雞胚接種方法

1、方法方法 應(yīng)應(yīng) 用用 價價 值值 存存 在在 問問 題題動物動物接種接種應(yīng)用最早；應(yīng)用最早；方法簡便；方法簡便；結(jié)果易于觀察結(jié)果易于觀察自身帶病毒；自身帶病毒；有的接種后不敏感；有的接種后不敏感；動物飼養(yǎng)問題動物飼養(yǎng)問題雞胚雞胚培養(yǎng)培養(yǎng)來源客觀，易于管理，帶來源客觀，易于管理，帶病毒機會少；多途徑接種病毒機會少；多途徑接種敏感病毒譜窄敏感病毒譜窄細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)應(yīng)用廣泛，敏感病毒譜廣應(yīng)用廣泛，敏感病毒譜廣設(shè)備技術(shù)要求條件高設(shè)備技術(shù)要求條件高病毒分離培養(yǎng)病毒分離培養(yǎng) 雞胚培養(yǎng)法的雞胚培養(yǎng)法的優(yōu)點優(yōu)點：1. 它的組織分化程度低，可選擇適當(dāng)途徑它的組織分化程度低，可選擇適當(dāng)途徑接種，病毒易復(fù)制，感染

2、病毒的膜和液體接種，病毒易復(fù)制，感染病毒的膜和液體含大量病毒。含大量病毒。2. 是個整體，有神經(jīng)血管的分布及臟器的是個整體，有神經(jīng)血管的分布及臟器的構(gòu)造。構(gòu)造。3. 來源充足，操作簡單，通常是無菌的，來源充足，操作簡單，通常是無菌的，對接種的病毒不產(chǎn)生抗體。對接種的病毒不產(chǎn)生抗體。 雞胚培養(yǎng)法的雞胚培養(yǎng)法的缺點缺點：1. 一般的病毒通常不使雞胚產(chǎn)生特異性的感染指一般的病毒通常不使雞胚產(chǎn)生特異性的感染指征。征。2. 卵黃中常常含有抗家禽病原體的母體抗體。卵黃中常常含有抗家禽病原體的母體抗體。3. 某些細(xì)菌、衣原體和病毒能夠從感染的母雞傳某些細(xì)菌、衣原體和病毒能夠從感染的母雞傳遞到雞胚。遞到雞胚。

3、4. 通常雞胚常常含有白血病病毒。通常雞胚常常含有白血病病毒。5. 在雞食物中加入抗菌素，母雞吃后會傳遞給雞在雞食物中加入抗菌素，母雞吃后會傳遞給雞胚，雞胚就會產(chǎn)生對立克次體和衣原體感染的抵胚，雞胚就會產(chǎn)生對立克次體和衣原體感染的抵抗?？?。二、雞胚的結(jié)構(gòu)與生理 雞胚是由三個胚層發(fā)育起雞胚是由三個胚層發(fā)育起來的，即來的，即外胚層外胚層，中胚層中胚層和和內(nèi)內(nèi)胚層胚層，它們構(gòu)成胚胎的組織與，它們構(gòu)成胚胎的組織與器官。器官。 （約（約10日齡雞胚的結(jié)構(gòu)見圖）日齡雞胚的結(jié)構(gòu)見圖）氣室雞胚卵黃囊尿囊腔羊膜腔絨毛尿囊膜卵白卵膜雞胚的管理雞胚的管理（一）雞胚的選擇（一）雞胚的選擇首選健康萊亨雞受精卵，其殼潔白

4、易于觀首選健康萊亨雞受精卵，其殼潔白易于觀察胚胎，其他受精卵也可使用。接種病毒察胚胎，其他受精卵也可使用。接種病毒的受精雞卵應(yīng)未感染已知病毒或其它微生的受精雞卵應(yīng)未感染已知病毒或其它微生物（如新城疫病毒或支原體等），最好來物（如新城疫病毒或支原體等），最好來自無特定病原體（自無特定病原體（specified-pathogens free，SPF）雞群，接種立克次體的受精雞雞群，接種立克次體的受精雞卵應(yīng)來自未食用高濃度抗生素的雞群。卵應(yīng)來自未食用高濃度抗生素的雞群。 雞胚的孵育雞胚的孵育受精雞卵孵育時不要擦洗，以免受細(xì)菌污染。最受精雞卵孵育時不要擦洗，以免受細(xì)菌污染。最好用能自動調(diào)節(jié)溫度、濕度、

