植物基因工程載體及其構建ppt課件

1、第八章第八章植物基因工程載體及其構建植物基因工程載體及其構建第一節(jié)第一節(jié)植物基因工程載體種類植物基因工程載體種類第二節(jié)第二節(jié)根癌農桿菌根癌農桿菌Ti質粒的構造與功質粒的構造與功能能第三節(jié)第三節(jié)Ti質?；蜣D化機理質?；蜣D化機理第四節(jié)第四節(jié)Ti質粒的改造及載體構建質粒的改造及載體構建第五節(jié)第五節(jié)常用選擇標志和報告基因常用選擇標志和報告基因植物基因轉化系統(tǒng)植物基因轉化系統(tǒng)l 1.l 1.載體轉化系統(tǒng)載體轉化系統(tǒng)TiTi質粒轉化載體、質粒轉化載體、RiRi質粒轉化載體、病毒轉化載體質粒轉化載體、病毒轉化載體l 2. DNAl 2. DNA直接導入轉化系統(tǒng)原生質直接導入轉化系統(tǒng)原生質體、基因槍體、基

2、因槍l 3.l 3.種質轉化系統(tǒng)花粉管通道法、種質轉化系統(tǒng)花粉管通道法、生殖細胞浸泡法、胚囊子房注射法。生殖細胞浸泡法、胚囊子房注射法。 載體轉化系統(tǒng)是目前植物基載體轉化系統(tǒng)是目前植物基因工程中運用最多、機理最清楚、技術最成熟因工程中運用最多、機理最清楚、技術最成熟的、最重要的一種轉化系統(tǒng)的、最重要的一種轉化系統(tǒng),其中又以其中又以TiTi質粒轉化載體最為重要。質粒轉化載體最為重要。 第一節(jié)第一節(jié) 植物基因工程載體種類植物基因工程載體種類根據(jù)其功能和構建過程，可分為以下種類。根據(jù)其功能和構建過程，可分為以下種類。1目的基因克隆載體：其功能是保管和克隆目的基因。與目的基因克隆載體：其功能是保管和克

3、隆目的基因。與微生物基因工程類似，通常是由多拷貝的微生物基因工程類似，通常是由多拷貝的E.Coli小質粒為載小質粒為載體。體。2中間克隆載體：是構建中間表達載體的根底質粒。是由中間克隆載體：是構建中間表達載體的根底質粒。是由大腸桿菌質粒插入大腸桿菌質粒插入T-DNA片段、目的基因和標志基因等構建片段、目的基因和標志基因等構建而成。而成。3中間表達載體：是含有植物特異啟動子的中間載體。是中間表達載體：是含有植物特異啟動子的中間載體。是構建轉化載體的質粒。構建轉化載體的質粒。4卸甲載體：是解除武裝的卸甲載體：是解除武裝的Ti質?；蛸|?；騌i質粒，是構建轉化質粒，是構建轉化載體的受體質粒。載體的受體

4、質粒。5植物基因轉化載體：是最后用于目的基因導人植物細胞植物基因轉化載體：是最后用于目的基因導人植物細胞的載體，亦稱工程載體。它是由中間表達載體和卸甲載體構的載體，亦稱工程載體。它是由中間表達載體和卸甲載體構建而成。建而成。第二節(jié) 根癌農桿菌Ti質粒的構造與功能 一、Ti質粒的遺傳特性、構造及功能二、T-DNA的基因構造與功能三、Vir區(qū)支配子的基因構造與功能 一、Ti質粒的遺傳特性、構造及功能1. Ti質粒的遺傳特性及類型l Ti質粒是根癌農桿菌染色體外的遺傳物質，為雙股共價閉合的環(huán)狀DNA分子，其分子量為95156106D, 約有200kb組成。l 根據(jù)其誘導的植物冠癭瘤中所合成的冠癭堿種

5、類不同，Ti質粒可以被分成四種類型：章魚堿型(octopine)、胭脂堿型(nopaline)、農桿堿型agropine和農桿菌素堿型agrocinopine或稱琥珀堿型(succinamopine)2. Ti質粒的功能區(qū)域Ti質?？煞譃樗膫€區(qū)。1T-DNA區(qū)transferred-DNA regions： T-DNA是農桿菌侵染植物細胞時，從Ti質粒上切割下來轉移到植物細胞的一段DNA，稱為轉移DNA。該DNA片段上的基因與腫瘤的構成有關。2Vir區(qū)virulence region 該區(qū)段上的基因能激活T-DNA轉移，使農桿菌表現(xiàn)出毒性，故稱之為毒區(qū)。T-DNA區(qū)與Vir區(qū)在質粒DNA上彼此

6、相鄰，約占Ti質粒DNA的三分之一。3Con區(qū)regions encoding conjugations 該區(qū)段上存在著與細菌間接合轉移的有關基因tra，調控Ti質粒在農桿菌之間的轉移。冠癭堿能激活tra基因，誘導Ti質粒轉移，因此稱之為接合轉移編碼區(qū)。4Ori區(qū)origin of replication 該區(qū)段基因調控Ti質粒的自我復制，故稱之為復制起始區(qū)。 3. Ti質粒的生物學功能Ti質粒的功能可歸為以下7個方面: 參與寄主細胞合成植物激素吲哚乙酸IAA和一些細胞分裂素的活動。 誘發(fā)植物產生冠癭瘤并決議所誘導的腫瘤的形狀學特征和冠癭堿成分。 賦予寄主菌株具有分解代謝各種冠癭堿化合物的才干

