實(shí)驗(yàn)6細(xì)菌鑒定中常用的理化

1、 2) 2)通過(guò)細(xì)菌對(duì)不同含碳、氮化合物的分解利用情況通過(guò)細(xì)菌對(duì)不同含碳、氮化合物的分解利用情況了解細(xì)菌碳、氮代謝類型的多樣性。了解細(xì)菌碳、氮代謝類型的多樣性。糖（醇）類發(fā)酵實(shí)驗(yàn)：糖（醇）類發(fā)酵實(shí)驗(yàn)： 1)1)糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，比較大腸桿菌和變形桿菌的糖發(fā)糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，比較大腸桿菌和變形桿菌的糖發(fā)酵結(jié)果。酵結(jié)果。 2)2)甲基紅實(shí)驗(yàn)，比較大腸桿菌和產(chǎn)氣桿菌的甲基甲基紅實(shí)驗(yàn)，比較大腸桿菌和產(chǎn)氣桿菌的甲基紅反應(yīng)結(jié)果。紅反應(yīng)結(jié)果。 3)3)伏伏- -普實(shí)驗(yàn)（普實(shí)驗(yàn)（V-PV-P實(shí)驗(yàn)），比較大腸桿菌和產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)），比較大腸桿菌和產(chǎn)氣桿菌的桿菌的V-PV-P反應(yīng)結(jié)果。反應(yīng)結(jié)果。 1）吲哚實(shí)驗(yàn)，比較大腸桿菌和產(chǎn)氣桿

2、菌的吲哚反應(yīng)結(jié)果2）硫化氫實(shí)驗(yàn)，比較大腸桿菌和變形桿菌硫化氫反應(yīng)結(jié)果3）明膠液化實(shí)驗(yàn)，比較大腸桿菌和枯草桿菌明膠液化結(jié)果4）淀粉水解實(shí)驗(yàn)，比較大腸桿菌和枯草桿菌淀粉水解結(jié)果1)檸檬酸鹽利用實(shí)驗(yàn),比較大腸桿菌和產(chǎn)氣桿菌的檸檬酸鹽利用結(jié)果2)硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn),比較大腸桿菌和枯草桿菌的硝酸鹽還原結(jié)果 因細(xì)菌所含的酶不同，其發(fā)酵糖（醇）后的代謝產(chǎn)物亦不相同，即可產(chǎn)酸產(chǎn)氣，或產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。酸的產(chǎn)生可利用培養(yǎng)基中溴甲酚紫的顏色變化進(jìn)行判斷（pH5.2黃色6.8紫色），即當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)酸時(shí)，可使培養(yǎng)基由紫色變?yōu)辄S色。 氣體產(chǎn)生可由發(fā)酵管內(nèi)倒置的杜氏小管中有無(wú)氣泡來(lái)判斷。 糖（醇）類發(fā)酵實(shí)驗(yàn)糖（醇）類發(fā)酵實(shí)驗(yàn) 大腸桿菌

3、等許多細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸,丙酮酸可進(jìn)一步分解成甲酸（或乙酸乳酸）,使培養(yǎng)基的pH降低到4.2以下,此時(shí)加入甲基紅指示劑，呈現(xiàn)紅色 。 產(chǎn)氣桿菌等分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸,培養(yǎng)基的pH在6.2以上, 故此時(shí)加入甲基紅指示劑,呈現(xiàn)黃色.注：甲基紅指示劑變色范圍 pH4.4(紅色)-pH6.2(黃色).產(chǎn)氣氣桿菌：產(chǎn)氣氣桿菌：V.P.試驗(yàn)陽(yáng)性試驗(yàn)陽(yáng)性甲基紅試驗(yàn)陰性甲基紅試驗(yàn)陰性大腸桿菌：大腸桿菌：V.P.試驗(yàn)陰性試驗(yàn)陰性甲基紅試驗(yàn)陽(yáng)性甲基紅試驗(yàn)陽(yáng)性伏伏- -普普(Voges-Proskauer(Voges-Proskauer) )氏實(shí)驗(yàn)氏實(shí)驗(yàn)(V.P.(V.P.實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)) ) 大腸桿菌等能分解大腸