5、氣流及翻卵的孵卵好用能自動調(diào)節(jié)溫度、濕度、氣流及翻卵的孵卵箱孵育。如沒有，也可用普通恒溫箱，但要在溫箱孵育。如沒有，也可用普通恒溫箱，但要在溫箱中放一盛滿水的方盤，以保持適當(dāng)?shù)臐穸?。孵箱中放一盛滿水的方盤，以保持適當(dāng)?shù)臐穸?。孵育?yīng)在育應(yīng)在3739、40%70%的相對濕度下的相對濕度下進行。濕度太高會使氣室發(fā)育過度，而濕度過低進行。濕度太高會使氣室發(fā)育過度，而濕度過低又會導(dǎo)致氣室發(fā)育不良，甚至造成雞胚死亡。通又會導(dǎo)致氣室發(fā)育不良，甚至造成雞胚死亡。通氣也很重要，如果空氣不流通，也可造成雞胚死氣也很重要，如果空氣不流通，也可造成雞胚死亡。為了避免胚胎膜粘連和胚胎發(fā)育不均勻，應(yīng)亡。為了避免胚胎膜粘連

6、和胚胎發(fā)育不均勻，應(yīng)每隔一段時間轉(zhuǎn)動一次受精雞卵。每隔一段時間轉(zhuǎn)動一次受精雞卵。檢卵檢卵在發(fā)育的早期，雞胚不易辨認(rèn)，要到在發(fā)育的早期，雞胚不易辨認(rèn)，要到45天天后才容易看見。因此，檢卵要在孵育后才容易看見。因此，檢卵要在孵育45天天后進行?；畹碾u胚絨毛尿囊膜界線較明顯，后進行?；畹碾u胚絨毛尿囊膜界線較明顯，上面的血管清晰可見、成網(wǎng)狀，可看到明顯上面的血管清晰可見、成網(wǎng)狀，可看到明顯的胚胎自主運動。如果胚胎活動呆滯或不能的胚胎自主運動。如果胚胎活動呆滯或不能自主運動，血管模糊、變細(xì)、折斷脫落，絨自主運動，血管模糊、變細(xì)、折斷脫落，絨毛尿囊膜界線模糊，說明雞胚已瀕臨死亡或毛尿囊膜界線模糊，說明雞胚

7、已瀕臨死亡或已經(jīng)死亡。已經(jīng)死亡。 接種前后都要檢卵。接種前接種前后都要檢卵。接種前檢卵是要了解雞胚的存活情況，檢卵是要了解雞胚的存活情況，標(biāo)記氣室邊界和胚胎位置；接種標(biāo)記氣室邊界和胚胎位置；接種后檢卵是為了觀察接種后胚胎的后檢卵是為了觀察接種后胚胎的狀況。狀況。 發(fā)育正常胚與異常胚的辯別1、正常胚 頭照可見眼點明顯，血管色鮮紅，呈放射狀；二照可見整個蛋除氣室外均布滿鮮紅血管（合攏）三照時蛋的小頭看不到發(fā)亮部分（封門），氣室界線邊緣血管鮮紅。2、弱胚蛋 頭照胚體小，呈低階段纖細(xì)血管，眼點不明顯；二照可見小頭有0.5cm2以上區(qū)域無血管分布；三照時小頭發(fā)亮，氣室界線邊緣的血管面較大。3、死胚蛋 頭