7、。 賦予寄主菌株對土壤桿菌所產生的細菌素的反響性。 為農桿菌提供附著于植物細胞壁的才干。 決議寄主菌株的植物寄主范圍。 有的Ti質?？梢砸种颇承└鐾寥罈U菌噬菌體生長與發(fā)育，即具有對噬菌體的“排外性。二、T-DNA的基因構造與功能 1.T-DNA的發(fā)現(xiàn) Chilton等人1982利用同位素標志的Ti質粒做探針發(fā)現(xiàn)，參與高濃度煙草腫瘤細胞的DNA后，Ti質粒DNA的復性速度有加快的趨勢。這闡明腫瘤DNA中有Ti質粒的順序，但該順序不多，而且沒有檢測到完好的Ti質粒。以后這些作者將章魚堿型的Ti質粒B6-806用內切酶Sma I分解成19個片段，分別用同位素標志做成探針，然后與腫瘤DNA進展分子雜

8、交，結果有二段Ti質粒的DNA3b和10c。能和腫瘤DNA雜交，也就是Ti質粒中這兩段DNA是與腫瘤DNA同源的部分。進一步研討證明，這部分DNA是從質粒DNA上切割后，轉移到腫瘤細胞，故稱之為轉移DNAtransferred-DNA。這是初次證明在高等植物的細胞內存在有微生物的DNA順序。2.T-DNA的構造特點l Ti質粒T-DNA區(qū)的長度約為23kbl T-DNA僅存在于植物腫瘤細胞的核DNA中；T-DNA含有激發(fā)和堅持腫瘤形狀所必需的基因；T-DNA和植物DNA之間沒有同源l 在T-DNA的5端和3端都有真核表達信號。如TATAbox、AATAAbox及polyA等。l T-DNA的兩

9、端左右邊境各為25bp的反復序列，即邊境序列border sequence，分別稱之為左邊境BL或TL和右邊境BR或TR。(圖8-4)。該25bp邊境序列屬保守序列,但通常右邊境TR序列更為保守，左邊境(TL)序列在某些情況下有所變化。其中心部分是14bp，可分為10bp(CACGATATAT)及4bp(GTAA)兩部分,是完全保守的。左邊境TL缺失突變仍能致瘤,但右邊境TR缺失那么不再能致瘤,這里幾乎完全沒有T-DNA的轉移,這闡明右邊境(TR)在T-DNA轉移中的重要性。 3. T-DNA上的編碼基因及功能T-DNA的轉錄有下述共同點：T-DNA的兩條鏈都是有意義鏈,即都能被轉錄。T-DN

10、A上每個基因都有各自的啟動子?；虻霓D錄由植物細胞RNA聚合酶完成。T-DNA具典型的真核生物RNA合成起始和終止的調理信號，在其5端轉錄起始處有TATA和CAAT盒。同時AATAAA加尾信號也在同一條鏈上發(fā)現(xiàn)，故T-DNA的轉錄機理能夠與真核生物一樣。植物或農桿菌中能夠有甲基化或去甲基化的調理基因活性。T-DNA區(qū)基因的功能 研討方法： 用遺傳學方法在T-DNA區(qū)中引入轉座子，使特定的基因發(fā)生突變，從而在腫瘤細胞中T-DNA的一個或多個轉錄產物也隨之消朱?；蛲蛔兒蟛荒苻D錄出它所編碼的 mRNA，這時可察看到帶有突變基因的T-DNA的植物細胞的表型，從而確定這些基因轉錄產物的功能。用這種方法

11、證明了編碼兩類轉錄產物的基因序列： T-DNA區(qū)編碼的基因 第一類是編碼冠癭堿合成酶及分解代謝基因。 第二類是致瘤基因，前兩個基因被稱作為生長素基因Aux。Aux基因突變將誘導腫瘤細胞莖芽產生,因此Aux基因后來被稱作Tms tumour morphology shoot基因，即腫瘤形狀莖芽基因或Shishoot induction基因，即莖芽抑制基因。目前已查明，實踐上Aux基因包括兩個基因，一個是Aux-lTms-1，編碼色氨酸單加氧酶typtophan mono-oxygenase，將色氨酸轉變成吲哚乙酰胺indol acetamid，IAM，故如今也稱為Iam基因；另一個是Aux-2,

12、編碼吲哚乙酰胺水解酶，將IAM轉變成乙酸吲哚IAA，現(xiàn)稱為iaaH基因。第三個基因是細胞分裂素基因cyt，其突變將引起易生根特性。故稱為Tmrtumour morphology root基因，即腫瘤形狀根基因或Roiroot induction基因，即根抑制基因。 Cyt基因編碼異戊烯基轉移酶isopentenyltransferase，催化異戊烯基焦磷酸鹽isopentenylpyrophosphate和AMP構成細胞分裂素即異戊烯基-AMPisopentenyl-AMP，故現(xiàn)稱為Ipt基因。T-DNA區(qū)編碼基因的功能Aux基因突變將阻斷腫瘤細胞生長素的大量合成，使細胞內的細胞分裂素與生長激

13、素的比值升高。野生型腫瘤細胞中細胞分裂素與生長素的比值為022，而突變型該值上升到14.4，因此有利于芽的形狀發(fā)生。同時Cyt基因突變將會阻斷細胞分裂素的大量合成，兩者之間的比值下降到0.02，因此有利于根的形狀發(fā)生。正是由于Tms和Tmr基因的表達，使轉化植物細胞內激素平衡紊亂，冠癭瘤細胞無限生長，構成激素自主性特性，引起癌變。Tms和Tmr基因是致瘤所必需的基因，因此又稱它們?yōu)橹铝龌騩nc gene。三、Vir區(qū)支配子的基因構造與功能 1. Vir區(qū)支配子的基因構造 除T-DNA外，Ti質粒的vir區(qū)也是農桿菌致瘤所必需的。Vir區(qū)僅位于T區(qū)DNA左側。兩者之間的間隔常隨Ti質粒類型不同

