第7章4分子篩

1、凝膠層析凝膠層析 凝膠層析凝膠層析，又稱為，又稱為凝膠過濾、分子排阻層析或分子篩凝膠過濾、分子排阻層析或分子篩層析層析。是以各種凝膠為固定相，利用流動(dòng)相中所含各物。是以各種凝膠為固定相，利用流動(dòng)相中所含各物質(zhì)的相對分子質(zhì)量不同而達(dá)到物質(zhì)分離的一種層析技術(shù)。質(zhì)的相對分子質(zhì)量不同而達(dá)到物質(zhì)分離的一種層析技術(shù)。其設(shè)備簡單，操作方便，不需要再生處理即可反復(fù)使用，其設(shè)備簡單，操作方便，不需要再生處理即可反復(fù)使用，適用于不同相對分子質(zhì)量的各種物質(zhì)的分離，適用于不同相對分子質(zhì)量的各種物質(zhì)的分離，已廣泛地已廣泛地用于生物化學(xué)、生物工程和工業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域。用于生物化學(xué)、生物工程和工業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域。 發(fā)現(xiàn)歷史發(fā)現(xiàn)

2、歷史Per Flodin, Jerker Porath and Bjrn Ingelman1941年年Ingelman意外發(fā)現(xiàn)了葡聚糖意外發(fā)現(xiàn)了葡聚糖dextran。1957年，年， Porath在葡聚糖柱中發(fā)現(xiàn)了分子篩現(xiàn)象。在葡聚糖柱中發(fā)現(xiàn)了分子篩現(xiàn)象。1959年，年，Pharmacia推出推出Sephadex G-25和和G50凝膠過濾填料。凝膠過濾填料。2004年，年， Pharmacia并入并入GE。1. 基本原理基本原理 當(dāng)含有各種組分的樣品流經(jīng)凝膠層析柱時(shí)，大分子當(dāng)含有各種組分的樣品流經(jīng)凝膠層析柱時(shí)，大分子物質(zhì)由于分子直徑大，不易進(jìn)入凝膠顆粒的微孔，物質(zhì)由于分子直徑大，不易進(jìn)入凝膠

3、顆粒的微孔，沿凝膠顆粒的間隙以較快的速度流過凝膠柱。而小沿凝膠顆粒的間隙以較快的速度流過凝膠柱。而小分子物質(zhì)能夠進(jìn)入凝膠顆粒的微孔中，向下移動(dòng)的分子物質(zhì)能夠進(jìn)入凝膠顆粒的微孔中，向下移動(dòng)的速度較慢速度較慢（分子篩效應(yīng)）（分子篩效應(yīng)），從而使樣品中各組分按從而使樣品中各組分按相對分子質(zhì)量從大到小的順序先后流出層析柱，而相對分子質(zhì)量從大到小的順序先后流出層析柱，而達(dá)到分離的目的。達(dá)到分離的目的。一、凝膠過濾層析概述一、凝膠過濾層析概述分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng)樣品流經(jīng)凝膠色譜柱時(shí)，各分子在柱內(nèi)同時(shí)進(jìn)行著樣品流經(jīng)凝膠色譜柱時(shí)，各分子在柱內(nèi)同時(shí)進(jìn)行著兩種不同的運(yùn)動(dòng)：兩種不同的運(yùn)動(dòng)：垂直向下的移動(dòng)和無定向的擴(kuò)

4、散垂直向下的移動(dòng)和無定向的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)運(yùn)動(dòng)。大分子直徑較大，不易進(jìn)入凝膠微孔，所以。大分子直徑較大，不易進(jìn)入凝膠微孔，所以向下移動(dòng)的速度較快。小分子可以進(jìn)入凝膠微孔，向下移動(dòng)的速度較快。小分子可以進(jìn)入凝膠微孔，在向下移動(dòng)的過程中，從一個(gè)顆粒內(nèi)擴(kuò)散到間隙后在向下移動(dòng)的過程中，從一個(gè)顆粒內(nèi)擴(kuò)散到間隙后再進(jìn)入另一顆粒，如此不斷地進(jìn)入和擴(kuò)散，再進(jìn)入另一顆粒，如此不斷地進(jìn)入和擴(kuò)散，導(dǎo)致導(dǎo)致小小分子的下移速度落后于大分子物質(zhì)，分子的下移速度落后于大分子物質(zhì)，從而使樣品中從而使樣品中大的分子先流出色譜柱，中等的分子后流出，小分大的分子先流出色譜柱，中等的分子后流出，小分子最后流出，這種現(xiàn)象叫分子篩效應(yīng)。子最后流

5、出，這種現(xiàn)象叫分子篩效應(yīng)。2. 凝膠過濾層析的特點(diǎn)凝膠過濾層析的特點(diǎn)1.設(shè)備簡單，操作方便，只需一種緩沖液；設(shè)備簡單，操作方便，只需一種緩沖液；2.根據(jù)分子大小和形狀分離；根據(jù)分子大小和形狀分離；3.生物大分子可測定其分子量大小；生物大分子可測定其分子量大小；4.分離條件緩和，應(yīng)用廣泛；分離條件緩和，應(yīng)用廣泛；5.分辨率不高，樣品被稀釋。分辨率不高，樣品被稀釋。113.3.目標(biāo)組分的分子量、形狀目標(biāo)組分的分子量、形狀關(guān)于關(guān)于GFGF分級范圍分級范圍凝膠的分級范圍（滲入限與排阻限）凝膠的分級范圍（滲入限與排阻限）相對分子量相對分子量 分級范圍上限分級范圍上限全排阻分子，流全排阻分子，流程最短，程

