中華圓田螺抗菌肽理化性質(zhì)及抑癌活性測定

1、中華圓田螺抗菌肽理化性質(zhì)及抑癌活性測定基金項目：江西省教育廳青年科學(xué)基金項目（GJJ10242）；江西科技師范大學(xué)校級重點項目（KYZ2008ZZ），）；江西科技師范學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)業(yè)、科研項目作者簡介：楊麗麗（1989），女（漢），本科，研究方向：生物工程。* 通信作者楊麗麗1, 王斌1 ,朱化化2 ,李玉萍1 ,劉建濤1,*（1.江西科技師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 江西 南昌 330000；2.瑞萊生物工程有限公司， 廣東 深圳 518000）摘 要：目的篩選中華圓田螺抗菌活性物質(zhì)，檢測其抗腫瘤活性。方法本實驗通過注射大腸桿菌免疫中華圓田螺，收集血淋巴并通過高溫處理制成含有抗菌肽的粗提液，測定其

2、抗菌效果和理化特性。以人體肺腺癌細(xì)胞A549為體外實驗?zāi)Ｐ?，通過細(xì)MTT 實驗，研究中華圓田螺抗菌肽對 人體肺腺癌細(xì)胞A549 細(xì)胞的生長抑制作用。結(jié)果經(jīng)過分離得到含有中華圓田螺抗菌肽的粗提液。粗提液抑菌效果明顯；其抑菌活性隨著處理溫度的升高，處理時間的延長呈現(xiàn)逐步降低的趨勢，但仍表現(xiàn)出較好熱穩(wěn)定性；在弱酸性（pH46）條件下，隨著酸性的降低抑菌活性呈現(xiàn)增加的趨勢，在中性和堿性（pH712）條件下，隨著堿性的增加抑菌活性不斷降低；隨著凍融次數(shù)的增加，抑菌活性略有變化；通過MTT 實驗表明，中華圓田螺抗菌肽對人體肺腺癌細(xì)胞A549 的生長抑制作用隨著濃度的增加而加強(qiáng)。結(jié)論本實驗成功篩選到中華圓田

3、螺抗菌肽，并檢測其在體外對人體肺腺癌細(xì)胞A549 具有抑制生長作用。編輯您好：按照目的 方法等格式修改了摘要關(guān)鍵詞：抗菌肽；中華圓田螺；抗菌效；，理化特性；抑癌活性Bacteriostatic Effect of Antibacterial Peptide from Cipangopaludina Cathayensis and the Determination of Physical and Chemical Properties and Tumor-suppressor Activity YANG Li-li1,WANG Bin1,ZHU Hua-hua2,LI Yu-ping1,LIU

4、 Jian-tiao1,*(1. College of Life Science, Jiangxi Science and Technology University, Nanchang 330000, Jiangxi，China;2. Reliance Biological Engineering Limited Company, Shenzhen 518000,Guangdong， China )Abstract: Objective To screen the antibacterial peptide from the cipangopaludina cathayensis and t

5、est its antiproliferative effects. Methods This study extracts antibacterial peptide preliminary from cipangopaludina cathayensis and determines its antibacterial effects, physical and chemical properties. The human lung adenocarcinoma cell line A549 be used as the model in vitro. MTT, mitotic index

6、 experiment and clone formation experiment be adopted to study the inhibition effect of antibiotic peptide. Results the bacteriostatic effect of the crude extraction is obvious; with the treating temperature increasing, treatment time extending, antimicrobial activity reduce gradually, but still sho

7、w good thermal stability; Under the weak acidity (pH 4-6)conditions, antibacterial activity tended to increase as the acidity reduces. Under the neutral and alkaline (pH 7-12) conditions, antibacterial activity reduces as the alkalinity increases; With freezing and thawing times increasing, antibact

8、erial activity changes slightly; crude extraction shows inhibition to human lung adenocarcinoma cell line A549 cells proliferation. Conclusion The antibiotic peptide from cipangopaludina cathayensis has significant inhibition effect on human lung adenocarcinoma cell line A549.編輯您好：按照中文摘要修改了Key words

