病原生物學與免疫學實驗

1、病原生物學與免疫學實驗病原生物學與免疫學實驗病原生物學與免疫學教研室 2004年2月病原生物學與免疫學實驗室規(guī)則病原生物學與免疫學實驗室規(guī)則 微生物學實驗室是進行微生物培養(yǎng)鑒定及試驗的場所，是一個微生物高度集中的區(qū)域，為了防止微生物感染人體及擴散，保證安全及每次實驗結果的準確性，要求同學遵守下列規(guī)則：一般注意事項一般注意事項l進實驗室穿上實習衣，離室時脫下，要反折，并經(jīng)常進清洗。l書包、衣物等勿帶入實驗室，必要的文具、實驗指導，筆記等帶入后，也要遠離操作部位。l實驗室內要保持安靜，有秩序，不得高聲談笑，或隨便走動以免影響他人實驗。l實驗室內禁止飲食、吸煙和用嘴濕潤鉛筆或標簽等，也不要以手撫摸頭

2、部等部位。l做練習要保持無菌操作操作。以防止臨床標本及純培養(yǎng)物的污染，l吸過菌液的吸管、毛細吸管，要投入含有23來蘇兒或0.1新潔而滅液的玻璃筒中，其它帶菌材料放在指定地點，以防止微生物污染環(huán)境。l若發(fā)生吸入菌液，割破手指等事故，應立即報告老師，進行預防處理。l l愛護公物，節(jié)約使用實驗材料、器材，如損壞公物，應立即向指導教師報告，登記處理。l實驗完畢，應及時清理實驗室，做好衛(wèi)生，關好門、窗、水籠頭、電燈。l離開實驗室前，應在消毒液中將手浸泡510分鐘，再用清水洗凈。發(fā)生意外事故的處理發(fā)生意外事故的處理l皮膚破傷：用生理鹽水洗凈后，涂以2紅汞或2碘酒。l燒傷：涂以凡士林油，5鞣酸或2苦味酸。l

3、化學藥品腐蝕傷：若為強酸，先用大量清水沖洗，再以5碳酸氫鈉或5氫氧化銨溶液中和之；強堿腐蝕則先以大量清水沖洗后，再以5醋酸或5硼酸洗滌中和。 l吸入病原菌菌液：應立即吐人容器內消毒，并用1 1000高錳酸鉀溶液或3雙氧水漱口。l菌液流灑桌面，傾倒適量消毒液于污染面浸泡半小時后抹去，再以清水擦洗干凈。l嚴防火災：試驗完畢立即關閉電閘，煤氣閥門，如系酒精，乙醚、汽油等火種，切忌用水，可撒潑大量沙土等撲滅火苗。實驗一實驗一 細菌的形態(tài)學細菌的形態(tài)學第一周實驗內容l普通光學顯微鏡的使用l細菌基本形態(tài)和特殊結構的觀察l細菌標本染色檢查法 （革蘭氏染色法）l細菌動力檢查法 （懸滴法、壓滴法）目的要求l了解

4、細菌的基本形態(tài)及其特殊結構。l基本掌握顯微鏡的使用和保養(yǎng)。l掌握接種環(huán)的使用及菌液的采取法。l掌握細菌涂片的制備及革蘭氏染色方法。l 熟悉細菌動力檢查法。一、普通光學顯微鏡的使用l顯微鏡的構造圖 l顯微鏡的使用方法l油鏡頭的辨認l顯微鏡的維護油鏡加香柏油的原理l玻璃折射率： n=1.52l香柏油折射率： n=1.515 二、細菌基本形態(tài)和特殊結構的觀察 使用顯微鏡的油鏡觀察各示教片，比較各菌的形態(tài)、大小、排列等；注意芽胞在菌體上的位置、大??；鞭毛形態(tài)、數(shù)最及其位置；莢膜的大小及其與菌體的關系，將觀察結果畫在實驗報告上。1.細菌的三種基本形態(tài)（示教）l球菌：鏈球菌、葡萄球菌。l桿菌：大腸桿菌。l

5、螺形菌：霍亂弧菌。上述示教鏡各一臺/每室 細菌的三種基本形態(tài)示意圖葡萄球菌：葡萄球菌：Figure 1 - A Gram stain of Gram + Staphylococcus cells. 鏈球菌鏈球菌（顯微鏡下示意圖）顯微鏡下的桿菌桿菌(bacillus) Figure 2 - Gram stain of Gram - E. coli cells弧菌弧菌2.細菌的特殊結構觀察（示教）l芽胞示教片：破傷風桿菌。l鞭毛示教片：變形桿菌。l莢膜示教片：肺炎雙球菌。 上述示教鏡各一臺/每室芽孢產(chǎn)芽孢細菌的種類 菌體 （營養(yǎng)細胞）芽胞鞭毛莢膜的觀察：特殊染色特殊染色 負染色負染色 三、細菌標本