6、最短，無法分離無法分離相對分子量相對分子量 分級范圍下限分級范圍下限全滲透分子，流全滲透分子，流程最長，程最長，無法分離無法分離分級范圍下限分級范圍下限 相對分子量相對分子量 分級范圍上限分級范圍上限部分滲透分子，流程長短不一，部分滲透分子，流程長短不一，有效分離有效分離13 4. 4.層析層析柱的重要參數(shù)柱的重要參數(shù) 凝膠柱體積參數(shù)凝膠柱體積參數(shù)Vt=Vo+Vi+Vg19洗脫體積洗脫體積VeVoKdViKd溶質(zhì)分子在固定相與流動(dòng)相之間的分配系數(shù)，只與顆粒大小和凝膠顆粒內(nèi)孔隙大小分布有關(guān)。Kd可通過實(shí)驗(yàn)由Ve、Vo和Vi求得。21VeVoKdViKd=0，全排阻分子，Ve=Vo；Kd=1，全滲

7、透分子，Ve=Vo+Vi0Kd1，部分滲透分子，VoVeVo+Vil分級分離部分滲透分子之間的分離；l組別分離（分類分離）不同類別分子間的分離，全排-全滲-部分滲透GF分離中的兩種類型：分離中的兩種類型： 一種是只將分子量極為懸殊的兩類物質(zhì)分開，如蛋一種是只將分子量極為懸殊的兩類物質(zhì)分開，如蛋白質(zhì)與鹽類，稱作類分離或組分離。白質(zhì)與鹽類，稱作類分離或組分離。 另一類則是要將分子量相差不很大的大分子物質(zhì)加另一類則是要將分子量相差不很大的大分子物質(zhì)加以分離，如分離血清球蛋白與白蛋白，這叫做分級以分離，如分離血清球蛋白與白蛋白，這叫做分級分離分離。Anhui University of Technol

8、ogy and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering22GFGF分辨率分辨率分辨率（分離度）分辨率（分離度）RsRs用于描述混合組分中兩種物質(zhì)組分間分離用于描述混合組分中兩種物質(zhì)組分間分離效果的好壞，定義為效果的好壞，定義為相鄰兩峰洗脫體積相鄰兩峰洗脫體積（保留值）之差與兩峰保留值）之差與兩峰底寬平均值之比底寬平均值之比， 12121212)(22bbeebbeesWWVVWWVVRAnhui University of Technology and ScienceTeaching

9、and Research Section Department of Biochemical Engineering23如要提高分辨率，只能從選擇性和柱效進(jìn)行考慮如要提高分辨率，只能從選擇性和柱效進(jìn)行考慮! !選擇性：選擇性：柱系統(tǒng)分離大小不同組分的能力。習(xí)慣上用柱系統(tǒng)分離大小不同組分的能力。習(xí)慣上用相對保留值相對保留值表示表示，取決于凝膠介質(zhì)的分級范圍、滲，取決于凝膠介質(zhì)的分級范圍、滲透性等特性。透性等特性。 oeoeVVVV12當(dāng)當(dāng) = 1= 1時(shí)，時(shí)，Ve2=Ve1Ve2=Ve1，無論如何兩種組分是無法分開的。，無論如何兩種組分是無法分開的。Anhui University of Tec

10、hnology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering24表現(xiàn)為兩組分洗脫體積的差異，表現(xiàn)為兩組分洗脫體積的差異，VeVe差值越大，選擇性越好差值越大，選擇性越好Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering25柱效柱效1.1.以特定實(shí)驗(yàn)條件下層析柱的理論塔板數(shù)以特定實(shí)驗(yàn)條件下層析柱的理論塔板數(shù)N N來表示來

11、表示塔板理論認(rèn)為，一根柱子可以分為塔板理論認(rèn)為，一根柱子可以分為N N段，在每段內(nèi)組段，在每段內(nèi)組分在兩相間很快達(dá)到平衡，把每一段稱為一塊理論塔分在兩相間很快達(dá)到平衡，把每一段稱為一塊理論塔板。理論塔板數(shù)（板。理論塔板數(shù)（N N）可根據(jù)色譜圖上所測得的洗脫）可根據(jù)色譜圖上所測得的洗脫體積和半峰寬按下式推算：體積和半峰寬按下式推算：2)(54.5heWVN VeVe洗脫體積；洗脫體積；WhWh半峰高時(shí)的峰寬半峰高時(shí)的峰寬 一般說來，色譜柱的理論塔板一般說來，色譜柱的理論塔板數(shù)數(shù)越大越大，表示組分在色譜柱中，表示組分在色譜柱中達(dá)到分配平衡的次數(shù)越多，越達(dá)到分配平衡的次數(shù)越多，越有有利于分離利于分離

12、；柱效表現(xiàn)為洗脫；柱效表現(xiàn)為洗脫峰的寬度，洗脫峰越窄，柱效峰的寬度，洗脫峰越窄，柱效越高（越高（N N越大）。越大）。Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering26理論塔板高度理論塔板高度H HNLH/式中式中L L為柱長，為柱長，N N為理論塔板數(shù)，為理論塔板數(shù)，理論塔板高度理論塔板高度H H固定時(shí)，固定時(shí)，L L增加，則增加，則N N增加，柱效越增加，柱效越高。高。固相介質(zhì)：固相介質(zhì)：凝膠顆粒凝膠顆粒（多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)

