基因的功能驗證陳璟

1、20世紀人類科技史上的三大創(chuàng)舉40年代第一顆原子彈爆炸60年代人類首次登上月球90年代人類基因組計劃基因組學包括3個不同的亞領域結構基因組學(structural genomics) 功能基因組學(functional genomics)比較基因組學(comparative genomics) 基因組學概念 一是通過一是通過增強其表達增強其表達，取得表達產物進行研究，取得表達產物進行研究， 增強其表達增強其表達因為不能反映基因產物的真實表達情況，而逐漸因為不能反映基因產物的真實表達情況，而逐漸被被拋棄拋棄 基因的異源表達，在近緣物種類表達目的基因?；虻漠愒幢磉_，在近緣物種類表達目的基因。 二

2、是二是減弱減弱或者或者終止其表達終止其表達，觀察整體功能的變化，進而推測相應的，觀察整體功能的變化，進而推測相應的基因基因功能功能DNA-Binding DomainBait ProteinPrey ProteinTranscription Activating RegionReporter GeneDNA-Binding Site酵母雙雜交技術酵母雙雜交技術反式作用因子中的兩個功能結構域反式作用因子中的兩個功能結構域 DNA結合域結合域 轉錄激活結構域轉錄激活結構域 鑒定新的蛋白與蛋白相互作用 鑒定蛋白級聯(lián)底物 鑒定突變對蛋白與蛋白結合的影響 在已知的相互作用中鑒定干擾蛋白質 (反向雙雜交系

3、統(tǒng))酵母雙雜交系統(tǒng)應用酵母雙雜交系統(tǒng)應用利用酵母作為真核蛋白相互作用的模型 第一相電泳根據(jù)蛋白質的不同等電點分離各種蛋白質，即等第一相電泳根據(jù)蛋白質的不同等電點分離各種蛋白質，即等電聚焦法電聚焦法(isoelectrie focusing IEF) 第二向電泳根據(jù)蛋白質的不同分子量進一步分離等電點相同第二向電泳根據(jù)蛋白質的不同分子量進一步分離等電點相同的蛋白質，即的蛋白質，即SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 雙向凝膠電泳技術是目前蛋白質組研究的主要技術之一雙向凝膠電泳技術是目前蛋白質組研究的主要技術之一, 雙向電雙向電泳根據(jù)等電點和分子量可一次性分離數(shù)千種蛋白質

4、，經染色后泳根據(jù)等電點和分子量可一次性分離數(shù)千種蛋白質，經染色后蛋白質再蛋白質再PAGE上可形成密度不同、分布不均的復雜點圖譜。上可形成密度不同、分布不均的復雜點圖譜。 如何有效的對雙向凝膠電泳圖像分析，如何對圖譜上的蛋白質如何有效的對雙向凝膠電泳圖像分析，如何對圖譜上的蛋白質點進行檢測、定量、比較、分析和歸類，挖掘有價值的蛋白質點進行檢測、定量、比較、分析和歸類，挖掘有價值的蛋白質點的信息是雙向電泳分析軟件所要解決的問題。點的信息是雙向電泳分析軟件所要解決的問題。差異點：蛋白質的分離與鑒定蛋白質的分離與鑒定 蛋白質經雙向電泳分離及圖像分析后，將蛋白質斑點膠塊切下，用蛋白酶通常用胰蛋白酶)對蛋

5、白質樣品進行膠內酶解，獲得肽片段 上質譜分析蛋白質成分質譜基礎質譜基礎樣品離子源質量分析器離子檢測器固體液體蒸汽形成離子(帶電分子)電離質量分選(過濾)檢測根據(jù)m/z分選離子數(shù)據(jù)處理質譜檢測離子基本步驟:1. 樣品離子化 2. 根據(jù)質量(m/z)不同分離離子3. 檢測每種質量離子的數(shù)目 4. 收集、處理數(shù)據(jù)得到質譜圖 組織切片或印片原位質譜分析技術 兩級飛行時間串聯(lián)質譜（MALDI-TOF/TOF）傅里葉轉換回旋共振質譜（FTMS） 表面增強激光解吸/電離飛行時間質譜（SELDI-TOF-MS） 聯(lián)合技術精確鑒定蛋白質 文庫篩選基因組學包括3個不同的亞領域結構基因組學(structural g

6、enomics) 功能基因組學(functional genomics)比較基因組學(comparative genomics) 基因組學概念基因組學包括3個不同的亞領域結構基因組學(structural genomics) 功能基因組學(functional genomics)比較基因組學(comparative genomics) 基因組學概念 鑒定新的蛋白與蛋白相互作用 鑒定蛋白級聯(lián)底物 鑒定突變對蛋白與蛋白結合的影響 在已知的相互作用中鑒定干擾蛋白質 (反向雙雜交系統(tǒng))酵母雙雜交系統(tǒng)應用酵母雙雜交系統(tǒng)應用 雙向凝膠電泳技術是目前蛋白質組研究的主要技術之一雙向凝膠電泳技術是目前蛋白質組研究的主要技術之一, 雙向電雙向電泳根據(jù)等電點和分子量可一次性分離數(shù)千種蛋白質，經染色后泳根據(jù)等電點和分子量可一次性分離數(shù)千種蛋白質，經染色后蛋白質再蛋白質再PAGE上可形成密度不同、分布不均的復雜點圖譜。上可形成密度不同、分布不均的復雜點圖譜。 如何有效的對雙向凝膠電泳圖像分析，如何對圖譜上的蛋白質如何有效的對雙向凝膠電泳圖像分析，如何對