14、而有差別:Octopine的間隔間隔較大,而Nopaline間隔間隔很小。Octopine Ti質粒的Vir區(qū)大小為40bp,含有VirA、B、C、D、E、F、G、H(舊稱PinF)等8個支配子(operon),共24個基因。它們協(xié)同調理，構成一個調控子(regulon),起共調控作用(co-regulation)。而Nopaline有7個支配子,比Octoppine少一個VirF支配子。 2. VirA支配子的誘導表達及功能 對VirA基因進展順序分析發(fā)現(xiàn), VirA是單個基因組成,分子大小為2.8kb，僅編碼一條多肽。Vir基因在接受植物細胞產生的創(chuàng)傷信號分子后才干轉錄活化，其中首先是Vi

15、rA編碼一種結合在膜上的化學受體蛋白membrane bound chemoreceptor protein， 92kD，可直接對植物產生的酚類化合物感應，稱為感應蛋白sensor。當AS與TM-2受體部位結合后，會使整個VirA蛋白構象發(fā)生變化，其C端活化。VirA蛋白的胞質區(qū)有自激酶autokinase的功能，可在保守的組氨酸殘基上磷酸化，從而VirA蛋白被激活。磷酸化的VirA蛋白具有轉移其磷酸鹽至VirG蛋白的才干，使VirG蛋白激活。3. VirG支配子的誘導表達及功能 VirG支配子小于VirA，只需1.0kb，同樣是單基因構造，只能編碼一條多肽，被稱為VirG蛋白，即DNA結合活

16、化蛋白DNA-binding activator protein。它的C端知有DNA結合活性。它的N未端部分具有磷酸化的酸性構造。當磷酸化的A蛋白將其磷酸基轉到VirG蛋白30kD保守的天冬氨酸鹽殘基上時，使VirG蛋白活化。活化的VirG蛋白能夠以二體或多體方式結合到Vir區(qū)啟動子的特定區(qū)域，從而成為其它Vir基因轉錄的激活因子，翻開VirB、C、D、E、H等幾個基因。并己證明，VirA或VirG突變后會減弱或完全失去對其它Vir位點活化的誘導。VirA及VirG的這種調控作用被稱為雙因子調控體系two一component regu1atory system。4. VirH、F及Tzs支配子

17、的誘導表達及其功能這些基因對質粒是特異性的，在Octopine中有VirF、VirH，在Nopaline中有Tzs。 VirH：能夠對植物產生的某些殺菌或抑菌化合物起解毒作用，從而使農桿菌的生長不受這些物質的抑制，可加強致瘤才干。Tzs：大部分Nopaline菌株的Ti質粒上均有Tzs基因,即轉運玉米素合成酶基因trans-zeatin synthease gene，在細菌中表達后將玉米素分泌到細胞外。該細胞分裂素被植物所吸收后，能促進農桿菌感染部位的植物組織脫分化和細胞分裂，提高植物對農桿菌轉化的感受性。VirF支配子編碼一個23kD蛋白，它與任何數(shù)據(jù)庫中一切蛋白質的序列無明顯同源性。最近采

18、用報告基因銜接插入法研討發(fā)現(xiàn)，VirF在T-DNA運輸時發(fā)揚作用。第三節(jié) 農桿菌Ti質?；蜣D化機理知農桿菌附著到植物細胞后，只留在細胞間隙中。T-DNA首先在細菌中被加工、剪切、復制，然后轉入植物細胞，并非整個Ti質粒都進入植物細胞。該基因轉化過程是一個復雜的遺傳工程。一、T-DNA的加工及轉移Vir基因支配子系統(tǒng)被活化后，在農桿菌中可測到單鏈T-DNAss T-DNA，亦稱T鏈或正鏈，T鏈的構成取決于VirD1及VirD2兩種蛋白，這些蛋白一同決議內切酶活性，在邊境反復序列的特定位點構成切口，產生單鏈斷裂。由于T鏈的合成是從右邊境至左邊境，即53，假設右邊境缺失，那么T鏈的合成便無法開場，

19、故目前以為T-DNA是以T鏈方式向植物細胞轉移的，而不是雙鏈的T-DNA分子。左邊境作為DNA合成起始點的效率比右邊境低，這并不是由于左、右邊境的核苷酸序列有什么不同，而是由于在右邊境的右邊約17bp的超驅動序列，它可使T鏈的構成大大添加，故被稱作為“轉化加強子transfer enhancer或overdrive，除去加強子序列導致菌株致病力消逝。T鏈的構成過程如圖8-1示出。1. T-DNA的復制 首先是在下鏈或稱底鏈bottom strand25bp反復序列的右邊境左起第3和第4堿基間缺口剪切，然后從缺口3端開場所成新的DNA鏈，并不斷延伸到左邊境第22堿基處，置換出原來的下鏈，構成ss

20、DNA，即T鏈。Nopaline T-DNA在缺口剪切后構成包括左右邊境在內的單一T鏈，但Octopine T-DNA在剪切后那么可構成6種T鏈，即TL、TC、TR、TL-TC、TC-TR,以及TL-TC-TR，這意味著邊境序列的剪切是相互獨立的。2. VirD1及VirD2的功能 VirD116kD及VirD247Kd蛋白與T-DNA的加工有關，它決議在邊境反復序列的特定位點上構成切口，產生T鏈斷裂。VirD1及virD2突變，T-DNA邊境便不能缺口剪切并構成T鏈。這種缺口剪切可分成兩步：VirDl首先與25bp邊境序列親和結合，使邊境序列松弛，然后使VirD2可在特異位點剪切。VirD2