13、）（多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)） 交聯(lián)度或孔度（網(wǎng)孔大小）交聯(lián)度或孔度（網(wǎng)孔大?。┠z的分級分離范凝膠的分級分離范圍圍交聯(lián)葡聚糖交聯(lián)葡聚糖Sephadex G（1500-30000）瓊脂糖瓊脂糖 Sepharose或或Bio-Gel A聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺Bio-Gel P二.凝膠過濾介質(zhì)Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering28凝膠過濾凝膠過濾介質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)介質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)介質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)直接決定分離效果和效率介質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)直

14、接決定分離效果和效率分級范圍分級范圍多孔性多孔性粒度粒度 N NRsRsAnhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering29凝膠過濾凝膠過濾介質(zhì)的參數(shù)及性質(zhì)介質(zhì)的參數(shù)及性質(zhì)基本基本參數(shù)參數(shù)l粒度粒度5400 m5400 m范圍范圍l小粒度小粒度柱效高，但背景壓力大，設(shè)備要求高柱效高，但背景壓力大，設(shè)備要求高，分析型，分析型l大粒度大粒度柱效低，壓力小，樣品量大，制備型柱效低，壓力小，樣品量大，制備型粒度均一粒度均一分離效果好分

15、離效果好 Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering30交聯(lián)度、網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)、交聯(lián)度、網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)、機(jī)械強(qiáng)度機(jī)械強(qiáng)度交聯(lián)度高，顆粒網(wǎng)孔小，機(jī)械強(qiáng)度高交聯(lián)度高，顆粒網(wǎng)孔小，機(jī)械強(qiáng)度高膨脹度：每克干膠溶脹過程中吸收水的體積膨脹度：每克干膠溶脹過程中吸收水的體積ml/gml/g，也稱得水值，也稱得水值交聯(lián)度高，得水值越?。ㄋ肿訜o法大量進(jìn)入顆交聯(lián)度高，得水值越?。ㄋ肿訜o法大量進(jìn)入顆粒網(wǎng)孔粒網(wǎng)孔之間）之間）機(jī)械強(qiáng)度機(jī)械強(qiáng)度與交聯(lián)度呈正

16、相關(guān)與交聯(lián)度呈正相關(guān)Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering31物化物化穩(wěn)定性穩(wěn)定性 耐酸堿、去污劑、高溫等外界分離條件耐酸堿、去污劑、高溫等外界分離條件 下文按照以上幾個(gè)主要反映凝膠過濾介質(zhì)性下文按照以上幾個(gè)主要反映凝膠過濾介質(zhì)性質(zhì)的指標(biāo)介紹主要的質(zhì)的指標(biāo)介紹主要的GFGF介質(zhì)類型。介質(zhì)類型。Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research

17、 Section Department of Biochemical Engineering32凝膠凝膠介質(zhì)的主要類型介質(zhì)的主要類型交聯(lián)交聯(lián)葡聚糖凝膠（葡聚糖凝膠（SephadexSephadex）n基本性質(zhì)基本性質(zhì) 由數(shù)個(gè)葡萄糖分子聚合而成的同多糖就是葡聚由數(shù)個(gè)葡萄糖分子聚合而成的同多糖就是葡聚糖，通過環(huán)氧丙烷交聯(lián)而成交聯(lián)葡聚糖凝膠。糖，通過環(huán)氧丙烷交聯(lián)而成交聯(lián)葡聚糖凝膠。具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性，是目前生化產(chǎn)品制備具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性，是目前生化產(chǎn)品制備中最常用的凝膠。中最常用的凝膠。網(wǎng)孔大小可通過調(diào)節(jié)交聯(lián)劑和葡聚糖的配比及反應(yīng)條件來控制Anhui University of Technolo

18、gy and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering33葡聚糖凝膠常用葡聚糖凝膠常用G-XG-X代表，代表， Sephadex GX Sephadex GX ，X X為凝為凝膠吸水值的膠吸水值的1010倍；倍； Sephadex GXSephadex GX，XX每每10g10g干膠的干膠的得水值（得水值（ml/10gml/10g）l 種類有種類有G10G10、G15G15、G25G25、G50G50、G75G75、G100G100、G150G150、G200G200。l 如如G-25G

19、-25表示表示1g1g干凝膠的吸水量為干凝膠的吸水量為2.5mL2.5mL，G-100G-100表示表示 1g1g干膠持水干膠持水10mL10mL，依次類推。，依次類推。 Sephadex GXAnhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering34 X X數(shù)字既代表持水量（得水值），也代表數(shù)字既代表持水量（得水值），也代表交聯(lián)度，交聯(lián)度，也能反映膨脹程度和分級范圍也能反映膨脹程度和分級范圍。l X X數(shù)字越小，得水值越小，交聯(lián)度

20、越大，網(wǎng)孔越小數(shù)字越小，得水值越小，交聯(lián)度越大，網(wǎng)孔越小，吸水膨脹就越小。適用于分離低分子質(zhì)量生化產(chǎn)，吸水膨脹就越小。適用于分離低分子質(zhì)量生化產(chǎn)品。品。l X X數(shù)字越大，得水值越大，交聯(lián)度越小，網(wǎng)孔越大數(shù)字越大，得水值越大，交聯(lián)度越小，網(wǎng)孔越大，吸水膨脹就越大，適用于分離高分子生化產(chǎn)品。，吸水膨脹就越大，適用于分離高分子生化產(chǎn)品。Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering35Anhui University of Te