4、桿菌等能分解蛋白質(zhì)中的色氨酸蛋白質(zhì)中的色氨酸, ,產(chǎn)生靛基質(zhì)產(chǎn)生靛基質(zhì)( (吲哚吲哚),),靛基質(zhì)與對(duì)二甲基靛基質(zhì)與對(duì)二甲基氨基苯甲醛結(jié)合形氨基苯甲醛結(jié)合形成玫瑰色靛基質(zhì)成玫瑰色靛基質(zhì)( (紅色化合物紅色化合物).). 某些細(xì)菌能分解含硫的氨基酸(胱氨酸半胱氨酸等),產(chǎn)生硫化氫與培養(yǎng)基中的鉛鹽或鐵鹽,形成黑色沉淀硫化鉛或硫化鐵.為硫化氫實(shí)驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌具有膠原酶,使明膠被分解,失去凝固能力,呈現(xiàn)液體狀態(tài),為明膠實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性.明膠液化實(shí)驗(yàn)明膠液化實(shí)驗(yàn)產(chǎn)氣桿菌等能以檸檬酸鈉為碳源進(jìn)行生長(zhǎng)。其分產(chǎn)氣桿菌等能以檸檬酸鈉為碳源進(jìn)行生長(zhǎng)。其分解檸檬酸鹽后產(chǎn)生碳酸鹽解檸檬酸鹽后產(chǎn)生碳酸鹽, , 培養(yǎng)基呈堿性培養(yǎng)基呈

5、堿性. .使培養(yǎng)使培養(yǎng)基中的溴麝香草酚藍(lán)指示劑由綠色變?yōu)樗{(lán)色基中的溴麝香草酚藍(lán)指示劑由綠色變?yōu)樗{(lán)色. .不能不能利用檸檬酸鹽為碳源的細(xì)菌利用檸檬酸鹽為碳源的細(xì)菌, ,在該培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)在該培養(yǎng)基上不生長(zhǎng), ,培養(yǎng)基不變色培養(yǎng)基不變色. . 檸檬酸鹽利用實(shí)驗(yàn)檸檬酸鹽利用實(shí)驗(yàn)大腸桿菌,變形桿菌,枯草桿菌,產(chǎn)氣桿菌斜面實(shí)驗(yàn)儀器實(shí)驗(yàn)儀器：恒溫培養(yǎng)箱、微生物材料：微生物材料：試管、無(wú)菌平皿、杜氏小管、接種環(huán),酒精燈,1)葡萄糖和乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基（糖類發(fā)酵實(shí)驗(yàn)）. 3)胰蛋白水培養(yǎng)基（吲哚實(shí)驗(yàn)）4)檸檬酸鐵銨或醋酸鉛的半固體培養(yǎng)基（硫化氫實(shí)驗(yàn)）5)明膠培養(yǎng)基（明膠液化實(shí)驗(yàn)）6)淀粉培養(yǎng)基（淀粉水解實(shí)驗(yàn)）7)

6、檸檬酸鈉斜面培養(yǎng)基（檸檬酸鹽利用實(shí)驗(yàn)）8)硝酸鹽培養(yǎng)基（硝酸鹽利用實(shí)驗(yàn)）1.編號(hào)： 在試管上標(biāo)明培養(yǎng)基名稱,所接種的菌名和組號(hào).五、實(shí)驗(yàn)步驟五、實(shí)驗(yàn)步驟（一）糖（一）糖( (醇醇) )類發(fā)酵實(shí)驗(yàn)類發(fā)酵實(shí)驗(yàn)3.乳糖發(fā)酵試驗(yàn)接種方法同葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)。將已接種好的培養(yǎng)基置37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h.4.結(jié)果觀察:若細(xì)菌能發(fā)酵培養(yǎng)基中的糖，可使培養(yǎng)基的pH降低, 培養(yǎng)基中的指示劑呈酸性反應(yīng)(為黃色),若發(fā)酵糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣,不僅培養(yǎng)基呈黃色,且在倒置的小玻璃管(杜氏小管)中有氣體（氣體占杜氏小管的10%以上）；若被測(cè)細(xì)菌不分解培養(yǎng)基中的糖,則培養(yǎng)基不發(fā)生變化。 2.1支接種大腸桿菌，1支接種產(chǎn)氣桿菌,1支不接種