21、至少有兩個功能，特異剪切，并與T鏈的5端共價結合,該當指出,農桿菌并非以裸露的DNA分子轉入植物細胞,而是T鏈的5端與VirD2蛋白共價結合,這樣可使T鏈的5端不受核酸酶的攻擊。導向功能。知僅VirD2蛋白分子N-端的50%已足以缺口剪切,構成T鏈。VirD2蛋白分子的另一半即C端可作為核定位的信號,引導T鏈進到植物的細胞核,故稱這為“導游。這是由于C端含有特異的氨基酸序列(核靶序列,nuclear targetng sequence)之故。 3. VirC的功能 VirC編碼兩種蛋白VirC1及VirC2蛋白。VirC1蛋白可特異地與Octopine Ti質粒上的超驅動序列結合,從而促進T-

22、DNA邊境序列的缺口剪切。假設VirC支配子突變，那么侵染性減弱。當VirD1、VirD2缺乏時, VirC1有促進T-DNA加工的作用，但當VirD1、VirD2高量表達時,那么VirC1對T鏈的構成無作用。VirC2蛋白的功能尚不清楚。 其它Vir基因產物與邊境缺口剪切及T鏈構成無關。二、T鏈蛋白復合體的構成及VirE的功能 T鏈必需橫向跨越細菌細胞膜、細菌細胞壁、植物細胞壁、植物細胞膜及核膜，才干整合進植物基因內。在此全部轉動過程中，鏈必需防止被核酸降解，因此鏈能夠以一種DNA-蛋白復合體(簡稱T鏈復合體或T復合體)的方式存在。目前知至少有兩種Vir特異蛋白即VirE2及VirD2與T鏈

23、復合體的構成有關。VirE2的功能: 編碼ssDNA結合蛋白,該蛋白(60.5kD)可非特異地與任何ssDNA結合。通達與鏈非共價結合，VirE2可包被T鏈,構成細長的核-蛋白絲,因此能夠在T-DNA轉移過程中起維護T 鏈的作用,使ssDNA抗3和5外切核酸酶和內切核酸酶。VirE2與ssDNA結合后,可使ssDNA解折疊和伸長(約50%),構成一種很細的蛋白。故VirE2不僅維護ssDNA,而且T使鏈形變成一種可轉運的方式。三、三、T鏈復合體的轉運及鏈復合體的轉運及VirB的功能的功能 如上所述,T鏈復合體至少包括T鏈, VirD2及VirE2。VirD2及VirE2能夠已足以維護鏈并對鏈的

24、轉運起導向作用，但鏈的轉運無疑還需求其它活性物質。這種活性物質能夠來自蛋白質，可以是細菌和/或植物的特異蛋白。假設為細菌蛋白，那么能夠是VirB蛋白。由于鏈轉運的第一步是經(jīng)過細菌細胞膜，因此首先必需構成跨膜孔道，需有跨膜或膜結合蛋白的參與。 1. 跨膜或膜結合蛋白有兩個主要特性(1) 穿膜通常需在蛋白質的N端有一信號肽序列，這種蛋白能夠獨立地或在類似伴隨蛋白受體協(xié)助下穿越細菌內膜IM，特異肽酶在N端信號序列處剪切，產生成熟蛋白，并停頓繼續(xù)轉運。(2) 有富含疏水殘基的約20個氨基酸的密接伸長段contiguous stretches。向IM轉運的蛋白質可以但非必需在其N端含剪切的信號序列，但疏

25、水伸長段那么有錨式功能，使蛋白質駐留1odging在膜上。2. VirB的功能 對Ti質粒的VirB支配子序列分析闡明，VirB支配子有11個基因組成，其中絕大多數(shù)編碼跨膜蛋白或膜結合蛋白。VirB蛋白中的10個基因產物具有很好的跨膜拓撲特性，其中3個已被確定為外膜蛋白，一個為內膜蛋白。因此這些蛋白能夠一同在膜上構成一種類似于細菌接合轉移時從供體菌轉至受體菌所必需的構造，即接合孔conjugative pole或性毛sex pilus，T-DNA經(jīng)過這種孔由細菌進入植物細胞。同時，VirB也能夠起運輸和提供能量的作用。知VirB7在Vir蛋白中最小，含信號肽，無跨膜區(qū)，它卻能經(jīng)過細菌內膜，至外

26、膜定位，它也能夠是一種裂解蛋白lysisprotein，起部分裂解農桿菌的作用，使T復合體從細菌細胞中運出，或因其定位在外膜上，可促進與植物細胞外表相互作用。VirB11基因上有ATP結合位點，最近發(fā)現(xiàn)VirB11蛋白確有ATP酶活性，因此它能夠在T-DNA轉移中起提供所需能量的作用。四、T鏈復合體靶向植物細胞核 目前知VirD2及VirE2上有核定位信號(nuclear localizing signal,簡稱NLS)。前已指出，VirD2端50%已足以特異的剪切T-DNA的邊境序列,C端50%那么含NLS。在VirE2中也有類似的序列，將其與Gus交融作為報告基因，證明virE2可使交融蛋

27、白導向植物細胞核，但VirE2與VirD2相比，其核定位功能較弱。 綜上所述，VirD2能夠以一種極性方向，首先將T復合體定向至核孔，而vir E2那么作為一種促進因子，保證很長的T復合體在進入核孔時不受干擾。VirD2及VirE2蛋白上的核定位信號與動物類似，闡明植物和動物的這種信號從進化上講是保守的。 五、五、T鏈整合植物基因組鏈整合植物基因組的分子機理的分子機理 1. 整合位點及其特性 遺傳作圖的分析闡明，T-DNA在植物染色體中的插入是隨機的。它可插入任何一條植物染色體。但插入位點常有以下特點：T-DNA優(yōu)先整合到轉錄活潑的植物基因位點；T-DNA與植物DNA銜接處富含A，T堿基對；植