21、chnology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering36n特點(diǎn)特點(diǎn)較強(qiáng)的親水性較強(qiáng)的親水性溶脹、浸泡時(shí)沸水（脫氣）、輕攪（防裂）溶脹、浸泡時(shí)沸水（脫氣）、輕攪（防裂）葡聚糖凝膠對堿比較穩(wěn)定，在酸性環(huán)境中其糖苷葡聚糖凝膠對堿比較穩(wěn)定，在酸性環(huán)境中其糖苷鍵易水解鍵易水解濕態(tài)的葡聚糖可加熱到濕態(tài)的葡聚糖可加熱到110110，干的則能耐受，干的則能耐受120120高溫高溫Anhui University of Technology and ScienceTeaching and R

22、esearch Section Department of Biochemical Engineering37SephadeX LH20SephadeX LH20，是，是Sephadex G25Sephadex G25的的羧丙基羧丙基衍生物衍生物，溶于水和親脂性溶劑，這類層析介質(zhì)的，溶于水和親脂性溶劑，這類層析介質(zhì)的流動(dòng)相既可使用緩沖水溶液，也可使用極性有機(jī)流動(dòng)相既可使用緩沖水溶液，也可使用極性有機(jī)溶劑，因此適用于非水溶性溶質(zhì)的凝膠過濾溶劑，因此適用于非水溶性溶質(zhì)的凝膠過濾 機(jī)械強(qiáng)度低，機(jī)械強(qiáng)度低，G100G100、150150、200200屬于軟膠，高壓易屬于軟膠，高壓易破裂破裂Sephad

23、eX LH20Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering38瓊脂糖凝膠是依靠糖鏈之間的次級鏈如氫鍵來維持瓊脂糖凝膠是依靠糖鏈之間的次級鏈如氫鍵來維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的疏密依靠瓊脂糖的濃度。一網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的疏密依靠瓊脂糖的濃度。一般情況下，它的結(jié)構(gòu)是穩(wěn)定的，可以在許多條件下般情況下，它的結(jié)構(gòu)是穩(wěn)定的，可以在許多條件下使用。使用。瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠（SepharoseSepharose）Anhui Universi

24、ty of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering39nSepharoseSepharose無交聯(lián)劑，無交聯(lián)劑，Sepharose 2BSepharose 2B、4B4B、6B6B，數(shù)字代表瓊，數(shù)字代表瓊脂糖含量，含量高則強(qiáng)度高，分級范圍變小脂糖含量，含量高則強(qiáng)度高，分級范圍變小pH4-9pH4-9范圍內(nèi)的鹽溶液穩(wěn)定范圍內(nèi)的鹽溶液穩(wěn)定4040以上開始融化，也以上開始融化，也不能高壓消毒不能高壓消毒，可用化學(xué)，可用化學(xué)滅菌活處理滅菌活處理SepharoseA

25、nhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering40補(bǔ)充：補(bǔ)充： 瑞典的商品名稱為瑞典的商品名稱為SepharoseSepharose，有，有3 3種型號，即種型號，即Sepharose 2BSepharose 2B，4B4B和和6B6B（同中國相同）。阿拉伯?dāng)?shù)字（同中國相同）。阿拉伯?dāng)?shù)字表示凝膠中干膠的百分含量。表示凝膠中干膠的百分含量。 美國的為美國的為BioBioGAGA，有，有6 6個(gè)型號，即個(gè)型號，即Bio-G 0.5

26、MBio-G 0.5M，1.5M1.5M，5M5M，15M15M，50M50M和和150M150M。阿拉伯?dāng)?shù)字乘以。阿拉伯?dāng)?shù)字乘以106106表示排表示排阻限度。阻限度。 英國的稱為英國的稱為SagavacSagavac，又分為，又分為Sagavac 2FSagavac 2F，4F4F，6F6F，8F8F，10F10F和和2C2C，4C4C，6C6C，8C8C，10C10C。前面的阿拉伯?dāng)?shù)字。前面的阿拉伯?dāng)?shù)字表示凝膠中干膠的百分?jǐn)?shù)，表示凝膠中干膠的百分?jǐn)?shù)，F(xiàn) F代表粉末狀，代表粉末狀，C C代表顆粒代表顆粒狀。狀。 丹麥的稱為丹麥的稱為GelaroseGelarose，有，有5 5種類型，即種

27、類型，即2%2%，4%4%，6%6%，8%8%和和10%10%。Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering41nSepharose CLSepharose CL二溴丙醇交聯(lián)的瓊脂糖，其孔徑大小和分離范圍二溴丙醇交聯(lián)的瓊脂糖，其孔徑大小和分離范圍與普通瓊脂糖一樣，但熱和化學(xué)穩(wěn)定性增加，與普通瓊脂糖一樣，但熱和化學(xué)穩(wěn)定性增加，能能高溫消毒。高溫消毒。Sepharose CLAnhui University of Techno

28、logy and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering42nSuperoseSuperose高分辨率，高機(jī)械強(qiáng)度，分級范圍寬，是目前最高分辨率，高機(jī)械強(qiáng)度，分級范圍寬，是目前最優(yōu)的瓊脂糖凝膠（瓊脂糖顆?；A(chǔ)上的兩次交聯(lián)優(yōu)的瓊脂糖凝膠（瓊脂糖顆?；A(chǔ)上的兩次交聯(lián)）。）。Superose6Superose6、12/612/6、12 prep grade12 prep grade，數(shù)字表示瓊，數(shù)字表示瓊脂糖濃度，分析型脂糖濃度，分析型/ /制備型。制備型。SuperoseAnhui Uni

