植物次生代謝物的提取分離

1、植物次生代謝物的提取分離實驗一銀杏葉黃酮類化合物提取及含量的測定一、實驗目的1. 通過本實驗學習植物黃酮類化合物提取的一般方法2. 學習植物葉片黃酮類化合物含量測定的方法3. 學習利用薄層色譜法鑒別黃酮類化合物二、基本原理(1) 黃酮類化合物的提取銀杏葉(Ginkgo biloba L.)中黃酮類化合物有特殊的藥效，黃酮類化合物(flavo no ids)主要是指兩個苯環(huán)(A-與B-環(huán))通過中央三碳鏈相互連接而成的一 系列化合物，其基本骨架為 C6-C3-C6,母體結構式如下：是植物次生代謝產物之一，普遍存在于維管植物中，大部分以苷的形式存在，一 部分以游離形式存在，種類較多，分布廣泛，已發(fā)現(xiàn)

2、的天然黃酮類化合物有十多 個大類3000多種。黃酮類化合物具有明顯的生物活性，如對心血管系統(tǒng)有明顯的 藥理作用以及抗肝臟毒性作用等。黃酮類化合物的提取主要是根據(jù)被提取物的性質及伴存的雜質來選擇適合 的提取溶劑，苷類和極性較大的苷元，一般用乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、水 或某些極性較大的混合溶劑(如甲醇-水：1 : 1)進行提取。大多數(shù)苷元宜用極性 較小的溶劑如乙醚、氯仿、乙酸乙酯等來提取。但乙醇和甲醇是最常用的黃酮類 化合物的提取溶劑。(2) 黃酮類化合物含量的測定大部分黃酮類化合物分子結構中含有- 0H和C = 0，所以可以和鋁離子絡 合形成有色物質，這些有色物質在 400500nm有吸收現(xiàn)

3、象，據(jù)此可以采用硝酸 鋁比色法來測定黃酮類化合物的含量。(3) 黃酮類化合物的薄層層析薄層層析是檢驗黃酮類化合物是否存在的強有力的方法，通常用的薄層層析 技術有紙層析、聚酰胺薄層層析、硅膠薄層層析、氧化鋁薄層層析技術等，其中 紙層析、聚酰胺薄層層析技術對黃酮類化合物的分離方法較好。 黃酮類化合物在 層析材料上展開后，經過 1%的 AlCl 3溶液顯色后在 365nm 紫外燈下即可觀察到 顏色斑點。 通常在紙層析上觀察到的是棕色斑點， 在聚酰胺薄層層析上觀察到的 是黃色或黃綠色斑點。三、實驗所需試劑、儀器及材料(1) 試劑70%(v/v)的乙醇、正丁醇、冰醋酸、石油醚、氯仿、甲醇、 1%(w/v

4、)的AICI3 溶液、10% (m/m)的 AI(NO 3)3 溶液、5% (m/m)的 NaNO2 溶液、4%的 NaOH 溶液、 蘆丁。(2) 儀器365nm紫外分析儀、分光光度計、旋轉蒸發(fā)器、真空泵、水浴鍋、層析缸、容 量瓶、10ml具塞刻度試管、燒瓶、冷凝管、噴壺、毛細管、布氏漏斗及其他必 備玻璃儀器。(3) 材料濾紙或聚酰胺薄膜。四、實驗步驟1. 銀杏葉黃酮類化合物的提取及薄層定性檢測(1) 準確稱取10g銀杏葉干粉，用石油醚反復浸提 2次以除去葉綠素及其它干擾 含量測定的脂溶性雜質，每次 30mi n,然后過濾；將石油醚浸提后的銀杏葉全部轉入 150ml的燒瓶中，按物料比為1 :

5、10再加入100ml 80%(v/v)的乙醇水域加熱回流提取 40min;(3) 將提取液抽濾后濃縮定容至 10ml。(4) 以蘆丁為對照，用玻璃毛細管點銀杏提取液濃縮樣于聚酰胺薄膜上，以氯 仿：甲醇二8: 2上行展開，以1 %的三氯化鋁乙醇溶液顯色并置于紫外分析 儀(365nm)下觀察；(5) 如果實驗室沒有聚酰胺薄膜材料，也可以用紙層析代替，具體做法與用聚酰 胺薄膜材料相似，唯一的區(qū)別是展開劑不同，紙層析采用正丁醇：冰醋酸： 水 =4： 1 ： 2 展開系統(tǒng)。2. 銀杏葉黃酮類化合物含量的測定(1) 工作曲線的繪制a. 精密稱取蘆丁樣品(在120C烘干至恒重)5mg，用50%乙醇溶解定容至