28、物DNA上的插入靶位點與T-DNA邊境序列有一定程度的同源性。Matsumoto等人以為正是由于這種同源性才使得插入的T-DNA和靶序列能相互接近，并有效地發(fā)生DNA鏈的交換。非常有趣的是他們還發(fā)如今植物基因組靶序列附近有一段dG-dT10序列。這種dG一dT10是真核基因組中保守的高度反復序列。當DNA處于負超螺旋時，該反復序列極易構成Z-DNA，使位于它附近的序列部分解旋，為DNA重組、T-DNA插入提供位點。2. T-DNA的整合機理 Mayerhofer等從轉化的擬南芥菜中分別并測定插入的T-DNA及插入位點序列，發(fā)現(xiàn)T-DNA的插入使得靶序列缺失2973bp。一部分整合的T-DNA片

29、段不完好，兩端均有缺失。靶序列斷裂處與插入的T-DNA兩端有部分重疊。另一部分整合的T-DNA卻堅持完好。其中一些插入的T-DNA能準確地取代植物靶序列，其右邊境與靶序列銜接，T-DNA左未端和靶序列裂口同源。還有一種情形那么是，T-DNA插入片段的未端與缺失的靶序列裂口處并無同源性，而是在其內部有部分短片段與T-DNA未端同源。在靶序列裂口處還發(fā)現(xiàn)有DNA序列的倒位或反復。T-DNA的整合是異常重組illegitimate recombination 的結果。T-DNA右未端在靶序列的識別及銜接中是必需的，T-DNA左未端和兩個靶DNA未端那么參與部分配對和DNA修復。3. T-DNA整合的

30、遺傳效應 T-DNA插入的位點不同，可使轉基因植物具有不同的表型和遺傳特性，即所謂位點效應position effect。知T-DNA可插入多個物理位點。遺傳位點數(shù)普通少于或等于插入的物理位點數(shù)，這是由于甲基化可使基因不表達，或者幾個拷貝連鎖在一同。多拷貝的T-DNA可插入不同的獨立位點，或可首尾串聯(lián)trandem插入同一位點，多拷貝T-DNA進人同一植物細胞后，這些拷貝之間能夠相互作用，導致基因的沉默，這種景象現(xiàn)被稱為共抑制co-supression。T-DNA插入的遺傳特性：(1)T-DNA的插入不引起植物DNA大的重排。但多數(shù)插入會導致靶位點處小的缺失，缺失多至79個核苷酸。(2)另一個

31、常見的結果是，在T-DNA植物DNA銜接處，會有幾個至33個核苷酸的“填充DNAFiller DNA存在，這些“填充DNA的序列與接近銜接處的植物DNA序列類似。(3)在植物靶位處不要求有特異的序列，但假設在T-DNA兩端和植物靶位處之間有一段短序列510b同源，那么可以在整合中起作用。六、農桿菌染色體基因對T-DNA轉移的調控 目前已發(fā)現(xiàn)位于細菌染色體上的一些基因也和T-DNA的轉移有關，并且曾經(jīng)了解它們編碼的蛋白質的功能。ChvA、ChvB、ChvC參與細菌的附著功能；Cel位點與細菌外表纖維絲的合成有關;Att基因影響農桿菌細胞外表蛋白的合成；ivr基因的突變能使農桿菌細胞外表的脂多糖發(fā)

32、生改動而影響農桿菌宿主范圍；PscA和ExoC基因與多糖合成有關，并影響農桿菌附著才干。以上這些基因的突變將使細菌外表成分發(fā)生變化，從而喪失與植物細胞識別和結合的才干。此外，ChvD位點影響AS對毒性區(qū)的誘導效率和農桿菌的致瘤才干。CbvE位點編碼一個單糖結合蛋白，與單糖影響Vir區(qū)的表達有關。Ros基因與Vir基因的負調理有關?？梢?，目前知農桿菌染色體上有10個基因與T-DNA轉移有關。第四節(jié) 農桿菌Ti質粒的改造及載體構建 一、Ti質粒的改造及卸甲載體構建 二、中間載體的構建 三、中間表達載體的構建 四、植物基因轉化載體系統(tǒng)的構建一、Ti質粒的改造及卸甲載體構建 野生型Ti質粒直接作為植物

33、基因工程載體，存在如下妨礙：Ti質粒分子量過大，普通在160240kb，比pBR322質粒大50倍左右，在基因工程中難以操作；大型的野生Ti質粒上分布著各種限制酶的多個切點，不論用何種限制酶切割，都會被切成很多片段，因此難以找到可利用的單一限制性內切酶位點，不能經(jīng)過體外DNA重組技術直接向野生型Ti質粒導入外源基因；T-DNA區(qū)內含有許多編碼基因，其中Onc基因的產物干擾宿主植物中內源激素的平衡，轉化細胞長成腫瘤，妨礙細胞的分化和植株的再生；Ti質粒不能在大腸桿菌中復制, 即使得到重組質粒，也只能在農桿菌中進展擴增；而農桿菌的轉化率極低10左右,因此，經(jīng)過Ti質粒的體外操作，在常規(guī)分子克隆條件

34、下幾乎不能構建在T-DNA中只需單一切點的載體；Ti質粒上還存在一些對于T-DNA轉移不起任何作用的基因。 為了使Ti質粒成為有效的外源基因導入載體，必需對野生型Ti質粒進展一番科學的改造。非常僥幸的是，大腸桿菌具有能與農桿菌高效地接合轉移的特性。因此，科學家們可以先將T-DNA片段克隆到大腸桿菌的質粒中，并插入外源基因，最后經(jīng)過接合轉移把外源基因引入到農桿茵的Ti質粒上，這是一種把預先進展亞克隆、切除、插入或置換的T-DNA引入Ti質粒的有效方法。帶有重組T-DNA的大腸桿菌質粒衍生載體稱為中間載體intermediate vector，而接受中間載體的Ti質粒那么稱為受體Ti質粒accep