29、versity of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering43補(bǔ)充補(bǔ)充Superose 6, 12Superose 6, 12預(yù)裝柱預(yù)裝柱(10/132mm) (10/132mm) 有寬廣的分離范有寬廣的分離范圍配合高分辨率，優(yōu)化條件可在圍配合高分辨率，優(yōu)化條件可在 Superose6, 12 Superose6, 12 Prep Grade (20-40 mm)Prep Grade (20-40 mm)直接放大直接放大Sepharose 4 and 6

30、 Fast Flow Sepharose 4 and 6 Fast Flow 乃高度偶聯(lián)的瓊脂乃高度偶聯(lián)的瓊脂醣介質(zhì)，因此大大加強(qiáng)了機(jī)械性能，流速特快醣介質(zhì)，因此大大加強(qiáng)了機(jī)械性能，流速特快Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering44瓊脂糖凝膠做成珠狀后不再脫水干燥，否則不瓊脂糖凝膠做成珠狀后不再脫水干燥，否則不能再溶脹恢復(fù)原有形狀，因此商品大都以含水能再溶脹恢復(fù)原有形狀，因此商品大都以含水狀態(tài)供應(yīng)，并應(yīng)在濕態(tài)保存。一

31、般懸浮在狀態(tài)供應(yīng)，并應(yīng)在濕態(tài)保存。一般懸浮在l0-3 l0-3 mo1/L EDTAmo1/L EDTA和和0.02%0.02%疊氮化鈉溶液中。疊氮化鈉溶液中。Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering45結(jié)構(gòu)式為結(jié)構(gòu)式為 CH2CH2CH(CONH2)nCH(CONH2)n，分子量，分子量100500100500萬；萬；聚丙烯酰胺凝膠也是一種人工合成凝膠，和交聚丙烯酰胺凝膠也是一種人工合成凝膠，和交聯(lián)葡聚糖一樣，為顆粒

32、狀干粉，在溶劑中能自動(dòng)吸聯(lián)葡聚糖一樣，為顆粒狀干粉，在溶劑中能自動(dòng)吸水溶脹成凝膠。其由水溶脹成凝膠。其由單體丙烯酰胺單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺 通過自由基引發(fā)聚會(huì)形通過自由基引發(fā)聚會(huì)形成聚丙烯酰胺凝膠。成聚丙烯酰胺凝膠。（見下圖）。只要控制單體用量和交聯(lián)劑（見下圖）。只要控制單體用量和交聯(lián)劑的比例，就能得到不同型號的凝膠。的比例，就能得到不同型號的凝膠。聚丙烯酰胺凝膠（聚丙烯酰胺凝膠（PAM;polyacrylamidePAM;polyacrylamide）Anhui University of Technology and ScienceTeaching and

33、 Research Section Department of Biochemical Engineering46Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering47 聚丙烯酰胺凝膠的商品名為聚丙烯酰胺凝膠的商品名為Bio-Gel PXBio-Gel PX，型號從，型號從P-P-2 2至至P-300P-300共共1010種種, ,各種類型均以英文字母各種類型均以英文字母P P和阿拉伯和阿拉伯?dāng)?shù)字表示，從數(shù)字表示，從Bio-Ge

34、l P-2Bio-Gel P-2至至Bio-Ge1 P-300Bio-Ge1 P-300。P P后后面的阿拉伯?dāng)?shù)字乘以面的阿拉伯?dāng)?shù)字乘以10001000即相當(dāng)于排阻限度（按球即相當(dāng)于排阻限度（按球蛋白或肽計(jì)算）。目前，美國蛋白或肽計(jì)算）。目前，美國Bio-Rad Bio-Rad LaboratoriesLaboratories生產(chǎn)并出售多種規(guī)格的生產(chǎn)并出售多種規(guī)格的Bio-Gel PBio-Gel P。 理化性質(zhì)上與理化性質(zhì)上與Sephadex GSephadex G系列比較接近，但系列比較接近，但pHpH穩(wěn)定穩(wěn)定性不如性不如G G系列。系列。 Anhui University of Tech

35、nology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering48復(fù)合復(fù)合結(jié)構(gòu)凝膠結(jié)構(gòu)凝膠n Sephacryl HRSephacryl HR烯丙基葡聚糖烯丙基葡聚糖+Bis+Bis，高親水性，高機(jī)械強(qiáng)度，可高，高親水性，高機(jī)械強(qiáng)度，可高溫滅菌，溫滅菌，Ph213Ph213n UltroGel AcAUltroGel AcA瓊脂糖瓊脂糖+ +聚丙烯酰胺，強(qiáng)度優(yōu)于聚丙烯酰胺，強(qiáng)度優(yōu)于SuperoseSuperoseAnhui University of Technology and Sci

36、enceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering49Superdex peptideSuperdex peptide，適用于多肽的分，適用于多肽的分離離n SuperdexSuperdex葡聚糖與高度交聯(lián)瓊脂糖顆粒的共價(jià)結(jié)合葡聚糖與高度交聯(lián)瓊脂糖顆粒的共價(jià)結(jié)合市面上唯一分離范圍是市面上唯一分離范圍是100-100-7000 7000 的的凝膠過濾介質(zhì)凝膠過濾介質(zhì)選擇性和分辨率高，顆粒大小只選擇性和分辨率高，顆粒大小只有有13um13um高化學(xué)穩(wěn)定性，高化學(xué)穩(wěn)定性，pH1-14pH1-14都可工都可工作

