淀粉酶產(chǎn)生菌的篩選

1、實(shí)驗(yàn)一淀粉酶產(chǎn)生菌的篩選及酶活力測定指導(dǎo)老師：辛樹權(quán)生命科學(xué)學(xué)院 08 級生物技術(shù)（三）班 豆豆同組人： xx xxx摘要 ：自然界是微生物的大本營，實(shí)驗(yàn)室微生物幾乎都是從自然界中選育出來的。我們從學(xué)校的花壇中采集一些土壤樣本，拿到實(shí)驗(yàn)室中，進(jìn)行淀粉產(chǎn)生菌的篩選。 利用土壤制成菌液，將其涂抹在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上進(jìn)行純化，再用 淀粉培養(yǎng)基培養(yǎng)， 最后通過淀粉透明圈的大小來判斷淀粉產(chǎn)生菌產(chǎn)淀粉的能力。 再使用分光光度計精確測量淀粉酶的酶活力。 關(guān)鍵詞 ： 淀粉酶；分離；純化；透明圈；酶活力；搖瓶；分光光度計一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?：1、學(xué)習(xí)從土壤中分離微生物的方法；2 、學(xué)習(xí)淀粉酶產(chǎn)生菌的篩選方法3、了解

2、分光光度計法測定酶活力的原理及方法。二、實(shí)驗(yàn)原理 ：土壤中含有大量的微生物，將土壤稀釋液涂在不同類型的培養(yǎng)基上，在適 宜的環(huán)境中培養(yǎng)幾天，細(xì)菌或者是其他的微生物便能在平板上生長繁殖，形成 菌落。將初次篩選得到的微生物接到淀粉培養(yǎng)基上培養(yǎng)，因?yàn)橹挥心軌虍a(chǎn)生淀 粉酶的細(xì)菌才能夠利用培養(yǎng)集中的淀粉成分來完成自身的生命活動，才能夠生 存。故在淀粉培養(yǎng)基上長出的菌便是淀粉產(chǎn)生菌。在培養(yǎng)基上滴碘液，淀粉被 分解掉的部分不顯現(xiàn)藍(lán)色，出現(xiàn)透明圈，可以通過透明圈的大小來初步判斷菌 種產(chǎn)淀粉的能力。淀粉酶是指一類能催化分解淀粉分子中糖苷鍵的酶的總稱，主要包括a -淀粉酶和B-淀粉酶等，a -淀粉酶可從淀粉分子內(nèi)部

3、切斷淀粉的a -1,4糖苷鍵，形成麥芽糖、含有6個葡萄糖單位的寡糖和帶有支鏈的寡糖，是淀粉的粘 度下降，因此又稱為液化型淀粉酶。淀粉遇碘呈藍(lán)色。這種淀粉-碘復(fù)合物在660nm處有較大的吸收峰，可用分光光度計測定。隨著酶的不斷分作用，淀粉 長鏈被切斷，生成小分子的糊精，使其對碘的藍(lán)色反應(yīng)逐漸消失，因此可以根 據(jù)一定時間內(nèi)藍(lán)色消失的程度為指標(biāo)來測定a -淀粉酶的活力。三、實(shí)驗(yàn)器材及試劑：1. 、材料：長春師范學(xué)院家屬樓前小菜園2培養(yǎng)基：(1) 分離培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基(牛肉膏 3g、蛋白胨10g、 NaCI 5g、溶于1000mL蒸餾水中，再加入15g瓊脂粉，pH調(diào)至7.2 , 121C

4、 滅菌15min,待冷卻至50C左右時，于超凈工作臺倒平板)(2) 篩選培養(yǎng)基：淀粉培養(yǎng)基(可溶性淀粉 20g,硝酸鉀1g,磷酸氫 二鉀0.5g, 氯化鈉0.5g,硫酸鎂0.5g,硫酸亞鐵0.01g,瓊脂20g, 水1000毫升，調(diào)整pH值到7.27.4。)(3) 搖瓶培養(yǎng)：淀粉培養(yǎng)液。3、試劑：碘液、2河溶性淀粉、pH6.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、標(biāo)準(zhǔn)糊精溶液、0.5mol/L乙酸、0.85%生理鹽水。4、器材:培養(yǎng)皿、錐形瓶、高壓滅菌鍋、超凈工作臺、恒溫水浴鍋、分光光度計。四、實(shí)驗(yàn)步驟 ：1、淀粉產(chǎn)生菌的篩選：（1）采集土樣，并用無菌水稀釋成菌懸液；（2）配置牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基及淀粉