35、tor Ti p1asmid，普通是卸甲載體disarmed vector。1 Onc-卸甲載體 所謂卸甲載體就是無毒的non-oncogenicTi質粒載體。由于利用野生型的Ti質粒作載體時，影響植株再生的直接緣由是T-DNA中Onc基因的致瘤作用。因此，為了使野生型的Ti質粒成為基因轉化的載體，必需切除T-DNA上的Onc基因，即“解除其“ 武裝,構建成所謂“卸甲或稱“繳械載體disarmed vector。在這種Onc-載體中，曾經(jīng)缺失的T-DNA部位被大腸桿菌的一種常用的質粒pBR322取代。這樣任何適宜于克隆在 pBR322質粒中的外源DNA片段，都可以經(jīng)過與 pBR322質粒DNA

36、的同源重組，而被共整合到Onc-Ti質粒載體上。2. Onc十卸甲載體 對于研討外源基因在轉基因植株中的表達，以及對于以改良農作物為目的的植物基因工程而言， Onc一體系是最有用的。不過，人們能夠還要設計一些特殊的實驗來研討外源基因在冠癭瘤組織中的表達問題。在這種情況下，運用Onc十 菌株載體那么比較適宜。由于冠癭瘤組織具有不依賴于激素的表型特征，所以這種載體系統(tǒng)的優(yōu)點在于它可以快速地增生冠癭組織，比較快速而容易得到轉化體。二、中間載體的構建 1. 中間載體的根本構造與特點 為處理Ti質粒不能直接導入目的基因的困難，構建中間載體intermediate vector 是有效方法之一。中間載體是

37、一種在一個普通大腸桿菌的克隆載體例如pBR322質粒中插入了一段適宜的T-DNA片段，而構成的小型質粒。中間載體通常是多拷貝的E.Coli小質粒，這一點對于經(jīng)過體外遺傳操作導入外源基因是非常必要的。從構造特點看可分為兩類中間載體，即共整合系統(tǒng)中間載體和雙元載體系統(tǒng)中間載體。共整合系統(tǒng)中間載體的特征中間載體必需含有與Ti質粒T-DNA區(qū)同源的序列，此外含有pBR的序列，在其被引入到根癌農桿菌后即可高頻地與Ti質粒的T-DNA的同源序列進展重組；它應具有一個或幾個細菌選擇標志，這將有利于挑選共整合質粒；它必需 有bom位點，在有誘導質粒存在的情況下，bom位點的存在可以使中間載體在不同細菌細胞內進

38、展轉移；它應該含有陽性植物選擇標志，以利于轉化植物細胞的挑選，例如新霉素磷酸轉移酶(neomycin phosphotransferase,Npt-)基因，其可賦予轉化植物細胞卡那霉素抗性；它應該含有單一的限制性內切酶切點，以利于外源基因的插入；無Ti質粒的邊境序列。雙元載體系統(tǒng)的中間載體與共整合系統(tǒng)中間載體不同之處是無同源序列；具有LB和RB;無Co1E1復制點 三、中間表達載體的構建 中間載體從功能看可分為兩大類，即克隆載體和表達載體?？寺≥d體的主要功能是復制和擴增基因；表達載體是適于在受體細胞中表達外源基因的載體。 上述構建的中間載體導入農桿菌Ti質粒并轉化到植物細胞后，插入的外源基因能

39、否得到表達是一個非常重要的問題。研討闡明，早期曾經(jīng)過各種中間載體引入的外源基因，如轉座子的抗生素抗性基因、酵母的乙醇脫氫酶基因、動物的-珠蛋白基因和干擾素基因等，均未能在植物中表達。這是由于這些外源基因都缺乏特異啟動子的緣故，后來的研討發(fā)現(xiàn)，在中間載體中加上能在植物細胞中表達的各種啟動子后，可使外源基因能在植物細胞中表達。這類含植物 特 異 啟 動 子 的 中 間 載 體 就 稱 為 中 間 表 達 載 體intermediate expression vector。1啟動子及其它調控序列轉錄的調控對真核生物基因表達起著關鍵性作用。就真核生物基因表達調控序列而言，大多數(shù)真核生物在轉錄起始點的5

40、端上游區(qū)第30至25bp處具有TATA盒，在70至 80bp處還有CAAT盒。在大多數(shù)真核生物基因的3端具有AATAA序列。這些5和3端的調控序列對真核生物的基因表達起著關鍵性作用。Ti質粒雖然來源于農桿菌， 但其Nos、Ocs、Tmr等基因具有與真核生物啟動子類似的TATA盒和CAAT盒，均能在植物細胞中表達，并且無組織特異性。因此，它們成為早期構建嵌合基因的啟動子，其中以Nos啟動子pNos最常用。1啟動子及其它調控序列 近年來的研討發(fā)現(xiàn),來自花椰菜花葉病毒DNA的CaMV的35s啟動子能使嵌合的外源基因在植物細胞中表達，并表現(xiàn)出劇烈的表達功能。由CaMV35s啟動子、外源構造基因及Nos

41、3端的非編碼區(qū)域組成的嵌合基因，能在植物細胞中很快高效表達。 CaMV35s啟動子既無組織特異性，又不受發(fā)育時期的影響，是一個理想的植物基因工程的啟動子。另外，近年來也發(fā)現(xiàn)，19s啟動子亦能使嵌合基因在植物細胞中表達。近年來，從植物基因中分別出組織特異表達啟動子及誘導表達啟動子，為實現(xiàn)外源基因的定時、定位高效表達奠定了根底。 2.嵌合基因chimeric gene構建 所謂嵌合基因就是來自兩種或兩種以上生物的啟動子、構造基因、終止子銜接在一同構成基因。3 中間表達載體的構建過程中間表達載體是由中間載體加上能在植物細胞中表達的啟動子及基因構成，也就是嵌合基因插入中間載體后構成，所以中間載體的構建