9、: antibacterial peptide; cipangopaludina cathayensis; effect of antibiosis; physicochemical property; tumor-suppressor activity 抗菌肽是一類免疫效應(yīng)因子，它在生物機(jī)體的先天免疫系統(tǒng)中起到重要的作用1編輯您好：文獻(xiàn)更新了，具有廣譜抗菌、抗寄生蟲、抗病毒、抗癌、抗氧化等多種生物學(xué)活性2。迄今為止，已有2000多種被分離純化。其抗癌作用的機(jī)理主要包括：細(xì)胞殺傷作用、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、影響信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用等3-7。由于抗菌肽具有低毒或無毒，對癌細(xì)胞一定的特異選擇的特點，使

10、得人們越來越關(guān)注于抗菌肽的研究。中華圓田螺，學(xué)名Cipangopaludina cahayensis，俗名田螺、香螺，英文名Mudsnail。屬軟體動物門、腹足綱、田螺科、圓田螺屬，廣泛分布各地，淡水湖泊、水庫、稻田、池塘溝渠等，一年四季生產(chǎn)8。中華圓田螺營養(yǎng)豐富且具有一定的藥效作用，在本草拾遺中記載：煮食之，利大小便，去腹中結(jié)熱，目下黃，腳氣沖上，小腹結(jié)硬，小便赤澀，腳手浮腫；生浸取汁飲之，止消渴；碎其肉敷熱瘡9。目前對中華圓田螺的研究和資源開發(fā)利用主要集中在飼養(yǎng)和營養(yǎng)價值的研究，但對其體內(nèi)的抗菌肽的分離、純化及其抗癌生物活性作用的研究至今未見報道。因此，本研究以中華圓田螺為研究對象，并對其

11、體內(nèi)的抗菌肽進(jìn)行研究。1 材料及方法1.1材料與儀器中華圓田螺購自南昌墩子塘市場；人體肺腺癌細(xì)胞A549 cell和大腸桿菌（Escherichia coli）K12D31菌株本實驗室保存；抑酶肽、苯基硫脲，蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉購自Sigma 公司；NaCl、HCl、NaOH購自廣州化學(xué)試劑廠。以上試劑均為分析純。生物安全柜：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；D-37520冷凍離心機(jī)：德國Thermo公司；微量移液器：德國Eppendorf公司；生化培養(yǎng)箱：上海博訊實業(yè)有限公司；蒸汽滅菌器：上海博訊實業(yè)有限公司。1.2實驗方法 1.2.1中華圓田螺的飼養(yǎng)將市場上買來的中華圓田螺用清水飼養(yǎng)4 d5

12、 d。每天換一次清水。1.2.2抗菌物質(zhì)粗提液的制備取中華圓田螺，用報紙將其瀝干。注射入少量大腸桿菌，誘導(dǎo)其產(chǎn)生抗菌肽，8 h后將其尾部螺紋敲碎，擠壓螺口，使血淋巴流入預(yù)冷并加有苯基硫脲（20 mol/L）與抑酶肽（20 g/mL）的離心管中。然后在冰水浴中將螺殼敲碎，用剪刀剪碎螺肉，收集流出的液體。合并兩次的液體。將收集到的液體于4 ，10 000 r/min，離心30 min，取上清，將上清液放入沸水浴中加熱10 min后，立刻再次放入冰水浴中冷卻。將處理后的樣品于4 ，10 000 r/min，離心30 min，取上清液，即得粗提液4-5。1.2.3抑菌活性測定抑菌活性測定的步驟如下：將