8、照可見血點、血線或血環(huán)緊貼內(nèi)殼面，血管色因氧化而比活胚深，有時散黃或有灰白色凝塊；中期死胚特征是氣室界線模糊，胚胎呈黑團狀，常與殼粘連，不動，當(dāng)手搖胚蛋時，胚胎隨之轉(zhuǎn)動，停止搖晃時也隨之停止。而活胚時刻在活動；三照死胚的小頭發(fā)亮，血管色深，氣室界線模糊，蛋體發(fā)涼；對尚未出殼的也可用溫水來判斷將蛋放入40C溫水中，凡是在水中輕微晃動的為活胚，反之則為死胚。 三、材料（一）受精雞卵（一）受精雞卵（二）孵卵箱或恒溫箱（二）孵卵箱或恒溫箱（三）撿卵燈，照卵燈（三）撿卵燈，照卵燈（四）砂輪、三棱針（四）砂輪、三棱針（五）卵盤、卵杯（五）卵盤、卵杯（六）其它：（六）其它：1 1mlml注射器，針頭，注射器

9、，針頭，2.5%2.5%碘酒，碘酒，75%75%酒精，鑷子，無菌生理鹽水，毛細(xì)吸管，酒精，鑷子，無菌生理鹽水，毛細(xì)吸管，橡膠吸頭，液體石蠟，蠟和膠布等。橡膠吸頭，液體石蠟，蠟和膠布等。四、接種技術(shù)（一）活胚檢查（一）活胚檢查 1.血管血管：活胚可見清晰的血管，有時可見血管搏動，死胚血管模糊成淤血帶或淤血塊。 2.胎動胎動：活胚可見明顯的自然運動，尤其在轉(zhuǎn)動胚胎時，死胚見不到任何胎動，胚胎發(fā)紅像出血樣，有的呈現(xiàn)黑塊。 3.血管網(wǎng)是否豐滿血管網(wǎng)是否豐滿：發(fā)育好的雞胚可見密布豐滿的血管網(wǎng)，也就是絨毛尿囊膜，死胚則見不到這一現(xiàn)象。第一天胚盤直徑0.7cm，胚重0.2mg，在胚盤明區(qū)形成原條，其前方為原

10、結(jié)，原結(jié)前端為頭突，頭突發(fā)育形成脊索神經(jīng)管，中胚層的細(xì)胞沿著經(jīng)管兩側(cè)，形成左右對稱的呈方形薄片的體節(jié)4-5對，中胚層進入暗區(qū)在胚部的邊緣出現(xiàn)許多紅點，俗稱血島；第二天胚盤直徑1.0cm，胚重3mg，卵黃囊羊膜絨毛膜開始形成，胚胎頭部開始從胚盤分離出來，血島合并形成血管，入孵25小時心臟開始形成，30-42小時后心臟開始跳運，可見到20-27對體節(jié)，照蛋時可見卵黃囊血管區(qū)，形似櫻桃，俗稱櫻桃珠第三天胚長0.55cm，胚重20mg，尿囊開始長出，胚的位置與蛋的長軸垂直，開始形成前后肢芽，出現(xiàn)5個腦胞的原基，眼的色素開始沉著，有35對體節(jié)，照蛋時，可見胚和伸展的卵黃囊血管形似蚊子，俗稱“蚊蟲珠”；第

11、4天胚長0.77cm，胚重50mg，孵黃囊血管包圍蛋黃達1/3，肉眼明顯看到尿囊，羊膜腔形成，胚和蛋黃分離，由于中腦迅速生長，胚胎頭部明顯增大，舌開始形成，照蛋時蛋黃不容易轉(zhuǎn)動，胚與卵黃囊血管形似蜘蛛，俗稱小蜘蛛；第5天胚長1.0cm，胚重0.13g，生殖腺已性分化，組織學(xué)上可確定胚的公母，胚極度彎曲，整個胚胎成“C”形，可見指（趾）原基，眼的黑色素大量沉著，照蛋時可明顯看到黑色的眼點，俗稱單珠或黑眼；第6天胚長1.38cm，胚重0.29g，尿囊已達蛋殼膜內(nèi)表面，卵黃囊分布在蛋黃表面的1/2以上，由于羊膜壁上的平滑肌收縮，胚胎有規(guī)律運動，蛋黃由于蛋白水分的滲入而達到最大重量，由約占蛋重的30.