42、是一個非常復雜的過程。 下面以pLGV2381為例簡要地闡明其構建過程。見圖8-1四、植物基因轉化載體系統(tǒng)的構建 上述構建的中間表達載體依然不能直接作為植物外源基因轉化的載體，由于中間表達載體仍是一種細菌的質粒，不能把外源基因轉化到植物細胞。因此，必需進一步把中間載體引入到上述已改造的受體Ti質粒中，并構建成能侵染植物細胞的基因轉化載體，才干運用于植物基因的轉化。它是由兩種以上質粒構成的復合型載體，故稱之為載體系統(tǒng)。近年來的研討曾經(jīng)建立許多種載體系統(tǒng)，但目前主要采用兩種Ti質?；蜣D化載體系統(tǒng)，即一元載體系統(tǒng)和雙元載體系統(tǒng)。1一元載體系統(tǒng)的構建這一類載體是中間表達載體與改造后的受體Ti質粒之間

43、，經(jīng)過同源重組所產生的一種復合型載體，通常亦稱為共整合載體co-intergrated vecter，又由于該載體的T-DNA區(qū)與Ti質粒Vir區(qū)連鎖，因此又稱之為順式載體cis-vector。一元載體的特點是:由兩個質粒E.coli質粒和Ti質粒重組而成，分子量較大；共合體的構成頻率與兩個質粒的重組頻率有關,相對較低；必需用Southern雜交或PCR對大的共整合體質粒進展檢測；構建時比較困難。一元載體系統(tǒng)目前主要有兩種載體：共整合載體和拼接未端載體split-end vector,SEV。 1共整合載體的構建共整合載體的特點是：中間表達載體與受體Ti卸甲載體，經(jīng)過同源重組共整合而構建；中間

44、表達載體與受體Ti質粒之間同源序列是pBR322。共整合載體的構建過程 l中間載體pLGV1103導入農桿菌:目前通常采用兩種方法，即接合轉移法conjugative transfer和三親雜交轉移法。 2中間載體與受體Ti質粒的同源重組。 3共整合載體的選擇。 2 SEV的構建SEV系統(tǒng)即T-DNA邊境拼接系統(tǒng)，亦稱拼接末端載體sp1it-end vecter ,SEV。它是由Freley等人于1985年建立的另一種共整合載體，也由于它的兩個LIH序列在同源重組前分別處于不同質粒上而得名。SEV與pGV3850的差別及構建過程如下述：1SEV的受體Ti質粒的T-DNA上的致瘤基因onc及TR

45、都已被缺失，T-DNA的保管部分被稱為“左邊境內部同源區(qū)1eft inside homcology，LIH。該受體Ti質粒還保管了Vir基因及其它正常的功能基因，同時還攜有用于細菌挑選的抗性基因。2SEV中間載體具有一個細菌的抗性基因，一個植物抗性基因及與受體Ti質粒同源的LIH序列及TR。 3經(jīng)過三親雜交將中間載體導入農桿菌后，由于它們之間都具有LIH同源序列，即可發(fā)生同源重組，構成SEV的共整合載體。 3 SEV與pGV3850比較 兩者都是經(jīng)過受體Ti質粒與中間載體同源重組而構成，故同屬于共整合的一元載體系統(tǒng)，但它們之間有著一定的差別：1它們的受體Ti質粒與中間載體的構造不同。pGV38

46、50的左右邊境在一個受體Ti質粒上，而SEV來自二個質粒，即TR來自中間載體。、2同源序列不同。 pGV3850重組的同源序列是pBR322，而SEV是LIH。3SEV是更有效的共整合載體。由于pGV3850共整合載體，帶有大腸桿菌pBR322序列，外源基因嵌合在該序列中，因此轉化的植物中也帶有反復的pBR322序列。此反復序列能夠對轉化植物中的外源基因的穩(wěn)定性有影響，而SEV系統(tǒng)那么排除了這種能夠。2雙元載體系統(tǒng) 雙元載體binary vecter系統(tǒng)是指由兩個分別含T-DNA和Vir區(qū)的相容性突變Ti質粒構成的雙質粒系統(tǒng),又由于其T-DNA與Vir基因在兩個獨立的質粒上，經(jīng)過反式激活T-D

47、 N A 轉 移 , 故 稱 之 為 反 式 載 體 t r a n s vecter.1雙元載體系統(tǒng)的構建原理 雙元載體主要包括兩個Ti質粒，即微型Ti質粒和輔助Ti質粒。 Ti質粒上的Vir基因與T-DNA具有反式互補作用，Vir基因可以反式激活T-DNA的轉移。其次，中間載體含有廣泛寄主范圍質粒的復制起始點oriV，而替代了共整合載體中用以重組的同源區(qū)，可以在任何農桿菌寄主里自發(fā)復制。2微型Ti質粒mini-Ti plasmid 雙元載體系統(tǒng)是在微型Ti質粒根底上產生的。所謂微型質粒就是含有T-DNA邊境、缺失vir基因的Ti質粒。Mini-Ti是一個廣譜質粒，除含有T-DNA左、右邊境

