基于二代測(cè)序技術(shù)在頭頸部鱗癌驅(qū)動(dòng)基因篩選及個(gè)體化治療中的應(yīng)用-國(guó)家腫瘤中心個(gè)體化醫(yī)學(xué)平臺(tái)建設(shè)項(xiàng)目申報(bào)書

1、編號(hào)： 項(xiàng)目類別：生物樣本庫(kù)建設(shè)項(xiàng)目 R分子診斷平臺(tái)建設(shè)項(xiàng)目國(guó)家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心個(gè)體化醫(yī)學(xué)平臺(tái)建設(shè)項(xiàng)目申報(bào)書項(xiàng)目名稱：基于二代測(cè)序技術(shù)在頭頸部鱗癌驅(qū)動(dòng)基因篩選及個(gè)體化治療中的應(yīng)用申請(qǐng)資助經(jīng)費(fèi)數(shù)額：10萬(wàn)元項(xiàng)目負(fù)責(zé)人：王旭東主承擔(dān)科室：頜面耳鼻喉科聯(lián)系人：王旭東聯(lián)系電話：通訊地址：天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院E-mail: WXD.1133填報(bào)日期：2014/07/28 二一四年七月一、項(xiàng)目信息表項(xiàng)目基本信息項(xiàng) 目 名 稱基于二代測(cè)序技術(shù)在頭頸部鱗癌驅(qū)動(dòng)基因篩選及個(gè)體化治療中的應(yīng)用所屬專項(xiàng)名稱國(guó)家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心個(gè)體化醫(yī)學(xué)平臺(tái)建設(shè)項(xiàng)目項(xiàng)目類別生物樣本庫(kù)建設(shè)項(xiàng)目 R分子診

2、斷平臺(tái)建設(shè)項(xiàng)目現(xiàn)處階段應(yīng)用基礎(chǔ)研究起止時(shí)間2014年8月-2017年8月項(xiàng)目主要優(yōu)勢(shì)社會(huì)效益顯著技術(shù)領(lǐng)域醫(yī)藥應(yīng)用領(lǐng)域應(yīng)用基礎(chǔ)研究技術(shù)來(lái)源自有前期資助情況項(xiàng)目負(fù)責(zé)人及項(xiàng)目組情況項(xiàng)目負(fù)責(zé)人姓名王旭東性別男年齡47職務(wù)科室副主任職稱主任醫(yī)師學(xué)位博士學(xué)位專業(yè)腫瘤學(xué)畢業(yè)院校天津醫(yī)科大學(xué)留學(xué)國(guó)別美國(guó)回國(guó)日期2010.08.人才種類院跨世紀(jì)人才身份證話23340123傳真手機(jī)130111338181電子郵箱wxd.1133其他主要成員姓名性別年齡所在單位身份證號(hào)學(xué)位職稱吳延升男天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)士主治醫(yī)師岳愷男天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)

3、士醫(yī)師劉速女天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)士碩士生何清華男天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)士碩士生段遠(yuǎn)勝女天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)士碩士生總?cè)藬?shù)留學(xué)回國(guó)人數(shù)其中（按職稱）培養(yǎng)人才正高級(jí)副高級(jí)中級(jí)初級(jí)其它博士后博士生碩士生7110113022其他實(shí)施單位情況單位名稱主要承擔(dān)研究任務(wù)第一合作單位第二合作單位協(xié)作單位項(xiàng)目簡(jiǎn)介立項(xiàng)目的與必要性(限250字以內(nèi))頭頸部鱗癌是頭頸部常見(jiàn)的惡性腫瘤，是嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾患。其具有較強(qiáng)的侵襲能力，易于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,臨床資料顯示復(fù)發(fā)

4、和轉(zhuǎn)移是影響預(yù)后的重要因素。目前，盡管采用包括手術(shù)治療、化學(xué)治療、放射治療和靶向治療等綜合治療手段使局部控制率有所改善，但5年生存率仍難于有效提高。篩選與頭頸部鱗癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的驅(qū)動(dòng)基因，預(yù)測(cè)腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，指導(dǎo)腫瘤的個(gè)體化治療以有效提高患者的生存率，是臨床亟待解決的實(shí)際問(wèn)題。工作基礎(chǔ)及已具備條件(限200字以內(nèi))申請(qǐng)者及其研究團(tuán)隊(duì)多年來(lái)長(zhǎng)期從事頭頸部鱗癌轉(zhuǎn)移機(jī)制及靶向治療的研究，承擔(dān)多項(xiàng)教委及科委課題，積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，熟練掌握分子生物學(xué)的各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)。已發(fā)表相關(guān)論文5篇。所在的頭頸外科，每年完成頭頸部鱗癌患者手術(shù)300余例，臨床標(biāo)本豐富，能夠滿足課題的需要。與天津市"腫瘤防

5、治"重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室有良好的合作關(guān)系、可以保證二代測(cè)序的順利完成。 總體目標(biāo)(限200字以內(nèi))總體目標(biāo)：1）應(yīng)用二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)已知癌相關(guān)基因在頭頸部鱗癌中的突變情況； 2）通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理篩選與頭頸部鱗癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因；3）建立預(yù)測(cè)頭頸部鱗癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的數(shù)學(xué)模型，為個(gè)體化治療提供依據(jù)。主要研發(fā)內(nèi)容(限250字以內(nèi))主要研發(fā)內(nèi)容：1）應(yīng)用二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)200例頭頸部鱗癌中已知的48個(gè)癌相關(guān)基因的突變情況；2）進(jìn)行生物信息學(xué)分析、聚類分析，分別篩選出與復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因；3）利用篩選出的頭頸部鱗癌的驅(qū)動(dòng)基因及主要突變點(diǎn)，并結(jié)合臨床病理資料，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，利用COX風(fēng)險(xiǎn)模型，建立頭