6、 50mL 得以蘆丁為標準的標準溶液；b. 分別取 2、4、6、8、10ml 蘆丁溶液置于 25ml 容量瓶中，再分別吸取 1ml 置于 10ml 刻度試管中，采用硝酸鋁比色法進行顯色測定；c. 精密加入5%亞硝酸鈉溶液0.3mL,搖勻放置5min，再精密加入10%硝酸 鋁溶液0.3mL搖勻放置5min，最后加入1 moL/L氫氧化鈉溶液4.0mL，用蒸餾 水稀釋至刻度，搖勻放置15min，于510nm(在400520nm間經掃描，確定510nm 處為最大吸收波長)波長處比色測定，同時做空白對照，重復三次，繪制標準曲 線并計算回歸方程。(2) 銀杏葉提取液黃酮類化合物含量的測定a. 吸取 1m

7、L 提取液的濃縮液于 10ml 刻度試管中，按工作曲線的制作方法來 測定溶液的吸光度值；b. 用所得工作曲線的方程來計算總黃酮的含量。思考題：1. 用硝酸鋁比色法測定植物黃酮類化合物含量的原理是什么？為何測定植物葉片黃酮類化合物的含量時最好先用石油醚浸提？實驗二 銀杏葉黃酮類化合物的初步分離一、實驗目的1. 通過本實驗學習黃酮類化合物的初步分離即黃酮類化合物與非黃酮類化合 物的分離方法2. 學習利用柱色譜技術來分離植物葉總黃酮的方法二、基本原理 黃酮類化合物的分離包括黃酮類化合物與非黃酮類化合物的分離， 以及黃酮 類化合物單體的分離。 銀杏葉片非黃酮類化合物主要包括脂類、 水溶性物質如蛋 白質

8、、多糖等以及其他種類的次生代謝物， 根據(jù)這些特點， 常采用的初步分離方 法有：溶劑萃取法，常用的萃取溶劑有乙酸乙酯、乙醚、正丁醇等，通常這些溶 劑萃取法初步將黃酮類化合物分成幾個極性部分； 聚酰胺柱吸附法， 這是利用大 多數(shù)黃酮類化合物具有酚羥基， 可被聚酰胺吸附， 因此即可將其與不含酚羥基的 化合物分離；此外，目前常用的還有 D101 大孔樹脂吸附法，主要是利用大孔 樹脂的多孔性特點進行分離的， 采用不同極性的溶劑進行洗脫， 即可得到粗黃酮 類化合物產品。三、實驗所需試劑、儀器及材料(4) 試劑70%(v/v)的乙醇、正丁醇、冰醋酸、氯仿、甲醇、 5%的a萘酚乙醇溶液、0.1%的印三酮乙醇溶

9、液、1%(w/v)的AICI3溶液、蘆丁。(5) 儀器 低速離心機、 365nm 紫外分析儀、旋轉蒸發(fā)器、真空泵、水浴鍋、層析缸、 容量瓶、噴壺、毛細管、層析柱、三角瓶等其它必備玻璃儀器。(6) 材料D 1 0 1大孔吸附樹脂、濾紙或聚酰胺薄膜。四、實驗步驟1. 銀杏葉黃酮類化合物的提取液浸膏的制作(1)準確稱取10g銀杏葉干粉，用石油醚反復浸提 2次以除去葉綠素及其它干擾 含量測定的脂溶性雜質，每次30min，然后用80%的乙醇熱水回流提取40min后過濾濃縮得流浸膏；(2) 將銀杏葉浸膏轉溶于水后再低速(100g)離心10min以除去易堵塞樹脂的脂溶 性成分，然后將上清液濃縮至 2ml 左右；(3) 用滴管將濃縮液加樣于 D-101 大孔吸附樹脂柱；(4) 先用去離子水