5、培養(yǎng)基，倒平板備用； （ 3）將制好的菌懸液與超凈工作臺上涂到牛肉膏蛋白胨平板上，于37攝氏度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一天；（4）挑取整個菌落，將其移入淀粉培養(yǎng)基中，繼續(xù)放在 37 攝氏度培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)兩天；（5）將碘液滴在平板上，觀察透明圈的大小。2、酶活力測定：（ 1）選產(chǎn)生透明圈最大的菌株進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，將菌溶于5ml 無菌生理鹽水中，吸取此培養(yǎng)液加入淀粉培養(yǎng)液中， 30 攝氏度搖瓶培養(yǎng) 72h。（2）酶液稀釋：取發(fā)酵液進(jìn)行4000r/min離心5min,取上清液，用緩沖液適當(dāng)稀釋。（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：準(zhǔn)備七支試管,按照下表配置混合液。使用分光光度計策規(guī)定各管 溶液在660nm下的ODf直。然后以淀粉

6、濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)， 做標(biāo)準(zhǔn)曲線。（4）酶活力測定取稀釋的粗酶液也按照下表中七號管的要求配置混合液，測得吸光度后，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的淀粉濃度，求出被酶消耗 的淀粉量管號1234567 （樣品）淀粉稀釋液/ml2(0%)2(0.2%)2(0.5%)2(1.0%)2(1.5%)2(2.0%)2(2.0%)緩沖液/ml111 111140攝氏度水浴保溫5min蒸餾水/ml111 1110粗酶液/ml000 000140攝氏度水浴保溫30min,然后放入沸水浴5min稀碘液/ml111 1111（5）酶活力測定：酶活力以每毫升粗酶液在40攝氏度，pH6.0的條件下每小時所分解的淀 粉毫克

7、數(shù)來衡量。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1淀粉產(chǎn)生菌的篩選：淀粉產(chǎn)生菌透明圈的檢驗(yàn)圖(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線:培養(yǎng)基中含有淀粉，淀粉產(chǎn)生菌具 有產(chǎn)生淀粉酶的能力，淀粉酶能將 培養(yǎng)基中的淀粉分解掉。 當(dāng)在培養(yǎng) 基上滴加稀碘液時，含有淀粉的部 分被染為藍(lán)色，而被淀粉酶消耗掉 淀粉的部分則表現(xiàn)為不著色的透 明圈。根據(jù)透明圈的大小可粗估出 不同淀粉產(chǎn)生菌的產(chǎn)淀粉酶能力 大小，透明圈越大則產(chǎn)淀粉酶能力 越強(qiáng)。2、酶活力測定:(1)實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù):管號1234567OD66000.2350.5841.1071.3751.7881.540(3) 計算：樣品的 OD660=1.540查標(biāo)準(zhǔn)曲線可得：淀粉含量 =1.540/0.047=3

8、2.766mg 初始淀粉含量=2g/100mlx 2ml=0.04g=40mg被消耗的淀粉含量=40mg 32.766mg=7.234mg酶活力=7.234mg/(1mlx 0.5h)=14.468 mg/(ml h)六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 ：平板菌落水解圈直徑大小受許多因素的影響 , 例如菌種特性、接種量 大小、培養(yǎng)時間、酶的穩(wěn)定性、溫度范圍、平板厚度等。繪制的淀粉含 量標(biāo)準(zhǔn)曲線也會受實(shí)驗(yàn)室環(huán)境影響及誤差而造成不準(zhǔn)確，酶活力的表示 方法也有多種，僅是一個相對的數(shù)值。七、參考文獻(xiàn)：1 吳根福、楊志堅 . 發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)指導(dǎo) . 北京：高等教育出版社， 2006.2 王弋博 , 李博, 李三相 , 張海林 , 金文晶 . 異淀粉酶產(chǎn)生菌的分離純 化及生長特性 . 青海師范大學(xué)學(xué)報， 2003.3 王麗麗，儀宏，田莊，李志軍 . A2 淀粉酶產(chǎn)生菌的平板篩選法的研 究與改進(jìn) . 河北輕化工學(xué)院學(xué)報， 1998.4 李艷 . 發(fā)酵工程原理與技術(shù) . 北京：高等教育出版社， 2007.5 吳燕萍、金其榮、李迅 . 微生物法生產(chǎn)普魯蘭酶的研究 J . 生物技術(shù) ,1998 ，8(6):14-17.6 唐蕾. 耐熱性普魯蘭酶進(jìn)展 J . 天津微生物 ,1983.7 袁勤生.應(yīng)用酶學(xué)M.上