6、頸部鱗癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的數(shù)學(xué)模型。預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，指導(dǎo)個(gè)體化治療。主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)(限200字以內(nèi))主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)：1）應(yīng)用二代測(cè)序技術(shù)高通量篩選與頭頸部鱗癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的相關(guān)基因，目前尚未見(jiàn)報(bào)道；2）頭頸部鱗癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的COX數(shù)學(xué)模型的建立，預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，指導(dǎo)個(gè)體化治療，具有良好的臨床應(yīng)用價(jià)值。工作進(jìn)度安排(限200字以內(nèi))（按半年填寫）2014.08-2015.02：收集天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院頭頸部鱗癌臨床病例資料，進(jìn)行分類。2015.02-2015.08：根據(jù)所收集臨床病例資料，收集天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院組織標(biāo)本庫(kù) 中頭頸部鱗癌手術(shù)或者咬檢標(biāo)本。2015.08-2016.02

7、：應(yīng)用二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)200例頭頸部鱗癌標(biāo)本中48個(gè)已知癌相關(guān)基因的突變情況。2016.02-2016.08：對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行聚類分析，分別篩選出與復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因；利用篩選出的相關(guān)基因建立頭頸部鱗癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的COX數(shù)學(xué)模型。2016.08-2017.02：完成實(shí)驗(yàn)研究臨床資料數(shù)據(jù)分析與總結(jié)，撰寫研究論文并投稿2017.02-2017.08: 匯總整體實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的興趣點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)研究主要考核指標(biāo)（限400字以內(nèi)）1 可獲得的成果（項(xiàng)目完成時(shí)可達(dá)到的階段，具體技術(shù)成果等）：1）通過(guò)二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)已知癌相關(guān)基因在頭頸部鱗癌的突變情況，篩選出與頭頸部鱗癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因

8、；2）建立預(yù)測(cè)頭頸部鱗癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的COX數(shù)學(xué)模型，為個(gè)體化治療提供依據(jù)。2 效益指標(biāo)（社會(huì)效益等）：頭頸部鱗癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的COX數(shù)學(xué)模型的建立，可有效地預(yù)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，更為精確地評(píng)估預(yù)后并指導(dǎo)個(gè)體化治療；所篩選出的與復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因，為進(jìn)一步探究頭頸部鱗癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移機(jī)制及靶向治療提供依據(jù)，具有良好的臨床應(yīng)用價(jià)值和社會(huì)效益。3考核指標(biāo)（按照項(xiàng)目指南要求填寫）：研究項(xiàng)目結(jié)題應(yīng)滿足以下條件之一：1)發(fā)表論文4篇，其中SCI收錄兩篇；2)建立評(píng)估頭頸部鱗癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的數(shù)學(xué)模型；3)臨床試驗(yàn)一項(xiàng)；成果應(yīng)用后可取得的成效展望(限150字以內(nèi))頭頸部鱗癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的COX數(shù)學(xué)

9、模型的建立，可有效地預(yù)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，更為精確地評(píng)估預(yù)后并指導(dǎo)個(gè)體化治療，具有良好的臨床應(yīng)用價(jià)值和社會(huì)效益。所篩選出的與復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因，為進(jìn)一步探究頭頸部鱗癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移機(jī)制及靶向治療提供依據(jù)，為后續(xù)深入開(kāi)展針對(duì)發(fā)現(xiàn)的癌相關(guān)基因的下游調(diào)控功能研究提供重要線索；有助于闡明頭頸部鱗癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)理并制定相對(duì)應(yīng)的防治策略。其它需要說(shuō)明的情況(限150字以內(nèi))不存在知識(shí)產(chǎn)權(quán)爭(zhēng)議 資 金 預(yù) 算 （單位：萬(wàn)元）資金來(lái)源預(yù)算金額其 中2014年2015年2016年2017年來(lái)源合計(jì)105050其中撥款105050自籌資金支出預(yù)算金額其中：申請(qǐng)撥款計(jì)算依據(jù)資金總額1010其中人員費(fèi)設(shè)備費(fèi)

10、能源材料費(fèi)77試驗(yàn)外協(xié)費(fèi)租賃費(fèi)信息費(fèi)11差旅費(fèi)會(huì)議費(fèi)0.50.5國(guó)際科技合作與交流費(fèi)管理費(fèi)1.51.5特別說(shuō)明：無(wú)項(xiàng)目負(fù)責(zé)人及其項(xiàng)目組承諾：1.本申請(qǐng)書提供的材料真實(shí)可靠，不存在知識(shí)產(chǎn)權(quán)爭(zhēng)議；2.項(xiàng)目信息表中所填內(nèi)容與項(xiàng)目實(shí)施方案、經(jīng)費(fèi)預(yù)算書等材料完全一致；3.我們將嚴(yán)格按照項(xiàng)目管理辦法認(rèn)真履行項(xiàng)目合同，采取一切措施確保項(xiàng)目進(jìn)度和達(dá)到預(yù)期目標(biāo)和技術(shù)經(jīng)濟(jì)指標(biāo)；4.按照科技經(jīng)費(fèi)開(kāi)支范圍使用資助經(jīng)費(fèi)；5.其它（請(qǐng)敘述）：項(xiàng)目負(fù)責(zé)人簽名（親筆）： 年 月 日第二合作單位承諾：我們將認(rèn)真履行合作單位職責(zé)，確保項(xiàng)目按合同完成。負(fù)責(zé)人（簽字）： （單位公章） 年 月 日第三合作單位承諾：我們將認(rèn)真履行合作單

11、位職責(zé)，確保項(xiàng)目按合同完成。負(fù)責(zé)人（簽字）： （單位公章） 年 月 日主管部門審批意見(jiàn)：（單位公章）負(fù)責(zé)人（簽字）： 年 月 日（一）項(xiàng)目的意義、必要性和依據(jù)1國(guó)內(nèi)外相關(guān)領(lǐng)域發(fā)展水平和趨勢(shì)1.1 項(xiàng)目的研究意義頭頸部鱗癌(Head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC)是頭頸部常見(jiàn)的惡性腫瘤，是嚴(yán)重威脅人類生命和健康的的疾患，為世界六大常見(jiàn)惡性腫瘤之一。頭頸部鱗癌在全世界范圍內(nèi)每年新發(fā)病例超過(guò)50萬(wàn)例，約占所有惡性腫瘤發(fā)病率的44，造成約30萬(wàn)例患者死亡，且發(fā)病率有逐年升高的趨勢(shì)【1】。頭頸部鱗癌具有較強(qiáng)的局部侵犯能力易于復(fù)發(fā)，并伴多有頸部淋巴結(jié)和/或