7、，作為對(duì)照。37培養(yǎng)48h，加甲基紅指示劑數(shù)滴，觀察結(jié)果。1.取3支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，標(biāo)記同上。3.結(jié)果：呈現(xiàn)紅色者為陽(yáng)性, 呈現(xiàn)黃色者為陰性.取3支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，1支接種大腸桿菌，1支接種產(chǎn)氣桿菌，1支留作對(duì)照。37培養(yǎng)48 h取出,加入40% KOH 5-10滴,然后再加入等量的5%-萘酚溶液,用力振蕩,再放入37培養(yǎng)箱中保溫15-30min加快反應(yīng)速度.若培養(yǎng)物呈現(xiàn)紅色,為伏-普反應(yīng)陽(yáng)性. 取3支胰蛋白胨水培養(yǎng)基， 1支接種大腸桿菌，1支接種產(chǎn)氣桿菌，1支留作對(duì)照。37培養(yǎng)24-48h后, 沿試管壁滴加數(shù)滴吲哚試劑于培養(yǎng)物液面, 觀察結(jié)果.呈現(xiàn)玫瑰紅色為陽(yáng)性,不變色為陰性.取

8、3支醋酸鐵或檸檬酸鐵半固體培養(yǎng)基，采用穿刺接種法，1支接種大腸桿菌，1支接種變形桿,1支作對(duì)照。37培養(yǎng)24h觀察結(jié)果,若有黑色沉淀線出現(xiàn)為陽(yáng)性.（五）硫化氫實(shí)驗(yàn)（五）硫化氫實(shí)驗(yàn) 取3支營(yíng)養(yǎng)明膠培養(yǎng)基，用穿刺接種方法，1支接種大腸桿菌，1支接種枯草桿菌,1支作對(duì)照。37培養(yǎng)48h后, 將明膠培養(yǎng)基輕輕放入4冰箱30 min,觀察明膠的液化情況。（六）明膠液化實(shí)驗(yàn)（六）明膠液化實(shí)驗(yàn)1.將冷卻到50的淀粉培養(yǎng)基以無(wú)菌操作制成平板.2.用接種環(huán)取少許枯草桿菌劃線接種在平板的一邊,再取少許大腸桿菌劃線接種在平板的另一邊.3.置37溫箱培養(yǎng)24h.4.打開(kāi)平皿, 將少量盧戈氏碘液滴加于平板上，輕輕搖動(dòng),

9、使碘液均勻鋪滿整個(gè)平板.如菌苔有透明圈出現(xiàn),表明淀粉已被水解.透明圈的大小,說(shuō)明該菌水解淀粉能力的大小. 取3支檸檬酸鹽斜面培養(yǎng)基，1支接種大腸桿菌，1支接種產(chǎn)氣桿菌，1支作對(duì)照。37培養(yǎng)24 h觀察結(jié)果.培養(yǎng)基變深藍(lán)色者為陽(yáng)性.培養(yǎng)基不變色,則繼續(xù)培養(yǎng)5-7天,培養(yǎng)基仍不變色者為陰性.（九）硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)（九）硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn) 取3支硝酸鹽培養(yǎng)基，1支接種大腸桿菌，1支接種枯草桿菌，1支作對(duì)照。37培養(yǎng)18-96h,每天吸取培養(yǎng)物2ml加格里斯試劑A液和B液1滴,出現(xiàn)粉紅色,玫瑰色,橙色或棕色為陽(yáng)性.如無(wú)陽(yáng)性反應(yīng),可加入1-2滴二苯胺試劑,如培養(yǎng)液呈藍(lán)色,則表示培養(yǎng)液中仍有硝酸鹽存在,而無(wú)亞硝酸鹽存在為陰性.否則,表示硝酸鹽和新形成的亞硝酸鹽存在,而無(wú)亞硝酸鹽存在為陰性.否則,表示硝酸鹽和新形成的亞硝酸鹽都還原成其它物質(zhì),仍按硝酸鹽還原陽(yáng)性處理. 1.實(shí)驗(yàn)時(shí),同時(shí)以未接