12、01%增至65.48%，喙原基出現(xiàn)，軀干部增長，翅腳已可區(qū)分，照蛋時，可見頭部和增大的軀干部兩個小圓團，俗稱雙珠；第7天胚長1.42cm， 0.57g，尿囊液急劇增加，上喙前端出現(xiàn)小白點形的破殼器（卵齒），口腔鼻孔肌胃形成，胚胎已顯示鳥類特征，胚胎自身有體溫，照蛋時胚在羊水中不容易看清，半個蛋表面布滿血管；第8天胚長1.5cm，胚重1.15g，肋骨肺胃明顯可辨，頸背四肢出現(xiàn)羽毛，乳頭突起，右側(cè)卵巢開始退化，照蛋時胚在羊水中浮游，背面兩邊蛋黃不易晃動，俗稱邊口發(fā)硬；第9天胚 長 2 c m ， 胚 重1.53g，喙開始角質(zhì)化，軟骨開始骨化，眼瞼已達虹膜，解剖時心肝胃腎腸已發(fā)育良好，尿囊?guī)缀醢鼑?/p>

13、個胚胎，照蛋時可見卵黃兩邊易晃動，尿囊血管伸展越過卵黃囊，俗稱竄筋；第10天胚長2.1cm，胚重2.26g，尿囊血管到達蛋的小頭，整個背頸、大腿部都覆蓋有羽毛，乳頭突起、龍骨突形成，照蛋時可見尿囊血管在蛋的小頭合攏，除氣室外，整個蛋布滿血管，俗稱合攏；第11天胚長2.54cm，胚重3.68g，背部出現(xiàn)絨毛，腺胃明顯可辯，冠鋸齒狀，尿囊液達最大量，照蛋時血管加粗，色加深；第12天胚長3.57cm，胚重5.07g，身軀覆蓋絨毛，腎腸開始有功能，開始用喙吞食蛋白第13天胚長4.34cm，胚重7.37g，頭部和身體大部分覆蓋絨毛，脛趾出現(xiàn)角質(zhì)鱗片原基，蛋白通過漿羊膜道迅速進入羊膜腔，眼瞼達瞳孔，照蛋時

14、蛋小頭發(fā)亮部分隨胚齡增加而逐漸減少第14天胚長4.7cm，胚重9.74g，胚胎全身覆蓋絨毛，頭向氣室，胚胎開始改變?yōu)闄M著的位置，逐漸與蛋長橫平行（二）接種途徑（二）接種途徑1.尿囊腔接種尿囊腔接種：該途徑一般用于流感、新城雞瘟病毒和腮腺炎的適應(yīng)和傳代。2.羊膜腔接種羊膜腔接種：這途徑主要用于臨床材料（如患者的鼻洗液及咽漱液）分離病毒。3.卵黃囊接種卵黃囊接種：該接種途徑主要用于抗流感病毒藥物實驗。4.絨毛尿囊膜絨毛尿囊膜殼塊培養(yǎng)法殼塊培養(yǎng)法：該法可用于流感病毒滴定、中和試驗和藥物實驗。1.尿囊腔接種尿囊腔接種尿囊腔接種常用于流感病毒、新城疫尿囊腔接種常用于流感病毒、新城疫病毒和腮腺炎病毒的適應(yīng)

15、和傳代。進病毒和腮腺炎病毒的適應(yīng)和傳代。進入尿囊腔的這些病毒，能夠在尿囊的入尿囊腔的這些病毒，能夠在尿囊的內(nèi)胚層細(xì)胞中大量繁殖，隨后釋放到內(nèi)胚層細(xì)胞中大量繁殖，隨后釋放到尿囊液中。由于這一接種途徑可獲得尿囊液中。由于這一接種途徑可獲得大量的病毒，也常被用于大量制備抗大量的病毒，也常被用于大量制備抗原、疫苗等。原、疫苗等。接種方法：接種方法：選選9 91111日齡雞胚照檢后，日齡雞胚照檢后，標(biāo)出氣室邊界標(biāo)出氣室邊界和胚胎位置。在胚胎面氣室上方靠近邊界和胚胎位置。在胚胎面氣室上方靠近邊界23mm處，避開血管作一標(biāo)記，用碘酒處，避開血管作一標(biāo)記，用碘酒消毒標(biāo)記處的卵殼，在標(biāo)記處鉆一孔，再消毒標(biāo)記處的