12、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移【2】，研究表明，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是影響其預(yù)后的重要因素【3】。盡管近年來(lái)對(duì)HNSCC采用以手術(shù)為主輔以化學(xué)治療、放射治療及靶向治療的綜合治療手段，使腫瘤的局部控制率有所改善，但是其 5 年生存率仍然徘徊在 50%左右，難以得到有效提高【4】。目前，許多學(xué)者提出個(gè)體化治療的理念，希望通過(guò)對(duì)頭頸部鱗癌患者有針對(duì)性的治療，有效提高患者的治療效果。1.2 腫瘤的個(gè)體化治療的理念及其應(yīng)用近年來(lái)個(gè)體化治療理念在腫瘤領(lǐng)域已被廣泛接受，所謂的腫瘤個(gè)體化治療( individualized therapy),是指所制定的治療策略特別適合某一個(gè)腫瘤患者，而個(gè)體化的腫瘤治療策略, 必須依賴臨床因素, 更必須依賴

13、功能基因組學(xué)的因素。因此, 基于功能基因組學(xué)的腫瘤個(gè)體化治療, 有可能讓我們對(duì)每一個(gè)腫瘤患者量體裁衣, 設(shè)計(jì)出只針對(duì)這一患者的獨(dú)特的、到目前為止有最好效果和最低毒副作用的治療方案?；驒z測(cè)能夠識(shí)別患者個(gè)體差異，是制定個(gè)體化治療方案、提高治療緩解率、改善患者生存受益、有效實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療的關(guān)鍵步驟和重要途徑。目前，在腫瘤個(gè)體化治療領(lǐng)域中，非小細(xì)胞肺癌( non-small-cell lung cancer，NSCLC)和乳腺癌的靶標(biāo)基因研究最為深入和廣泛。在NSCLC中，檢測(cè)化療療效相關(guān)靶標(biāo)基因主要包括ERCC1、RRM1、TUBB3、STMN1、ERCC2 和XRCC1等，靶向藥物療效相關(guān)靶標(biāo)基

14、因主要包括EGFR、ALK、Ros1、K-Ras、BRAF、PI3-KCA、HER2 和MET等【5,6】；研究表明：基因檢測(cè)有助于預(yù)測(cè)早期NSCLC 患者的術(shù)后復(fù)發(fā)、生存及其對(duì)輔助治療的獲益情況，可為晚期NSCLC 患者的藥物選擇及治療方案的制定提供直觀、科學(xué)的依據(jù)【7,8】。針對(duì)乳腺癌相關(guān)基因的靶向藥物治療也逐漸進(jìn)入臨床，如表皮生長(zhǎng)因子受體( epidermal growth factor receptor，EGFR) 【9】 和酪氨酸激酶抑制劑( tyrosine kinase inhibitor，TKI) 【10】，并取得的令人滿意的治療效果。我們團(tuán)隊(duì)前期開(kāi)展了頭頸部鱗癌相關(guān)基因的研究

15、，希望推動(dòng)個(gè)體化治療在頭頸部鱗癌中的應(yīng)用，研究發(fā)現(xiàn)VHL表達(dá)缺失與頭頸部鱗癌的轉(zhuǎn)移、預(yù)后、EMT密切有關(guān)，重新表達(dá)VHL后，細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生明顯變化，腫瘤發(fā)生遷移，增殖，侵襲和EMT的能力都被抑制，Snail,、N-cadherin、MMP-2/9,、HIF-1a and VEGF 的表達(dá)被下調(diào)，而E-cadherin的表達(dá)上調(diào)【11】。對(duì)CXCR4的研究發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中CXCR4的表達(dá)高于非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組,且CXCR4與Twist、Snail及N-cadherin的表達(dá)呈正相關(guān),而與P-catenin呈負(fù)相關(guān)，CXCR4 SiRNA具有誘導(dǎo)舌癌細(xì)胞調(diào)亡、抑制經(jīng)典Wnt通路參與舌癌EMT發(fā)生（如圖

16、4,5）,從而抑制舌癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的能力，CXCR4可成為抑制口腔鱗癌EMT發(fā)生的有效靶點(diǎn)【12】。有文獻(xiàn)報(bào)道，約80%90%的頭頸部鱗癌存在EGFR的高表達(dá)【13】，EGFR活化高表達(dá)會(huì)使EGF及TGF-與該受體結(jié)合增多，導(dǎo)致DNA合成、細(xì)胞增殖活躍、凋亡減少、侵襲性增加、可轉(zhuǎn)移、血管生成及一些生長(zhǎng)因子的轉(zhuǎn)錄，提示EGFR是一個(gè)提示不良預(yù)后的重要分子標(biāo)志物，且對(duì)放療和細(xì)胞毒藥物抵抗【14、15】。1.3 二代測(cè)序技術(shù)在基因檢測(cè)中的應(yīng)用基因突變是在多數(shù)人類惡性腫瘤的直接原因,約50%的人類癌癥中都存在著p53 突變, APC 基因與大腸癌的發(fā)生密切相關(guān)【16-18】。因此, 基因突變的檢測(cè)具有