37、，有機(jī)溶劑亦可，如乙腈作，有機(jī)溶劑亦可，如乙腈+ +三氟三氟乙酸乙酸結(jié)合了結(jié)合了SephadexSephadex的高選擇性和的高選擇性和瓊脂醣的高物理穩(wěn)定性，在高瓊脂醣的高物理穩(wěn)定性，在高 流流速下不會(huì)變形速下不會(huì)變形Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering50第五章 凝膠過濾層析Superdex Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Resear

38、ch Section Department of Biochemical Engineering51其他其他（了解）（了解）n 交聯(lián)聚苯乙烯，交聯(lián)聚苯乙烯，Bio-beadsBio-beads：適合非極性有機(jī)溶：適合非極性有機(jī)溶劑的洗脫分離，不能在水和極性有機(jī)溶劑中工作劑的洗脫分離，不能在水和極性有機(jī)溶劑中工作（乙醇、丙酮）（乙醇、丙酮）n 聚乙烯醇（聚乙烯醇（ToyopearlToyopearl）n 二氧化硅類型：二氧化硅類型：SiO2SiO2易堿性條件下水解，此類型易堿性條件下水解，此類型凝膠介質(zhì)適用于中、酸性條件凝膠介質(zhì)適用于中、酸性條件Anhui University of Techn

39、ology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering52三、凝膠過濾方案設(shè)計(jì)Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering53選擇適宜的凝膠是取得良好分離效果的最根本的保證。選擇適宜的凝膠是取得良好分離效果的最根本的保證。選選取何種凝膠及其型號、粒度，一方面要考慮凝膠的性質(zhì)，包取何種凝膠及其型號、粒度，一方面要

40、考慮凝膠的性質(zhì)，包括凝膠的分離范圍（滲入限與排阻限）還有它的理化穩(wěn)定性括凝膠的分離范圍（滲入限與排阻限）還有它的理化穩(wěn)定性、強(qiáng)度、非特異吸附性質(zhì)等；另一方面還要注意到分離目的、強(qiáng)度、非特異吸附性質(zhì)等；另一方面還要注意到分離目的和樣品的性質(zhì)。和樣品的性質(zhì)。每一個(gè)分離實(shí)驗(yàn)要求的目的成分的分子大小、形狀、性質(zhì)每一個(gè)分離實(shí)驗(yàn)要求的目的成分的分子大小、形狀、性質(zhì)均有差異，所以對特定的目的成分的分離要有針對性的方案均有差異，所以對特定的目的成分的分離要有針對性的方案設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)。分離目標(biāo)和介質(zhì)的對應(yīng)選擇；分離目標(biāo)和介質(zhì)的對應(yīng)選擇；首先明確欲分離樣品首先明確欲分離樣品的數(shù)量和目的的數(shù)量和目的 Anhui Un

41、iversity of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering541 1. .介質(zhì)介質(zhì)的選擇（固定相）的選擇（固定相） 數(shù)量分析型分析型制備型制備型少量少量大量大量純度測定、分子量測定、結(jié)構(gòu)測純度測定、分子量測定、結(jié)構(gòu)測定定脫鹽、緩沖液置換、工業(yè)制備脫鹽、緩沖液置換、工業(yè)制備分析型，微量制取分析分析型，微量制取分析制備型，大量樣品處理制備型，大量樣品處理小小大大可重復(fù)性分析型，要求可重復(fù)：高機(jī)械強(qiáng)度保證穩(wěn)定的洗脫體積分析型，要求可重復(fù)：高機(jī)械強(qiáng)度保證穩(wěn)定的

42、洗脫體積制備型，重復(fù)性要求不高，如，脫鹽，大多介質(zhì)都可進(jìn)行，制備型，重復(fù)性要求不高，如，脫鹽，大多介質(zhì)都可進(jìn)行，此時(shí)要考慮時(shí)間，選流速大的介質(zhì)，此時(shí)要考慮時(shí)間，選流速大的介質(zhì)，Bio-gel Bio-gel P4 或P6分離階段初初/ /前期，速度優(yōu)先，針對粗體液組分復(fù)雜特點(diǎn)，要求介質(zhì)物、化穩(wěn)定性前期，速度優(yōu)先，針對粗體液組分復(fù)雜特點(diǎn)，要求介質(zhì)物、化穩(wěn)定性要好要好后期，分辨率優(yōu)先，選粒度小的介質(zhì)，提高柱效后期，分辨率優(yōu)先，選粒度小的介質(zhì)，提高柱效粒度大小粒度大小Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Sec

43、tion Department of Biochemical Engineering55般來說，細(xì)粒凝膠柱流速低，但洗脫峰窄，分辨般來說，細(xì)粒凝膠柱流速低，但洗脫峰窄，分辨率高，多用于精制分離或分析等。率高，多用于精制分離或分析等。粗粒凝膠柱流速高，但洗脫峰平坦，分辨率低，多粗粒凝膠柱流速高，但洗脫峰平坦，分辨率低，多用于粗制分離，脫鹽等。用于粗制分離，脫鹽等。下圖表示在同一流速下不同粒度的下圖表示在同一流速下不同粒度的Sephadex G-25Sephadex G-25柱的洗脫效果。柱的洗脫效果。 凝膠粒度與洗脫效果的關(guān)系圖凝膠粒度與洗脫效果的關(guān)系圖 粒度的大小Anhui Universit