13、指示菌轉(zhuǎn)接到新鮮的液體培養(yǎng)基中，劇烈振蕩培養(yǎng)至OD600=0.40.6，然后按1 %的比例加入到含1 %瓊脂的固體培養(yǎng)基中，充分混勻，再迅速倒入平皿中。待培養(yǎng)基冷卻后，用打孔器在瓊脂板上打孔（直徑為7 mm）。以無菌水與苯基硫脲、抑酶肽作為對照，每孔60 uL，37 培養(yǎng)1d2d，抑菌活性用抑菌圈直徑表示（抑菌圈直徑=總直徑孔直徑），每組實驗重復(fù)5次6-7 。1.2.4抗菌物質(zhì)的理化性質(zhì)1.2.4.1 溫度對抗菌物質(zhì)的抑菌活性影響取粗提液在50、80、100 下分別處理，50、80、100 的處理時間分別為：10、20、30、45、60、80、100 min。處理之后的樣品立即于4 ，10 0

14、00 r/min，離心20 min，取上清測定其抗菌活性，每組實驗重復(fù)5次。1.2.4.2 pH對抗菌物質(zhì)的抑菌活性影響用HCl和 NaOH將粗提液的pH值分別調(diào)為4、5、6、7、8、9、10、11和12，迅速混勻并靜置30 min后，410 000r/min離心5 min，取上清，測定其抗菌活性，每組實驗重復(fù)5次。 1.2.4.3不同凍融次數(shù)對抗菌物質(zhì)的抑菌活性影響取100 uL粗提液，在-20 冷凍，25 下解凍，凍融次數(shù)分別為5、10、15和20次，分別檢測抑菌活性，以0處理次數(shù)為對照，每組實驗重復(fù)5次10。1.2.5抑癌活性測定選取對數(shù)生長期的人體肺腺癌細(xì)胞A549細(xì)胞，然后用0.25

15、 胰蛋白酶消化，后用含10 FBS的RPMI1640培養(yǎng)液制成5×104個細(xì)胞mL，并接種于96孔板中，每孔100 uL。接種完成后置37 5 %CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，吸去上清。對照組：加入同體積的無添加福壽螺多糖的培養(yǎng)液100 uL；試驗組：分別加入含有終濃度為20、50、100、200 ug/mL的多糖培養(yǎng)液100 uL，每種濃度均4個平行樣品，繼續(xù)培養(yǎng)4、8、24 h后，及時更換新培養(yǎng)液，在每孔加入含5 mg/ml MTT的無Ca2+、Mg2+的PBS液20 uL，37 繼續(xù)培養(yǎng)4h，除去上清，每孔加堿化二甲基亞砜150 uL，37 溫育30 min，時不時輕微振蕩，完全

16、溶解后，用酶標(biāo)儀測定吸光度（A）值（570 nm）按如下公式計算：抑瘤率=（對照組A值一實驗組A值）對照組A值×100 2結(jié)果及討論2.1粗提液抑菌效果粗提液抑菌效果，見表1.由表1可知，粗提液抑菌效果明顯。而空白對照組則沒有明顯的抗菌效果。表1 粗提液抑菌效果測定Table 1 Antibacterial effect of crude extract編輯您好：添加了英文題目 試液抑菌圈直徑/mm粗提液8.9±0.89無菌水與苯基硫脲、抑酶肽混合液0由表1可知，粗提液抑菌效果明顯。而空白對照組則沒有明顯的抗菌效果。2.2溫度對抗菌物質(zhì)抑菌活性的影響溫度對抗菌物質(zhì)抑菌活性的

17、影響，見表2.由表2可知，粗提液經(jīng)50 、80 水浴處理，抗菌肽抑菌活性影響不大。而經(jīng)100 水浴處理，在前30 min內(nèi)粗提液的抑菌活性影響不大，水浴處理達(dá)到或超過45 min時活性開始顯著降低。在100 min內(nèi)的各個相同時間段內(nèi)，50 水浴處理粗提液的抑菌活性與80水浴處理的抑菌活性相差不顯著，而100 水浴處理粗提液的抑菌活性則與以上兩個溫度處理的抑菌活性相差懸殊?？傮w而言，隨著處理溫度的升高，處理時間的延長粗提液的抑菌活性呈現(xiàn)逐步降低的趨勢。但實驗結(jié)果仍表明，粗提液的抗菌物質(zhì)具有較好熱穩(wěn)定性。表2 不同溫度不同處理時間對抗菌物質(zhì)抑菌活性的影響Table 2 Effect of dif