17、重要的意義, 傳統(tǒng)檢測(cè)基因突變的方法主要為核酸分子雜交, 但是此方法過(guò)于繁雜, 且容易對(duì)人產(chǎn)生傷害； Sanger 測(cè)序法可以發(fā)現(xiàn)外顯子區(qū)域的變異以及拷貝數(shù)的變異, 應(yīng)用此法, 人們發(fā)現(xiàn)了很多重要的突變, 但是Sanger 法通量太低,不能滿足大規(guī)模檢測(cè)基因突變的要求。第二代測(cè)序(Next generation squencing, NGS) 的出現(xiàn)，開(kāi)創(chuàng)了高通量測(cè)序時(shí)代的新紀(jì)元。NGS的優(yōu)勢(shì)在于：檢測(cè)范圍廣，可適用混雜樣品和石蠟標(biāo)本；檢測(cè)通量大，可實(shí)現(xiàn)多個(gè)（1-96）樣品的并行測(cè)序；檢測(cè)效率高，可同時(shí)針對(duì)多個(gè)突變位點(diǎn)提供基因變異信息；檢測(cè)特異性強(qiáng)，靶向性針對(duì)熱點(diǎn)突變區(qū)，無(wú)Dropout； 檢

18、測(cè)靈敏度高，可檢測(cè)突變率低于5%的基因變異【19,20】。總之，NGS的特點(diǎn)為通量高、速度快、成本低, 給檢測(cè)基因突變帶來(lái)了革命性的變化，該技術(shù)檢測(cè)基因突變的流程簡(jiǎn)單, 研究人員運(yùn)用全基因組從測(cè)序, 目標(biāo)基因組測(cè)序以及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序能夠?qū)崿F(xiàn)基因突變的全方位、高準(zhǔn)確的檢測(cè)，為個(gè)性化治療的開(kāi)展提供了堅(jiān)實(shí)的技術(shù)平臺(tái)。雖然腫瘤的驅(qū)動(dòng)基因突變檢測(cè)在肺癌、乳腺癌和結(jié)直腸癌中已得到廣泛應(yīng)用，在指導(dǎo)臨床分子靶向治療中取得了可靠地進(jìn)步；有效的提高了療效，改善了患者的預(yù)后。但在頭頸部鱗癌中尚未見(jiàn)到相關(guān)驅(qū)動(dòng)基因的系統(tǒng)研究報(bào)道，尤其是利用二代測(cè)序技術(shù)對(duì)頭頸部鱗癌突變基因的檢測(cè)在國(guó)內(nèi)外仍屬空白。因此，本研究擬應(yīng)用二代測(cè)序技

19、術(shù)檢測(cè)已知48個(gè)癌相關(guān)基因在頭頸部鱗癌的突變情況，通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理篩選與頭頸部鱗癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因，建立預(yù)測(cè)頭頸部鱗癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的數(shù)學(xué)模型，為個(gè)體化治療提供依據(jù)。2研究目的、意義研究目的：篩選頭頸部鱗癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的相關(guān)基因，預(yù)測(cè)頭頸部鱗癌患者復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，開(kāi)展個(gè)體化治療，有效地提高患者和生存率。研究意義：預(yù)測(cè)頭頸部鱗癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的數(shù)學(xué)模型的建立，為頭頸部鱗癌的個(gè)體化治療提供分子依據(jù)，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值；并為進(jìn)一步開(kāi)展針對(duì)發(fā)現(xiàn)的與轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)相關(guān)基因的功能研究提供重要線索，為探究頭頸部鱗癌的發(fā)病機(jī)制及靶向治療提供分子水平的依據(jù)。3對(duì)本學(xué)科發(fā)展促進(jìn)作用及前景頭頸部鱗癌是頭頸部常見(jiàn)的

20、惡性腫瘤，近年來(lái)，雖采用以手術(shù)為主綜合治療，但5年生存率難以有效提高。篩選與其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因，指導(dǎo)個(gè)體化治療，是臨床亟待解決的實(shí)際問(wèn)題。本研究的結(jié)果有助于預(yù)測(cè)頭頸部鱗癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，通過(guò)個(gè)體化治療，提高患者的生存率，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值；同時(shí)為進(jìn)一步探究頭頸部鱗癌的發(fā)病機(jī)制及靶向治療提供試驗(yàn)依據(jù)。（二）研究?jī)?nèi)容及總體目標(biāo)1總體目標(biāo)總體目標(biāo)：1）應(yīng)用二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)已知癌相關(guān)基因在頭頸部鱗癌的突變情況； 2）通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理篩選與頭頸部鱗癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因；3）建立預(yù)測(cè)頭頸部鱗癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的數(shù)學(xué)模型，為個(gè)體化治療提供依據(jù)。2研究?jī)?nèi)容主要研發(fā)內(nèi)容：1）應(yīng)用二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)200例

21、頭頸部鱗癌中已知的48個(gè)癌相關(guān)基因的突變情況；2）通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理進(jìn)行生物信息學(xué)分析、聚類分析，分別篩選出與復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因；3）利用篩選出的相關(guān)基因建立頭頸部鱗癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的COX數(shù)學(xué)模型，預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，指導(dǎo)個(gè)體化治療。3. 采取的具體技術(shù)方法、解決問(wèn)題方案；3.1標(biāo)本的收集與分組。 我們回顧了2008年4月至2012年4月在天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院就診的頭頸部鱗癌患者手術(shù)后轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)的回訪情況,確定研究的入組標(biāo)準(zhǔn)如下:于天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院頜面耳鼻喉頭頸腫瘤科就診的頭頸部鱗癌癌患者且主要治療在此完成,有完整的臨床信息記錄,頭頸部鱗癌為原發(fā)腫瘤,診斷時(shí)未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移,無(wú)其他原發(fā)腫瘤,至少

22、24個(gè)月隨訪期,接受手術(shù)患者至少6個(gè)月術(shù)后存活期。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)收集天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院頭頸部鱗癌手術(shù)或者咬檢標(biāo)本和臨床資料200例。按照有無(wú)復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移進(jìn)行分組。按照是否有轉(zhuǎn)移分成轉(zhuǎn)移組、無(wú)轉(zhuǎn)移組。是否復(fù)發(fā)分為復(fù)發(fā)組、無(wú)復(fù)發(fā)組。通過(guò)兩名具有高級(jí)職職稱的病理科醫(yī)師進(jìn)行診斷，并進(jìn)行TNM分期（參考2010版NCCN癌癥指南）；收集頭頸部鱗癌患者有關(guān)生活習(xí)性、職業(yè)狀態(tài)、家族史等在內(nèi)的流行病學(xué)資料數(shù)據(jù)，并通過(guò)調(diào)閱天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院統(tǒng)計(jì)室隨訪資料患者預(yù)后進(jìn)行分類； 3.2通過(guò)二代測(cè)序技術(shù)對(duì)已知48個(gè)癌相關(guān)基因突變情況進(jìn)行檢測(cè)。1）利用Illumina公司的llumina TruSeq Amplico