48、外，還具有廣譜質粒的復制位點oriV及選擇標志基因。 Bevan等1984構建的pBinl9微型質粒圖822是運用得最廣泛的Mini-Ti。它含有來自pTiT37的T-DNA左右邊境序列，在兩個邊境序列之間的T-DNA區(qū)含有植物選擇標志NptII基因，以及來自噬菌體M13mpl9的多種酶銜接接頭的LacZ基因。在LacZ基因內部含有多克隆位點，外源基因可以便利地插入其間使其本身失活。此外，Binl9含有廣宿主質粒Rk2的復制和轉移的起始位點。3輔助Ti質粒 含有Vir區(qū)段的Ti質粒稱為輔助Ti質粒he1per Ti。實踐上輔助Ti質粒是T-DNA缺失的突變型Ti質粒，完全喪失了致瘤功能，因此是

49、相當于在共整合載體系統(tǒng)中的卸甲Ti質粒disarmed Ti。其主要作用是提供Vir基因功能，激活處于反式位置上的T-DNA轉移，該卸甲載體在此又稱之為輔助Ti質粒he1per Ti。 最常用的輔助Ti質粒是根癌農桿菌LBA4404所含有的Ti質粒pAL4404。其為章魚堿型Ti質粒pTiAch5的衍生質粒，其T-DNA區(qū)已發(fā)生缺失突變，但仍保管有完好的Vir基因功能。近年來的研討闡明，野生型的Ti質粒即不卸甲的Ti質粒，同樣可以作為輔助Ti質粒，而且具有更強毒性。 4雙元載體的構建 將Mini Ti質粒轉入含有He1per Ti質粒根癌農桿菌的途徑有兩條，一條是直接用純化的Mini Ti質粒

50、轉化速凍的根癌農桿菌感受態(tài)細胞；另一條是與共整合載體構建一樣，采用三親接合的方式。Mini Ti質粒均能以E.coli的pRK2019為輔助質粒，經(jīng)過三親雜交而接合轉移到含有輔助Ti質粒的農桿菌細胞內。由于E.coli的pRK2019不能在農桿菌中復制最后消逝，含有Mini Ti質粒和He1per Ti質粒的根癌農桿菌可直接用于植物細胞的轉化。 5一元載體系統(tǒng)和雙元載體系統(tǒng)的比較 綜上所述，雙元載體系統(tǒng)與一元載體系統(tǒng)之間有著較大的差別： 1雙元載體不需求共整合過程，因此系統(tǒng)中的兩個質粒不用含有同源序列。 2Mini-Ti質粒具有E.coli質粒的復制位點、能在農桿菌的寄主中復制，使其質粒的拷貝

51、數(shù)添加10100倍，而且Mini-Ti質粒分子量小10kb，可以直接進展體外遺傳操作。 3雙元載體不需經(jīng)過兩個質粒的共整合過程，因此構建的操作步驟比較簡單。 4由于mini-Ti質粒較小，并無共整合過程，因此質粒轉移到農桿菌比較容易，而且構建的頻率較高。5一元載體系統(tǒng)和雙元載體系統(tǒng)的比較5由于根癌農桿菌感染的寄主范圍是由Vir基因及染色體上的基因決議的，因此，運用雙元載體系統(tǒng)更便于根據(jù)轉化資料的來源不同選擇適宜的He1per系統(tǒng)。6雙元載體在外源DNA轉入植物細胞前，無需進展同源重組，插入載體的外源基因變異能夠要比pGV3850系統(tǒng)來得小。 7共整合載體系統(tǒng)比雙元載體系統(tǒng)更難以運用，通常一個共

52、整合載體在用于植物轉化之前，應弄清Ti質粒的拷貝數(shù)和大小，所以必需經(jīng)過southern雜交來鑒定。8) 共整合載體的重組頻率很低，而雙元載體系統(tǒng)的兩個質粒接合的頻率較高，普通至少高4倍，因此雙元載體的構建頻率較高。9共整合載體構建勝利后，工程菌的穩(wěn)定性較好，雙元載體穩(wěn)定性較差，容易喪失。10雙元載體在外源基因的植物轉化中效率高于共整合載體。3載體卡盒 當一個動植物的外源基因插入轉錄載體后實現(xiàn)表達的程度高低非常重要，高效表達系統(tǒng)的建立在基因工程中非常有用。所以科學家們不斷地構建一些復雜的載體來提供全部必需的表達信號。最近幾年來，更先進的一代表達載體已得到開展。這些載體以卡盒方式提供基因表達所需的

53、全部信號，包括啟動子、終止子、加強子等。然后新的外源基因被插入到表達信號簇中間的獨一限制性切點，所以稱之為盒式載體。在植物基因轉化載體構建中同樣采用了上述原理構建成載體卡盒。所謂載體卡盒(vecter cassette)圖8-23是將植物標志基因、多克隆位點、細菌標志基因和廣譜質粒的復制和發(fā)動功能均集于一身的集裝箱似的載體系統(tǒng)。利用載體卡盒可以更便利地構建基因轉化載體。五、載體構建中常用的選擇標志及報告基因 如何選擇和挑選轉化體同樣是一個重要問題?？茖W家家不斷試圖把轉化體帶上一個標志，從而便于選擇和挑選。至今己建立了許多標志基因，并已插入各種轉化載體中，作為一種標志基因。不論是選擇標志基因還是挑選標志基因，后者亦稱報告基因都必需具備以下四個條件：編碼一種不存在于正常植物細胞中的酶；基因較小，可構成嵌合基因；能在轉化體中得到充分表達；檢測容易，并且能定量分析。選擇標志基因和挑選標志基因除具有上述共同之處外，它們在功能和性質上還有一定差別。選擇標志基因的功能主要是該基因的產物給予植物細胞產生一種選擇壓力，致使未轉化細胞不能生長、發(fā)育與分化。而轉化細胞對該標志產生抗性，不影響其生長等，從而將轉化細胞選擇出來，例如， Cat氯霉抗性基因。挑選標志基因強調給轉化細胞帶上一種標志，起報告和識別作用，故稱報告基因。 1選擇標志的