吸

35、收光譜的應(yīng)用 紫外可見(jiàn)光吸收光譜法主要應(yīng)用在有機(jī)物定性分析、單組分定量 分析、混合物定量分析、平衡常數(shù)的測(cè)定、絡(luò)合物結(jié)合比的測(cè)定中有 著廣泛的應(yīng)用，在無(wú)機(jī)物方面用于礦物、半導(dǎo)體、天然產(chǎn)物和化合物 的研究。另外，紫外-可見(jiàn)光吸收光譜在生物大分子測(cè)序研究、生物活 性小分子分析、生物藥物分析等方面都發(fā)揮了突出的作用。 8 南京航空航天大學(xué)碩士學(xué)位論文 目前，在經(jīng)典的檢測(cè)方法基礎(chǔ)上，不斷派生和出現(xiàn)了許多新的方 法與技術(shù)，比如雙波長(zhǎng)光度法、導(dǎo)數(shù)光譜法、相干光譜法等等，極大 地提高了紫外-可見(jiàn)光吸收光譜的選擇性、靈敏度和自動(dòng)化程度，拓寬 了應(yīng)用領(lǐng)域。 就靈敏度而言，該方法明顯差于熒光分析法，但是它的應(yīng)用范

36、圍 非常廣，適用于各種能吸光的物質(zhì)；而熒光法則主要用于吸收光后發(fā) 射熒光的物質(zhì)，應(yīng)用面窄，多數(shù)生物活性分子不能直接用熒光法測(cè)定， 但由于熒光光譜具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、能提供較多的物理參數(shù)等 特點(diǎn)，其研究也逐步得到重視。 2.2 熒光光譜的基本理論 熒光是發(fā)射光，它是一種光致發(fā)光現(xiàn)象。分子、原子吸收光輻射 后被激發(fā)，接著再發(fā)射出與吸收光波長(zhǎng)相同或波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光，這一現(xiàn) 象稱為光致發(fā)光。熒光和磷光是最常見(jiàn)的兩種光致發(fā)光。可是，這兩 種光致發(fā)光過(guò)程的機(jī)制有明顯的區(qū)別，這里重點(diǎn)討論熒光。 當(dāng)物質(zhì)分子吸收了特征頻率的光子，就由原來(lái)的基態(tài)能級(jí)躍遷至 電子激發(fā)態(tài)的各個(gè)不同振動(dòng)能級(jí)。激發(fā)態(tài)分子經(jīng)與周?chē)肿幼矒?/p>

37、而消 耗了部分能量，迅速下降至第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，并停留 約 10-9 秒之后，直接以光的形式釋放出多余的能量，下降至電子基態(tài) 的各個(gè)不同振動(dòng)能級(jí)，此時(shí)所發(fā)射的光即是熒光。產(chǎn)生熒光的第一個(gè) 必要條件是該物質(zhì)的分子必須具有能吸收激發(fā)光的結(jié)構(gòu)，通常是共軛 雙鍵結(jié)構(gòu)；第二個(gè)條件是該分子必須具有一定程度的熒光效率，即熒 光物質(zhì)吸光后所發(fā)射的熒光量子數(shù)與吸收的激發(fā)光的量子數(shù)的比值。 分子熒光輻射都是從第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)向基態(tài)中各能級(jí) 躍遷而產(chǎn)生的,與分子受激時(shí)躍遷到哪一個(gè)高能級(jí)無(wú)關(guān),所以分子熒光 光譜與激發(fā)入射光的波長(zhǎng)無(wú)關(guān), 因?yàn)闊晒獾漠a(chǎn)生是由第一電子激發(fā)態(tài) 的最低振動(dòng)能級(jí)開(kāi)始的而和

38、熒光物質(zhì)分子原來(lái)被激發(fā)至哪一個(gè)能級(jí)無(wú) 關(guān)，即分子熒光光譜直接反映分子的結(jié)構(gòu)信息。由于每種物質(zhì)的能級(jí) 結(jié)構(gòu)不同,因此,在相同的激勵(lì)條件下其發(fā)射熒光的特性也不同。 熒光分析法具有如下特點(diǎn)： 9 生物組織血液的光譜特性的實(shí)驗(yàn)研究與分析 靈敏度高 熒光是從入射光的直角方向檢測(cè)，即在黑暗背景下 檢測(cè)熒光的發(fā)射強(qiáng)度，所以熒光分析法比通常的紫外和可見(jiàn)光分光光 度法的靈敏度大 23 個(gè)數(shù)量級(jí)，檢測(cè)限可達(dá) 10-1210 -11 g/ml 。 選擇性強(qiáng) 熒光光譜包括激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。在用熒光分析 法鑒定物質(zhì)時(shí)選擇性更強(qiáng)，因?yàn)榉止夤舛确ㄖ荒艿玫酱郎y(cè)物質(zhì)的特征 吸收光譜，而熒光光譜法既能依據(jù)特征發(fā)射（發(fā)射光譜）又

39、能依據(jù)特 征吸收（激發(fā)光譜）來(lái)鑒定物質(zhì)。 取樣容易，試樣需要量少 由于方法的靈敏度高，使試樣的用 量大大減少，特別是使用微量池時(shí)，僅需幾微升的樣品。此外，熒光 分析法還可以用于對(duì)氣體、固體和渾濁試樣的分析。 能提供較多的物理參數(shù) 熒光分析法能提供包括激發(fā)光譜、發(fā) 射光譜、熒光強(qiáng)度、總熒光量、量子產(chǎn)率、熒光壽命、熒光偏振、譜 帶寬度和斯托克斯位移等許多物理參數(shù)。這些參數(shù)反映了被研究物質(zhì) 分子的各種特性，并且通過(guò)它們可以得到分子的更多的信息，這是分 光光度法不能相比的。 任何發(fā)熒光的分子都具有兩個(gè)特征光譜，熒光激發(fā)光譜（excitation spectrum ）和熒光發(fā)射光譜（emission spectrum ），它們是熒光分析法 進(jìn)行定性和定量分析的基本參數(shù)和依據(jù)。 1. 熒光激發(fā)光譜 固定合適的發(fā)射波長(zhǎng)與狹縫寬度，改變激發(fā)光的波長(zhǎng)，測(cè)量熒光 強(qiáng)度的變化。以激發(fā)光波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