23、n Cancer Panel(TSACP)測(cè)序試劑盒，針對(duì)目前在惡性腫瘤中突變率較高的ABL1, AKT1, ALK, APC, ATM, BRAF, CDH1, CDKN2A, MLH1, MPL, NOTCH1, NPM1, NRAS, PDGFRA, PIK3CA, PTEN, EGFR, ERBB2, ERBB4, FBXW7, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FLT3, RET, SMAD4, SMARCB1, SMO, SRC, STK11, TP53, VHL, GNAS, HNF1A, HRAS, IDH1, JAK2, JAK3, KDR, KIT, CSF1R,

24、GNA11, KRAS, PTPN11, CTNNB1, GNAQ, MET 和RB1等48 基因的突變熱點(diǎn)區(qū)，利用Illumina公司唯一通過(guò)FDA認(rèn)證的個(gè)人二代測(cè)序儀MiSeq進(jìn)行目標(biāo)靶向捕獲測(cè)序.通過(guò)增加測(cè)序深度和提高檢測(cè)靈敏度保證檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，減少假陰性結(jié)果；同時(shí)利用qPCR對(duì)陽(yáng)性樣本或可疑樣本進(jìn)行復(fù)檢以避免假陽(yáng)性結(jié)果。2）二代測(cè)序過(guò)程：提取腫瘤組織DNA，利用TSACP中212對(duì)特異性擴(kuò)增引物雜交到基因組DNA上以捕獲靶向區(qū)域。洗去未結(jié)合的探針，通過(guò)酶反應(yīng)對(duì)已結(jié)合的上下游探針進(jìn)行延伸以及連接，將產(chǎn)物與標(biāo)簽、接頭進(jìn)行PCR反應(yīng)，用磁珠純化、均一化樣本文庫(kù)，最后混合所有樣本上

25、機(jī)測(cè)序。在MiSeq上建立sample sheet，依次將flow cell， PR2 試劑和試劑cartridge放入MiSeq，啟動(dòng)測(cè)序。測(cè)序結(jié)束后利用BWA基因組回帖軟件將二代測(cè)序原始讀段數(shù)據(jù)（FastQ文件）回帖到參考基因組上（hg19），通過(guò)GATK軟件對(duì)檢測(cè)到48基因中發(fā)生點(diǎn)突變、插入刪除突變（小于25個(gè)核苷酸片段）的位點(diǎn)進(jìn)行挖掘，使用Annovar等軟件對(duì)挖掘到的變異位點(diǎn)進(jìn)行注釋，結(jié)合ClinVar軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)的基因變異是否影響蛋白表達(dá)和功能。3.3 通過(guò)生物信息學(xué)處理、聚類分析，篩選頭頸部鱗癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因及有意義的突變點(diǎn)。3.4應(yīng)用二代測(cè)序的檢測(cè)頭頸部鱗癌的驅(qū)動(dòng)基因及主要突

26、變點(diǎn)，并結(jié)合臨床病理資料，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，利用COX多因素風(fēng)險(xiǎn)模型，建立轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的數(shù)學(xué)模型。我們使用Kaplan-Meier分析來(lái)統(tǒng)計(jì)研究各種驅(qū)動(dòng)基因狀態(tài)等影響因子對(duì)復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移進(jìn)展時(shí)間的影響;時(shí)序檢驗(yàn)(log rank test)用于兩組間簡(jiǎn)單比較;用卡方檢驗(yàn)來(lái)統(tǒng)計(jì)分析各種驅(qū)動(dòng)基因突變與臨床因子的關(guān)系。在統(tǒng)計(jì)分析頭頸部鱗癌的危險(xiǎn)因素時(shí),我們先使用單因素COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型(univariate Cox proportional hazard model)從假設(shè)因子(包括各驅(qū)動(dòng)基因突變,性別、診斷頭頸部鱗癌時(shí)的年齡、頭頸部鱗癌的組織學(xué)類型、原發(fā)灶的位置、吸煙史、診斷時(shí)的腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情

27、況等臨床因子)中計(jì)算出與轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)相關(guān)的因子(P0.1),Wald分析(Waldstatistics )用于評(píng)估統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;我們?cè)儆枚嘁蛩谻OX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸8(multivariate Cox proportional hazards regression model)模型聯(lián)合分析單因素cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型得出的相關(guān)因子,從中得出轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因子,當(dāng)P值0.05時(shí)認(rèn)為統(tǒng)計(jì)有意義。然后我們把這些有統(tǒng)計(jì)意義的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)因子建立成一個(gè)轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)模型。我們利用多因素COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型得出的偏回歸系數(shù)來(lái)定義一個(gè)轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)積分,按積分多少進(jìn)行危險(xiǎn)度分組,最終區(qū)分出頭頸部鱗癌中轉(zhuǎn)移與

28、復(fù)發(fā)的高、中、低危人群。上述統(tǒng)計(jì)分析均為兩側(cè),P0. 05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有統(tǒng)計(jì)借助SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件完成。技術(shù)路線圖:（三）項(xiàng)目可行性分析1，前期工作情況及基礎(chǔ)（1）我們前期通過(guò)對(duì)頭頸部鱗癌標(biāo)本中VHL的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)頭頸部鱗癌中存在VHL的低表達(dá)，且表達(dá)程度與腫瘤分化、轉(zhuǎn)移、耐藥及復(fù)發(fā)有關(guān)，在舌鱗癌細(xì)胞系中檢測(cè)到EGFR、VHL的表達(dá)。如我們前期對(duì)VHL的研究發(fā)現(xiàn)，VHL表達(dá)缺失與腫瘤的轉(zhuǎn)移、預(yù)后、EMT密切有關(guān)，重新表達(dá)VHL后，有一個(gè)細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生明顯變化，腫瘤發(fā)生遷移，增殖，侵襲和EMT的能力都被抑制，Snail,、N-cadherin、MMP-2/9、HIF-1a and V