18、ferent temperature and time on the antibacterial of crude extract時間/min抑菌圈直徑/mm50 80 100 107.3±1.047.3±1.045.7±0.29207.2±0.766.8±0.295.0±0.50307.0±0.506.7±0.294.7±0.29456.7±0.766.3±0.293.3±0.29606.7±0.766.3±0.762.7±0.29806.2&

19、#177;0.296.2±1.152.5±0.501006.0±0.505.8±0.582.0±0.50由表2可知，粗提液經(jīng)50 、80 水浴處理，抗菌肽抑菌活性影響不大。而經(jīng)100 水浴處理，在前30 min內(nèi)粗提液的抑菌活性影響不大，水浴處理達(dá)到或超過45 min時活性開始顯著降低。在100 min內(nèi)的各個相同時間段內(nèi)，50 水浴處理粗提液的抑菌活性與80水浴處理的抑菌活性相差不顯著，而100 水浴處理粗提液的抑菌活性則與以上兩個溫度處理的抑菌活性相差懸殊?？傮w而言，隨著處理溫度的升高，處理時間的延長粗提液的抑菌活性呈現(xiàn)逐步降低的趨勢。但實

20、驗結(jié)果仍表明，粗提液的抗菌物質(zhì)具有較好熱穩(wěn)定性。2.3 pH值抗菌物質(zhì)抑菌活性的影響pH抗菌物質(zhì)抑菌活性的影響，見表3。實驗過程中發(fā)現(xiàn)，粗提液的pH在4與5之間。而且粗提液的抑菌圈直徑也介于pH4和5的抑菌圈直徑之間。當(dāng)pH為6時，粗提液的抑菌活性達(dá)到最大。在弱酸性（pH46）條件下，隨著酸性的降低粗提液的抑菌活性呈現(xiàn)增加的趨勢，而且差別明顯。在中性和堿性（pH712）條件下，隨著堿性的增加粗提液的抑菌活性不斷降低，pH達(dá)到12時，粗提液的抑菌活性明顯下降（見表3），說明在弱酸性下能促進(jìn)中華圓田螺產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)的活性，在堿性條件下其受影響較大。表3 不同pH對抗菌物質(zhì)抑菌活性的影響Table

21、3 Effect of different pH on the antibacterial of crude extractpH抑菌圈直徑/mm49.0±0.94510.2±0.45612.2±0.8478.6±0.8988.7±0.8497.7±0.76107.6±0.89118.0±1.0125.5±0.35實驗過程中發(fā)現(xiàn)，粗提液的pH在4與5之間。而且粗提液的抑菌圈直徑也介于pH4和5的抑菌圈直徑之間。當(dāng)pH為6時，粗提液的抑菌活性達(dá)到最大。在弱酸性（pH46）條件下，隨著酸性的降低粗提液的抑菌活性

22、呈現(xiàn)增加的趨勢，而且差別明顯。在中性和堿性（pH712）條件下，隨著堿性的增加粗提液的抑菌活性不斷降低，pH達(dá)到12時，粗提液的抑菌活性明顯下降（見表3），說明在弱酸性下能促進(jìn)中華圓田螺產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)的活性，在堿性條件下其受影響較大。2.4不同凍融次數(shù)對抗菌物質(zhì)的抑菌活性影響不同凍融次數(shù)對抗菌物質(zhì)的抑菌活性影響，見表4。隨著凍融次數(shù)的增加，粗提液的抑菌活性略有變化，但各處理組與對照組之間差異不顯著，說明中華圓田螺產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)在凍融的情況下比較穩(wěn)定（見表4）。表4 不同凍融次數(shù)對粗提液抑菌活性的影響Table 4 Effect of different freezing and thawing