44、y of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering56選擇性選擇性曲線和分級范圍曲線和分級范圍n樣品特性樣品特性 目標(biāo)分子球狀目標(biāo)分子球狀oror線型葡聚糖狀，要做出對應(yīng)的介質(zhì)線型葡聚糖狀，要做出對應(yīng)的介質(zhì)分級范圍選擇。分級范圍選擇。例：已知某目標(biāo)分子為線型分子，相對分子質(zhì)量例：已知某目標(biāo)分子為線型分子，相對分子質(zhì)量2000020000，如何在，如何在Sephadex GXSephadex GX系列進(jìn)行合理選擇系列進(jìn)行合理選擇? ?G-50G-50，球狀，球

45、狀150030000150030000；葡聚糖；葡聚糖5001000050010000，G-75G-75，球狀，球狀100050000100050000；葡聚糖；葡聚糖100050000100050000 未知目標(biāo)分子的形狀和大小，需選擇分級范圍寬的未知目標(biāo)分子的形狀和大小，需選擇分級范圍寬的介質(zhì)，力求全部包括進(jìn)來，高排阻限。介質(zhì)，力求全部包括進(jìn)來，高排阻限。Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering57 目的分子的大小

46、目的分子的大小類分離或組分離類分離或組分離分級分離分級分離Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering58第五章 凝膠過濾層析A A、類分離、類分離目的是分開樣品中分子量懸殊的目的是分開樣品中分子量懸殊的“較大分子組較大分子組”和和“較小分子組較小分子組”兩類物質(zhì)，并不要求分離分子量相兩類物質(zhì)，并不要求分離分子量相近的組分。近的組分。選擇凝膠時(shí)，應(yīng)使樣品中大分子組的分子量大于其選擇凝膠時(shí)，應(yīng)使樣品中大分子組的分子量大于其排

47、阻限，而小分子組的分子量小于滲入限。也就是排阻限，而小分子組的分子量小于滲入限。也就是說大分子的分配系數(shù)說大分子的分配系數(shù)Kd= 0Kd= 0，小分子的，小分子的KdKd1 1。這樣。這樣能取得最好的分離效果。能取得最好的分離效果。Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering59例如從蛋白質(zhì)溶液中除去無機(jī)鹽（脫鹽）蛋白質(zhì)的分子量都大于蛋白質(zhì)的分子量都大于5000D5000D，而無機(jī)鹽的分子量一，而無機(jī)鹽的分子量一般在幾十到

48、幾百之間。般在幾十到幾百之間。常選用常選用Sephadex G-25Sephadex G-25凝膠作為分離固定相，因?yàn)樗z作為分離固定相，因?yàn)樗姆蛛x范圍是的分離范圍是100010005000D5000D。被分離的兩組物質(zhì)的分。被分離的兩組物質(zhì)的分子量正好落在分離范圍的兩側(cè)。大分子組為全排阻子量正好落在分離范圍的兩側(cè)。大分子組為全排阻，而小分子組為全滲入，而小分子組為全滲入，Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering6

49、0B、分級分離目的是分開分子量不很懸殊的大分子物質(zhì)。目的是分開分子量不很懸殊的大分子物質(zhì)。選擇凝膠型號時(shí)必須使各種物質(zhì)的選擇凝膠型號時(shí)必須使各種物質(zhì)的KdKd值盡可能相差值盡可能相差大一些。大一些。為此，首先決不能使它們的分子量都分布在凝膠分為此，首先決不能使它們的分子量都分布在凝膠分離范圍的一側(cè)，也就是離范圍的一側(cè)，也就是KdKd不要都接近于不要都接近于0 0或或1 1，而要，而要使組分的分子量盡可能分布在凝膠分離范圍的兩側(cè)使組分的分子量盡可能分布在凝膠分離范圍的兩側(cè)，或接近兩側(cè)的位置。，或接近兩側(cè)的位置。如果樣品中含有如果樣品中含有3 3個(gè)組分的話，最好一個(gè)接近全排阻個(gè)組分的話，最好一個(gè)接

50、近全排阻，另一個(gè)接近全滲入，第三個(gè)為部分滲入，另一個(gè)接近全滲入，第三個(gè)為部分滲入，Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering61第五章 凝膠過濾層析洗脫劑洗脫劑的選擇的選擇凝膠過濾介質(zhì)的穩(wěn)定性決定了可選擇洗脫劑有凝膠過濾介質(zhì)的穩(wěn)定性決定了可選擇洗脫劑有較寬較寬的范圍。的范圍。理論上：如果所分離物質(zhì)不帶電荷，直接以理論上：如果所分離物質(zhì)不帶電荷，直接以蒸餾蒸餾水洗脫，脫鹽水洗脫，脫鹽常用。常用。實(shí)際上：大多數(shù)實(shí)際上：大多數(shù)

51、GFGF在在Ph7.0Ph7.0附近進(jìn)行，多選擇附近進(jìn)行，多選擇Ph68Ph68的磷酸緩沖液、的磷酸緩沖液、Tris-ClTris-Cl緩沖液；緩沖液；介質(zhì)本身帶電荷，洗脫劑中加入介質(zhì)本身帶電荷，洗脫劑中加入0.015MNaCl0.015MNaCl排除排除介質(zhì)與溶質(zhì)分子之間的離子作用。介質(zhì)與溶質(zhì)分子之間的離子作用。Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering62第五章 凝膠過濾層析層析層析柱的選擇柱的選擇性質(zhì)穩(wěn)定，耐壓；性