29、EGF 的表達(dá)被下調(diào)，而E-cadherin的表達(dá)上調(diào)，.如圖1,2。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明VHL與頭頸部鱗狀細(xì)胞癌EMT發(fā)生過(guò)程密切相關(guān)。HIF-1a是一個(gè)重要的VHL調(diào)控的下游基因，此外，在此次實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)-連環(huán)蛋白也可能是一個(gè)重要的VHL調(diào)控的下游基因，其可能會(huì)誘發(fā)口腔癌EMT的過(guò)程【11】。而對(duì)CXCR4的研究發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中CXCR4的表達(dá)高于非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組,且CXCR4與Twist、Snail及N-cadherin的表達(dá)呈正相關(guān),而與P-catenin呈負(fù)相關(guān)（如圖3），發(fā)現(xiàn)CXCR4 SiRNA具有誘導(dǎo)舌癌細(xì)胞調(diào)亡、抑制經(jīng)典Wnt通路參與舌癌EMT發(fā)生（如圖4,5）,從而抑制舌癌細(xì)

30、胞侵襲轉(zhuǎn)移的能力，CXCR4可成為抑制口腔鱗癌EMT發(fā)生的有效靶點(diǎn)【12】。圖1，VHL和EMT相關(guān)蛋白表達(dá)在各組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（LN+）和非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（LN）和VHL與相關(guān)患者的總生存期。（一）免疫組化結(jié)果顯示VHL基因陽(yáng)性被發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，LN（）組表現(xiàn)出較強(qiáng)的表達(dá)。 -catenin的增加 細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中LN（+）。蝸牛和HIF-1表現(xiàn)出更強(qiáng)的核和細(xì)胞質(zhì)LN表達(dá)（+）組。 N-cadherin的陽(yáng)性染色明顯在LN（+）組，設(shè)在與細(xì)胞膜和細(xì)胞漿。 E-cadherin蛋白定位于細(xì)胞膜和LN表達(dá)強(qiáng)（）。 MMP-2/9顯示了較強(qiáng)的染色細(xì)胞質(zhì)中LN（+）（400倍）。（B）中的存活曲線患者

31、的口腔鱗狀細(xì)胞癌，患者VHL高表達(dá)有較好的預(yù)后。 P <0.05圖2 VHL的表達(dá)恢復(fù)受影響的相關(guān)蛋白的表達(dá)。 （a）若檢測(cè)-連環(huán)蛋白的轉(zhuǎn)染與VHL后。 （B）B-連環(huán)蛋白表達(dá)降低兩細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。（三）檢測(cè)轉(zhuǎn)染與VHL通過(guò)Western blot后Tscca和Tca8113P160細(xì)胞相對(duì)蛋白質(zhì)。 -連環(huán)蛋白，蝸牛，N-鈣粘蛋白，HIF-1， VEGF和MMP2/9被下調(diào)，E-cadherin蛋白水平上調(diào)。 * P <0.05圖3，免疫組化方法檢測(cè)CXCR4, -catenin及EMT相關(guān)因子Twist、Snail、N-cadherin在口腔麟癌中的表達(dá)。圖4，經(jīng)IHC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)

32、,與Control及Scramble組相比,si CXCR4組中,MMP-9,MMP-2及N-cadhrein表達(dá)水平明顯降低,而E-cadherin的表達(dá)升高。圖5 western blot檢測(cè)經(jīng)典Wnt通路蛋白表達(dá)情況。（2） 實(shí)踐的可行性：本研究使用的技術(shù)手段包括：細(xì)胞生物學(xué)的評(píng)價(jià)手段、組織病理學(xué)檢測(cè)等均為經(jīng)典方法，并有自身多年實(shí)踐基礎(chǔ)。在天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院腫瘤組織庫(kù)的組織庫(kù)的支持下，按照天津醫(yī)科大學(xué)人的醫(yī)學(xué)倫理審查要求，收集了近百例頭頸鱗癌手術(shù)標(biāo)本，為研究進(jìn)一步開(kāi)展實(shí)施打下基礎(chǔ),。依托天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院二代測(cè)序平臺(tái)，有著充分的設(shè)備和技術(shù)保障。（3） 課題組成員的經(jīng)歷與經(jīng)驗(yàn)：申請(qǐng)者及

33、其研究團(tuán)隊(duì)多年來(lái)長(zhǎng)期從事頭頸部鱗癌轉(zhuǎn)移機(jī)制及靶向治療的研究，承擔(dān)多項(xiàng)教委及科委課題，積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，熟練掌握分子生物學(xué)的各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)。所在的頭頸外科，每年完成頭頸部鱗癌手術(shù)患者300余例，臨床標(biāo)本豐富，能夠滿足課題的需要。與天津市"腫瘤防治"重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室有良好的合作關(guān)系、可以保證二代測(cè)序的順利完成。 2項(xiàng)目的知識(shí)產(chǎn)權(quán)情況：不存在知識(shí)產(chǎn)權(quán)爭(zhēng)議3項(xiàng)目負(fù)責(zé)人及主要研發(fā)人員簡(jiǎn)介；姓名：王旭東主要學(xué)歷：1986-1991年就讀于天津醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)系并獲醫(yī)學(xué)學(xué)士學(xué)位；1997-2000腫瘤學(xué)專業(yè)頭頸腫瘤學(xué)方向碩士研究生獲得醫(yī)學(xué)碩士學(xué)位；2002-2005年師從著名腫瘤學(xué)專家郝希山院士攻讀