6、染色檢查法 l常采用美藍，結晶紫等堿性染料進行染色。多數(shù)染料都是中性有機鹽。據(jù)著色基的不同可分為以下類型：l堿性染料（堿性染料（basic dye）帶正電染料。其陽帶正電染料。其陽離子部分為發(fā)色基團，可與細胞中帶負電的組離子部分為發(fā)色基團，可與細胞中帶負電的組分結合。分結合。l酸性染料（酸性染料（Acid dye）帶負電染料。其陰帶負電染料。其陰離子部分為發(fā)色基團，可與細胞中帶正電的組離子部分為發(fā)色基團，可與細胞中帶正電的組分結合。分結合?；罨罹救旧唵稳旧顾崛旧锾m氏染色復雜染色法普通染色芽孢染色法莢膜染色法細胞壁染色法特殊染色正染色負染色死菌染色細菌染色細菌染色法:負染色負染色

7、染色染色1min 水洗、吸干鏡檢鏡檢簡單染色簡單染色制備涂片標本制備涂片標本染色染色（一）（一）細菌涂片的制備 一般制備涂片包括涂片、干燥、固定三步。 涂片涂片 干燥干燥 固定固定固定的目的：l使細菌的細胞凝固，使菌體與玻片粘得更牢固；l可改變菌體對染料的通透性；l加熱固定可殺死細菌，比較安全。 多種標本涂片標記示意圖l如多種標本，可用蠟筆在玻片上劃為數(shù)格，并于玻片的背面，標明標本的編號。 正面 反面革蘭氏染色法（Gram Stain） l初染：滴加結晶紫染液于涂片上，染1分鐘，水洗，甩干。l媒染：加盧戈氏碘液，1分鐘后水洗，甩干。l脫色：加95酒精數(shù)滴于涂片上，頻頻搖35秒后，斜持玻片，使酒

8、精流去，再加酒精。如此重復23次，直至流下的酒精無色或稍呈淡紫色時為止（約30秒鐘）。水洗，甩干。l復染：以稀釋石炭酸復紅染液復染1分鐘后，水洗，待干或用吸水紙印干，油鏡鏡檢?！静僮鞑襟E】結晶紫初染碘液媒染乙醇脫色復紅復染涂片固定由丹麥醫(yī)生Hans Christian Gram于1884年創(chuàng)立。革蘭氏染色法【結果】【結果】l細菌被染成紫色者，稱為革蘭氏陽性菌；l而細菌染成紅色者，稱為革蘭氏陰性菌；陽性菌陽性菌紫色紫色 陰性菌陰性菌紅色紅色【意義】l鑒別細菌，用本法染色可將細菌分成兩大類。l了解致病性l指導選擇用藥【革蘭氏染色法的原理 】有三種學說。1.等電點學說：革蘭氏陽性細菌的等電點（pH

9、23）比陰性菌（pH45）為低，般染色時溶液的酸堿度約在pH 7左右，電離后陽性菌帶有的陰電荷比陰性菌多。因此，攝取的堿性染料亦較多，不易脫色。2.通透性學說： 革蘭氏陽性菌細胞膜的通透性比陰性菌低，進入細胞的染料和碘液結合生成沉淀，脫色劑較易通過革蘭氏陰性菌的細胞膜，將碘和染料的復合物溶解洗出，故易脫色；陽性菌細胞膜透通性低，故不易脫色。甲菌乙菌初染結晶紫媒染碘液脫色乙醇復染沙黃紫色（G）紅色（G-）革蘭氏染色步驟示意圖細胞壁與革蘭氏染色3.化學學說： 革蘭氏陽性菌細胞內含有某種特殊化學成份，一般認為是核糖核酸鎂鹽與多糖的復合物，它能和料染一煤染劑復合物相互結合，使已著色的細菌不易脫色。四、細菌動力檢查法四、細菌動力檢查法 鞭毛是細菌的運動器官，有鞭毛的細菌，具有運動的能力，能定向地由一個部位泳動到另一個部位。許多桿菌和螺菌或弧菌具有鞭毛，細菌的運動力是細菌特征之一，所以檢查細菌的動力可以鑒別細菌。 檢查細菌動力的方法檢查細菌動力的方法l懸滴法 、l壓滴法、l暗視野顯微鏡法、l半固體瓊脂培養(yǎng)法等。1.懸滴法（示教）l【材料】 l菌種：變形桿菌、葡萄球菌的幼齡（8-12小時）肉湯培養(yǎng)液。l凹玻片、蓋玻片、凡士林?！痉椒ā縧懸滴法見圖1-6 2.壓滴法【材料】 l菌種：變形桿菌、葡萄球菌的幼齡（8-12小時）肉湯培養(yǎng)液。l 蓋玻片、載玻片、鑷子。