52、質(zhì)穩(wěn)定，耐壓；出入口死體積小，出入口死體積小，0.1%0.1%柱體積；柱體積；柱內(nèi)有凝膠介質(zhì)支撐物（在支撐介質(zhì)的同時(shí)，保柱內(nèi)有凝膠介質(zhì)支撐物（在支撐介質(zhì)的同時(shí)，保證洗脫液的暢流）；證洗脫液的暢流）；拆洗方便，配件最好通用拆洗方便，配件最好通用Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering63第五章 凝膠過濾層析Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Res

53、earch Section Department of Biochemical Engineering64n尺寸參數(shù)尺寸參數(shù)內(nèi)徑、柱高、柱體積（內(nèi)徑、柱高、柱體積（mlml）；高徑比；實(shí)驗(yàn)室常）；高徑比；實(shí)驗(yàn)室常用用i.d=416 mmi.d=416 mm，L=25100 cmL=25100 cmRsRs與與L L平方根成正比，平方根成正比，高高RsRs需要較長的柱高需要較長的柱高，但樣但樣品稀釋度變大品稀釋度變大；脫鹽常用脫鹽常用L50 cmL90m90m，過，過1m1m濾膜；濾膜；介質(zhì)粒度介質(zhì)粒度90m90m，過，過0.45m0.45m濾膜；濾膜；無菌或更高澄清度要求，過無菌或更高澄清度要

54、求，過0.22m0.22m濾膜；濾膜；Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering71n固體：溶解于洗脫劑固體：溶解于洗脫劑樣品體積大樣品體積大過過0.45m0.45m濾膜過濾除顆粒物濾膜過濾除顆粒物樣品量少樣品量少10,000g10,000g，15min15min離心除顆粒物離心除顆粒物Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Sect

55、ion Department of Biochemical Engineering72n黏度：黏度：由于凝膠層析的稀釋作用，似乎樣品濃度應(yīng)盡可能大由于凝膠層析的稀釋作用，似乎樣品濃度應(yīng)盡可能大才好，但才好，但樣品濃度過大往往導(dǎo)致粘度增大，而使層析分辨率樣品濃度過大往往導(dǎo)致粘度增大，而使層析分辨率下降下降針對球狀蛋白，要求濃度針對球狀蛋白，要求濃度70mg/ml70mg/ml洗脫劑添加蔗糖或葡聚糖增加洗脫劑的黏度，抵消洗脫劑添加蔗糖或葡聚糖增加洗脫劑的黏度，抵消溶質(zhì)黏度溶質(zhì)黏度Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Resea

56、rch Section Department of Biochemical Engineering73 樣品黏度對洗脫曲線的影響樣品黏度對洗脫曲線的影響（1）加葡聚糖）加葡聚糖2 000，使終濃度為，使終濃度為5%，相對粘度，相對粘度11.8;（2）加葡聚糖）加葡聚糖2 000，使終濃度為，使終濃度為2.5%，相對粘度，相對粘度4.2; （3）加葡聚糖）加葡聚糖2 000，使終濃，使終濃度為度為1%. Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical

57、 Engineering74上上樣樣（一定體積樣品加至層析柱頂端，并使其進(jìn)入（一定體積樣品加至層析柱頂端，并使其進(jìn)入凝膠）凝膠）n上樣量上樣量分析型：上樣量受分析型：上樣量受RsRs影響，影響，RsRs隨隨V V樣樣/V/V柱的增大柱的增大而降低；上樣量約為柱體積而降低；上樣量約為柱體積0.5%5%0.5%5%；更小的比；更小的比例并不會(huì)改善例并不會(huì)改善RsRs。制備型（緩沖液置換制備型（緩沖液置換/ /脫鹽）：脫鹽）：V V樣樣/V/V柱達(dá)柱達(dá)30%30%不不會(huì)顯著影響會(huì)顯著影響RsRs。Anhui University of Technology and ScienceTeaching a

58、nd Research Section Department of Biochemical Engineering75n上樣方法上樣方法排干法排干法液面下加法液面下加法進(jìn)樣器進(jìn)樣器/ /進(jìn)樣環(huán)法進(jìn)樣環(huán)法Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering765.5.洗脫洗脫洗脫劑恒速流經(jīng)層析介質(zhì)，洗脫下溶質(zhì)分子的過程洗脫劑恒速流經(jīng)層析介質(zhì)，洗脫下溶質(zhì)分子的過程n流速（流速（flow rateflow rate，ml/minml/m

59、in）恒流泵：有利于精確性、重復(fù)性；恒流泵：有利于精確性、重復(fù)性；流速不可超過介質(zhì)的可承受機(jī)械強(qiáng)度（流速源于流速不可超過介質(zhì)的可承受機(jī)械強(qiáng)度（流速源于泵壓）；泵壓）；Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering77大流速大流速：可導(dǎo)致：可導(dǎo)致RsRs降低，峰型降低，峰型變寬；在保證變寬；在保證RsRs情況下，適用情況下，適用于組別分離于組別分離& &制備分離（脫鹽制備分離（脫鹽、緩沖液置換）；、緩沖液置換）

60、；低流速低流速：使高分子組分有時(shí)間：使高分子組分有時(shí)間達(dá)到良好的分配平衡，洗脫峰達(dá)到良好的分配平衡，洗脫峰尖銳但小分子組分會(huì)因擴(kuò)散嚴(yán)尖銳但小分子組分會(huì)因擴(kuò)散嚴(yán)重，導(dǎo)致洗脫峰變寬，被稀釋重，導(dǎo)致洗脫峰變寬，被稀釋。Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering78第五章 凝膠過濾層析6.6.洗脫洗脫組分檢測與收集組分檢測與收集n檢測檢測波長波長280nmProtein280nmProtein；254nmNucleic acid254nmNuc