34、腫瘤學(xué)博士研究生并獲醫(yī)學(xué)博士學(xué)位；2009-2010年分別在美國(guó)MD.Anderson cancer center、Karmanos cancer center開(kāi)展訪問(wèn)學(xué)者工作。研究工作簡(jiǎn)歷：承擔(dān)天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃（項(xiàng)目編號(hào)：JCYBJC33800）在研；承擔(dān)天津市高等學(xué)校科技發(fā)展基金項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：20050222），已結(jié)題；參與新編頭頸腫瘤學(xué)、簡(jiǎn)明腫瘤學(xué)、腫瘤手術(shù)學(xué)等多部專業(yè)論著編寫主要論著及出處：（1） Shu Zhang, Xuan Zhou, Bo Wang, Kailiang Zhang, Su Liu, Kai Yue, Lun Zhang, Xu dong Wan

35、g. a Loss of VHL expression contributes to epithelialmesenchymal transition in oral squamous cell carcinoma. oraloncology.2014.06.07：1368-8375（2）張舒，王博，周旋，岳愷，王旭東(通訊作者).趨劃因子CXC亞家族受體調(diào)控口腔鱗狀細(xì)胞癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化介導(dǎo)淋巴轉(zhuǎn)移的體外實(shí)驗(yàn). 中華口腔醫(yī)學(xué)雜志 2014,49(3):（3） Bo Wang, Kai Yue, Xu-dong Wang et al. The recurrence and survival of

36、oral squamous cell carcinoma: a report of 275 cases J. Chin J Cancer, 2013 Nov;32(11):614-8（4） 王博，張舒，王旭東(通訊作者).等。EMT介導(dǎo)口腔鱗癌淋巴轉(zhuǎn)移及其機(jī)制研究J。中國(guó)腫瘤臨床，2012，23（39）：1877-1885。（5）吳延升,董俊峰,岳愷,曹曉莉,王旭東(通訊作者). CXCL12/CXCR4生物學(xué)軸與甲狀腺乳頭狀癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性研究.中國(guó)腫瘤臨床,2011,38(23):1439-1442姓名：吳延升主要學(xué)歷：本人自于2000-2005年就讀于錦州醫(yī)學(xué)院本科并獲得醫(yī)學(xué)學(xué)士學(xué)位

37、；2005年起于天津醫(yī)科大學(xué)攻讀腫瘤專業(yè)碩士研究生，于2008年獲得醫(yī)學(xué)碩士學(xué)位。2008年起至今就職于天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院頜面耳鼻咽喉頸部腫瘤科，現(xiàn)師從我國(guó)著名腫瘤學(xué)家郝希山院士攻讀腫瘤學(xué)博士。研究工作簡(jiǎn)歷：碩士在學(xué)期間參與天津市高等學(xué)?？萍及l(fā)展基金項(xiàng)目"胞內(nèi)捕獲趨化因子受體抑制甲狀腺乳頭狀癌轉(zhuǎn)移的研究"（項(xiàng)目編號(hào)：20050222）。主要論著及出處：（1）吳延升，張麗，趙景會(huì)，張侖，王旭東，舌鱗狀細(xì)胞癌預(yù)后多因素分析，實(shí)用腫瘤雜志，2012，27（2）：136-139（2）吳延升,董俊峰,岳愷,曹曉莉,王旭東(通訊作者). CXCL12/CXCR4生物學(xué)軸與甲狀腺乳

38、頭狀癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性研究.中國(guó)腫瘤臨床,2011,38(23):1439-1442（3）曹曉莉,張文超, 吳延升,岳愷,王旭東(通訊作者).CXCL12/CXCR4生物軸在頭頸部鱗癌淋巴轉(zhuǎn)移的作用. 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2010,27(7):992-994姓名：岳愷主要學(xué)歷：2003-2011年就讀于天津醫(yī)科大學(xué)七年制獲醫(yī)學(xué)碩士學(xué)位，2011年起至今就職于天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院頜面耳鼻咽喉頸部腫瘤科研究工作簡(jiǎn)歷：主要研究方向?yàn)轭^頸部鱗狀細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系與機(jī)制主要論著及出處：（1） CXCL12-KDEL融合基因綠色熒光蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定.中國(guó)腫瘤臨床，2010，37（1

39、0），550-3（2） 179例全喉切除患者生活質(zhì)量分析.2011國(guó)際暨全國(guó)第十一屆頭頸腫瘤學(xué)術(shù)大會(huì)論文匯編姓名：劉速主要學(xué)歷：2007年-2012年就讀于南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院并獲得醫(yī)學(xué)學(xué)士學(xué)位；自2010年起至今就讀于天津醫(yī)科大學(xué)研究生院攻讀腫瘤學(xué)方向碩士研究生。研究工作簡(jiǎn)歷：主要研究方向?yàn)轭^頸部鱗狀細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系與機(jī)制姓名：何清華主要學(xué)歷：2008年-2013年就讀于濰坊醫(yī)學(xué)院并獲得醫(yī)學(xué)學(xué)士學(xué)位；自2012年起至今就讀于天津醫(yī)科大學(xué)研究生院攻讀腫瘤學(xué)方向碩士研究生。研究工作簡(jiǎn)歷：主要研究方向?yàn)轭^頸部鱗狀細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系與機(jī)制姓名：段遠(yuǎn)勝主要學(xué)歷：2008年-2013

40、年就讀于濰坊醫(yī)學(xué)院并獲得醫(yī)學(xué)學(xué)士學(xué)位；自2010年起至今就讀于天津醫(yī)科大學(xué)研究生院攻讀腫瘤學(xué)方向碩士研究生。研究工作簡(jiǎn)歷：主要研究方向?yàn)轭^頸部鱗狀細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系與機(jī)制4已具備的優(yōu)勢(shì)和不足。課題申請(qǐng)者本人熟悉當(dāng)前頭頸部鱗癌分子病理和分子生物學(xué)發(fā)展前沿研究?jī)?nèi)容，近年來(lái)已經(jīng)形成了由多人組成的專門從事頭頸腫瘤細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)研究的課題組?？墒炀氄莆辗肿由飳W(xué)常用實(shí)驗(yàn)技術(shù)。自創(chuàng)建以來(lái)在包括腫瘤應(yīng)用基礎(chǔ)研究在內(nèi)的基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域多次獲得國(guó)家自然基金的資助，均能按期、按計(jì)劃完成；申請(qǐng)人依托天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院、天津市"腫瘤防治"重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、二代測(cè)序平臺(tái)，與其形成了良好的