23、 cycle on the antibacterial of crude extract凍融次數(shù)51015200抑菌圈直徑/mm8.0±0.547.5±0.57.0±0.147.0±0.228.9±0.892.5抑癌活性測定已知活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物甲臜（formation），該物質(zhì)沉在細(xì)胞中，但是死細(xì)胞沒有這樣的功能。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶物形成的量與細(xì)胞數(shù)呈正比。本實驗通過該方法，用酶標(biāo)儀測定在570 nm波長處各組分A549cell的光度值，間接反映其活細(xì)胞數(shù)量。，結(jié)果見表5.表5

24、粗提液對A549cell細(xì)胞體外增值的影響Table 5 Effect of crude extract on proliferation of A549 in vitro濃度/（um/mL）4 h8 h24 h00.360±0.0130.372±0.0150.410±0.016200.324±0.0130.311±0.0120.283±0.019500.305±0.0150.287±0.0120.234±0.0171000.266±0.0180.253±0.0170.221±

25、;0.0202000.215±0.0210.201±0.0140.175±0.012表5結(jié)果顯示，隨著抗菌物質(zhì)濃度的增加或作用時間的延長，各組A549cell的吸光度值相對減小，間接說明其活細(xì)胞數(shù)量也隨之減少，體現(xiàn)出中華圓田螺抗菌物質(zhì)對A549cell的增殖的確有抑制作用。從實驗結(jié)果中得出，相同濃度的中華圓田螺抗菌物質(zhì)對A549cell增殖的抑制效應(yīng)隨著作用時間的延長而增強(qiáng)，不同濃度中華圓田螺抗菌物質(zhì)在作用時間相同的情況下，隨處理濃度增加對A549cell增殖的抑制效應(yīng)增強(qiáng)。3.結(jié)論與討論編輯您好：對該部分的內(nèi)容進(jìn)行了修改抗菌肽作為一種非特異性免疫分子，具有廣譜高

26、效抗菌及對腫瘤細(xì)胞有廣譜殺傷作用活性?？咕挠捎谄涮厥獾目鼓[瘤機(jī)制,不易產(chǎn)生耐藥性,以及對哺乳動物正常細(xì)胞毒性較低等特點,已經(jīng)成為抗腫瘤藥物研發(fā)的熱點之一。目前，人們在不同的生物中都發(fā)現(xiàn)了抗菌肽。 但抗菌肽的研究開發(fā)中還是有一些亟需解決的問題，如來源問題。本文以中華圓田螺為研究對象，可為抗菌肽的來源提供了一種可行的方式。本研究利用大腸桿菌誘導(dǎo)，使中華圓田螺血淋巴產(chǎn)生具有抗菌活性的物質(zhì)，經(jīng)加熱處理等方法初步分離得到含有抗菌肽的粗提液，該抗菌肽是一種具有較強(qiáng)熱穩(wěn)定性的偏堿性小分子蛋白。經(jīng)研究顯示，室溫放置短時間及反復(fù)凍融對抗菌活性無明顯影響，對人體肺腺癌細(xì)胞A549的增殖具有一定的抑制作用，表明該

27、抗菌肽具有一定的抑癌作用。這與從其他的動物中提取的抗菌肽具有相似性，如劉紅玉等發(fā)現(xiàn)從中國林蛙中提取的抗菌肽對人胃癌細(xì)胞SGC7901生長具有抑制作用12，陳麗萍等發(fā)現(xiàn)中華大蟾蜍中的抗菌肽對人大腸癌細(xì)胞SW480的生長具有抑制作用13。目前我們正在對所誘導(dǎo)的中華圓田螺抗菌物質(zhì)作進(jìn)一步的分離純化，以便找到該抗菌肽或抗菌蛋白的基因。參考文獻(xiàn)編輯您好：文獻(xiàn)更新了1 Lai Y, Gallo RL，AMPed up immunity: how antimicrobial peptides have multiple roles in immune defense J. Trends Immunol, 2

28、009, 30(3): 131-1412 Steiner H, Hultmark D, Engstrm A, et al. Sequence and specificity of two antibacterial proteins involved in insect immunity J. Nature, 1981, 292: 246-2483 Peng K S， She R P，Yang Y R，et al. Anti-adherence of antibacterial peptides and oligosaccharides and promotion of growth and disease r