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文檔簡(jiǎn)介
1、.Western blotting1. 總蛋白的提取a) 收集小鼠組織或是細(xì)胞入1.5 ml離心管中。b) 每管加一定量的蛋白裂解液。注:蛋白裂解液的多少以最后能得到的蛋白濃度達(dá)到10 g/l左右為佳。c) 用勻漿棒進(jìn)行勻漿(冰中進(jìn)行)。d) 加入一定量的PMSF,使其終濃度為1 mM。e) 冰中放置3060 min。 f) 4、12000 rpm離心30 min,上清即為總蛋白??煞?30保存待用。2. 蛋白濃度的測(cè)定(BCA試劑盒)A. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作a) 配不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液(見(jiàn)表2-1)表2-1 BSA各濃度標(biāo)準(zhǔn)液的配制Table 2.1 Preparation of standard
2、solution with different BSA concentration10 mM Tris-HCl (pH=7.5)Final BSA ConcentrationA700 l100 l BSA250 g/lB400 l400 l A液125 g/lC450 l300 l B液50 g/lD400 l400 l C液25 g/lE400 l100 l D液5 g/lF400 l0 g/lb) 按50:1配Solution A:Solution B混合液,每個(gè)樣本需2 ml。c) 在每個(gè)試管中加入2 ml Solution A:Solution B混合液以及0.1 ml 樣本,于60水
3、浴30 min。d) 測(cè)OD562nm,空白對(duì)照為10 mM Tris-HCl (pH=7.5),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。B. 測(cè)樣品濃度a) 用10 mM Tris-HCl(pH=7.5)稀釋樣品100倍。b) 加2 ml Solution A:Solution B混合液 + 0.1 ml稀釋樣本,60水浴 30 min。c) 測(cè)OD562nm。調(diào)出標(biāo)準(zhǔn)曲線,讀出對(duì)應(yīng)濃度值,再乘以100,即為該樣品濃度。3. SDS-PAGE電泳A. PAGE膠的制備(5%濃縮膠、10%分離膠)。a) 10%分離膠溶液的配制30% Acr-Bis(29:1)1.32 ml1.5 M Tris-HCl (pH=8.8)
4、1 ml20% SDS20 l加水至4 ml,輕輕混勻,避免氣泡產(chǎn)生。倒膠前加入20 l的10%過(guò)硫酸銨(APS)以及2 l的TEMED,輕輕混勻,緩慢注入兩玻璃板之間(液面最高處應(yīng)在梳子下方約0.5 cm處)。然后緩慢加入1 ml去離子水,37放置30 min。待膠凝固,吸干膠上面的水。b) 5%濃縮膠溶液的配制30% Acr-Bis(29:1)0.34 ml0.5 M Tris-HCl (pH=6.8)0.5 ml20% SDS10 l加水至2 ml,輕輕混勻,避免氣泡產(chǎn)生。倒膠前加入10 l的10% APS以及2 l的TEMED,輕輕混勻,緩慢注入兩玻璃板之間分離膠的上方,加滿,插入梳子
5、。室溫放置待其凝固。B. 蛋白樣本制備取20100 g的總蛋白,加入同樣體積的2×蛋白上樣緩沖液,于沸水中煮5 min,然后6000 rmp、2 min,取上清待用。C. 電泳a) 把做好的濃縮-分離膠板放入電泳裝置中,加入1×蛋白電泳緩沖液,輕輕拔出梳子。b) 把蛋白樣本加入加樣孔。c) 電泳:濃縮膠70 V,分離膠140 V,直至溴酚藍(lán)遷移至底部,停止電泳。D. 電轉(zhuǎn)膜a) 準(zhǔn)備好與膠大小一致的硝酸纖維素膜一張、兩張相應(yīng)大小的濾紙,將其與纖維墊放入1×蛋白轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡1560 min。b) 按照纖維墊、濾紙、膠、膜、濾紙、纖維墊的順序作好轉(zhuǎn)膜三明治,濾紙、
6、膠、膜、濾紙各層中要用玻棒趕盡氣泡,然后放入轉(zhuǎn)膜裝置中。注意放置的次序:負(fù)極(黑孔板)纖維墊 濾紙 膠 膜濾紙 纖維墊 正極(紅孔板)。c) 于4、100 V轉(zhuǎn)膜12 h。d) 轉(zhuǎn)膜完畢后,取出膜,放入麗春紅染液中染色5 min,觀察轉(zhuǎn)膜效果。e) 將膜于清水中沖洗,洗去麗春紅,放入PBS,待用。E. 封閉將膜放入5%脫脂奶粉(PBS配制)中,于脫色搖床中室溫緩慢搖1 h。F. 雜交a) 用PBS或是封閉液稀釋一抗:Rabbit-anti-Dnaic2(1:2)、Rabbit-anti-DNAI2(1:1000)、Mouse-anti-myc(1:1000)、Mouse-anti-tublin
7、(1:1000)、Mouse-anti-Stat3(1:100)、Rabbit-anti-p-Stat3(1:100)或是Mouse-anti-PCNA(1:100),于37搖23 h或是4搖過(guò)夜。b) 用含1% Tween-20的PBS洗膜兩次,每次5 min。c) 加入用PBS或是封閉液稀釋的相應(yīng)的二抗:HRP-Goat-anti-Mouse IgG(1:1000) 、HRP-Goat-anti-Mouse IgG(1:2000),于37搖1 h。G. ECL顯色(ECL顯色試劑盒) a) A液:B液=1:1混合,加到膜上,封好。b) 壓片曝光15 min。4. 顯影、定影,用水沖洗膠片、
8、晾干。1. 蛋白裂解貯存液:1M Tris-HCl (pH=7.5)5 mlTriton X-1001 ml0.5M EDTA (pH=8.0)1 ml加水至100 ml,用濾紙過(guò)濾,4保存。用時(shí)加入leupeptin(終濃度為10 g/ml)及aprotinin(終濃度為10 g/ml)蛋白酶抑制劑配成蛋白裂解液。2. 100 mM PMSF:PMSF17.42 mg加無(wú)水乙醇至1 ml,-20保存。3. 1.5 M Tris-HCl(pH=8.8):Tris堿90.8 g去離子水400 ml溶解后,加濃鹽酸調(diào)pH至8.8,然后定容至500 ml。4. 0.5 M Tris-HCl(pH=6.8):Tris堿30.3 g去離子水400 ml溶解后,加濃鹽酸調(diào)pH至6.8,然后定容至500 ml。5. 10% APS:APS0.1 g加去離子水至1 ml,現(xiàn)配現(xiàn)用。6. 2×蛋白上樣緩沖液:0.5 M Tris-HCl (pH=6.8)1.25 ml甘油2.5 ml20% SDS1 ml0.5% 溴酚藍(lán)0.2 ml加去離子水至10 ml,-30保存。使用前加入-巰基乙醇(終濃度為5%)。7. 10×蛋白電泳緩沖液:Tris堿30.3 g甘氨酸144 gSDS 1% w/v加去離子水至1 L。使用時(shí)稀釋成1×電泳
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