41、工作關(guān)系；申請(qǐng)人所在醫(yī)院，每年能完成頭頸部鱗癌手術(shù)患者300余例，能保證本課題臨床部分內(nèi)容的順利完成。本課題組成員中大部分為年輕的博士和在讀碩士研究生，在二代測(cè)序技術(shù)的學(xué)習(xí)和掌握上難度較大，但經(jīng)過(guò)學(xué)習(xí)培訓(xùn)可以完成研究?jī)?nèi)容。（四）主要技術(shù)及效益指標(biāo)1項(xiàng)目的技術(shù)指標(biāo)；總體目標(biāo)：1）應(yīng)用二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)已知癌相關(guān)基因在頭頸部鱗癌的突變情況； 2）通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理篩選與頭頸部鱗癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因；3）建立預(yù)測(cè)頭頸部鱗癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的數(shù)學(xué)模型，為個(gè)體化治療提供依據(jù)。2項(xiàng)目完成后的預(yù)期效益：頭頸部鱗癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的COX數(shù)學(xué)模型的建立，可有效地預(yù)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，更為精確地評(píng)估預(yù)后并指導(dǎo)個(gè)體化

42、治療，具有良好的臨床應(yīng)用價(jià)值和社會(huì)效益。所篩選出的與復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因，為進(jìn)一步探究頭頸部鱗癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移機(jī)制及靶向治療提供依據(jù)，為后續(xù)深入開(kāi)展針對(duì)發(fā)現(xiàn)的癌相關(guān)基因的下游調(diào)控功能研究提供重要線索；有助于闡明頭頸部鱗癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)理并制定相對(duì)應(yīng)的防治策略。3不確定性分析，風(fēng)險(xiǎn)因素分析和對(duì)策；本研究使用二代測(cè)序技術(shù)為新一代分子檢測(cè)技術(shù)，主要存在以下技術(shù)風(fēng)險(xiǎn)：1）標(biāo)本的切放和存留；2）技術(shù)方法操作；3)生物信息學(xué)分析和數(shù)學(xué)模型的建立。解決方法：1），病理診斷腫瘤組織并進(jìn)行分類，快速送檢；2），向二代測(cè)序技術(shù)人員交流學(xué)習(xí)；3）請(qǐng)教專業(yè)機(jī)構(gòu)進(jìn)行生物信息學(xué)分析并與其合作。收集完善規(guī)范的臨床資料，請(qǐng)

43、統(tǒng)計(jì)學(xué)專家輔導(dǎo)建立數(shù)學(xué)模型。 4考核指標(biāo)研究項(xiàng)目結(jié)題應(yīng)滿足以下條件之一：1)發(fā)表論文4篇，其中SCI收錄兩篇；2)建立評(píng)估頭頸部鱗癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的數(shù)學(xué)模型；3)開(kāi)展臨床試驗(yàn)一項(xiàng)；（五）實(shí)施的分階段目標(biāo)和年度進(jìn)展計(jì)劃1項(xiàng)目分階段目標(biāo)以及年度進(jìn)展計(jì)劃；2014.08-2015.02：收集天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院頭頸部鱗癌臨床病例資料，進(jìn)行分類。2015.02-2015.08：根據(jù)所收集臨床病例資料，收集天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院組織標(biāo)本庫(kù)中頭頸部鱗癌手術(shù)或者咬檢標(biāo)本。2015.08-2016.02：應(yīng)用二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)200例頭頸部鱗癌標(biāo)本中48個(gè)已知癌相關(guān)基因的突變情況。2016.02-2016.

44、08：對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行聚類分析，分別篩選出與復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因；利用篩選出的相關(guān)基因建立頭頸部鱗癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的COX數(shù)學(xué)模型。2016.08-2017.02：完成實(shí)驗(yàn)研究臨床資料數(shù)據(jù)分析與總結(jié)，撰寫研究論文并投稿2017.02-2017.08: 匯總整體實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的興趣點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)研究2項(xiàng)目實(shí)施的保障措施；申請(qǐng)人所在單位為天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院，病人資源豐富，每年能完成頭頸手術(shù)患者3000余例，能保證本課題臨床部分內(nèi)容的順利完成。天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院建立的二代測(cè)序技術(shù)擁有先進(jìn)的硬件基礎(chǔ)，充足的技術(shù)儲(chǔ)備，本課題組與其具有良好的協(xié)作關(guān)系。此外，天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院擁有能夠開(kāi)展蛋白

45、組學(xué)、功能基因組學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物信息學(xué)及生物芯片等研究的技術(shù)平臺(tái)。課題申請(qǐng)者本人熟悉當(dāng)前頭頸部惡性腫瘤分子病理和分子生物學(xué)發(fā)前沿研究?jī)?nèi)容，具有一定設(shè)計(jì)和協(xié)調(diào)完成重大課題研究的經(jīng)驗(yàn)，已經(jīng)熟練掌握分子生物學(xué)常用實(shí)驗(yàn)技術(shù)。參考文獻(xiàn)：【1】lay J，Shin HR，Bray F，et a1Estimates of worldwide burden of cancer in 2008：GLOBOCAN 2008l J IInt J Cancer，2010，127(12)：2893-2917. 【2】 Posner M, Vermorken JB. Induction therapy in the

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48、tastatic squamous cell carcinoma of the head and neck: current status and future directionsJ. Semin Oncol, 2000, 27(4 Suppl 8):25-33.【5】 Sudhindra A，Ochoa R，Santos ES Biomarkers，prediction，and prognosis in non-small-cell lung cancer: A platform for personalized treatment J Clin Lung Cancer，2011，12(

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