16、卵殼，在標(biāo)記處鉆一孔，再次用碘酒消毒鉆孔區(qū)，將注射器針頭經(jīng)孔次用碘酒消毒鉆孔區(qū)，將注射器針頭經(jīng)孔刺入尿囊腔，注入刺入尿囊腔，注入0.10.10.20.2mlml接種物，將接種物，將蠟熔化封孔，蠟熔化封孔，33333535孵育孵育48487272小時。小時。每日照檢，每日照檢，2424小時內(nèi)死亡的應(yīng)棄去。小時內(nèi)死亡的應(yīng)棄去。收獲：收獲： 收獲前先將雞卵置收獲前先將雞卵置4冷凍冷凍618小時，小時，如急于收獲也可如急于收獲也可將雞胚將雞胚置置-20-20、1 1小時左小時左右。冷凍后的雞卵鈍端向上置于卵杯上，右。冷凍后的雞卵鈍端向上置于卵杯上，將氣室上方卵殼用碘酒或?qū)馐疑戏铰褮び玫饩苹?0%70

17、%的酒精消毒的酒精消毒后去除，暴露殼膜，用無菌鑷子小心地將后去除，暴露殼膜，用無菌鑷子小心地將殼膜從絨毛尿囊膜上撕下，不要損傷絨毛殼膜從絨毛尿囊膜上撕下，不要損傷絨毛尿囊膜。用注射器或吸管經(jīng)絨毛尿囊膜刺尿囊膜。用注射器或吸管經(jīng)絨毛尿囊膜刺入尿囊腔，吸出尿囊液，置低溫保存。同入尿囊腔，吸出尿囊液，置低溫保存。同時做無菌培養(yǎng)。時做無菌培養(yǎng)。2.羊膜腔接種羊膜腔接種 羊膜腔接種主要用于從臨床或現(xiàn)場材料羊膜腔接種主要用于從臨床或現(xiàn)場材料（如患者咽漱液等）中分離病毒。接種到（如患者咽漱液等）中分離病毒。接種到羊膜腔中的接種物能夠被胚胎吞咽和進入羊膜腔中的接種物能夠被胚胎吞咽和進入呼吸管，可遍及各種組織和

18、細(xì)胞，使具有呼吸管，可遍及各種組織和細(xì)胞，使具有特定細(xì)胞親嗜性的病毒被充分利用，從而特定細(xì)胞親嗜性的病毒被充分利用，從而提高病毒繁殖的可能性。由于可收獲的羊提高病毒繁殖的可能性。由于可收獲的羊膜組織或羊水較少，為了使病毒適應(yīng)在尿膜組織或羊水較少，為了使病毒適應(yīng)在尿囊內(nèi)胚層生長，從而獲得大量的病毒，可囊內(nèi)胚層生長，從而獲得大量的病毒，可將經(jīng)羊膜腔接種分離到的病毒再經(jīng)尿囊腔將經(jīng)羊膜腔接種分離到的病毒再經(jīng)尿囊腔傳代。傳代。接種方法：接種方法： 選選1012日齡雞胚檢卵后，標(biāo)出氣室邊界和胚胎日齡雞胚檢卵后，標(biāo)出氣室邊界和胚胎位置。用碘酒消毒雞卵鈍端（氣室上方）的蛋殼，在位置。用碘酒消毒雞卵鈍端（氣室上

19、方）的蛋殼，在氣室上方靠近胚胎側(cè)的卵殼上鉆一孔，鉆孔區(qū)再次用氣室上方靠近胚胎側(cè)的卵殼上鉆一孔，鉆孔區(qū)再次用碘酒消毒。用無菌眼科小剪子沿鉆孔周圍剪去少許，碘酒消毒。用無菌眼科小剪子沿鉆孔周圍剪去少許，開一小窗，勿損傷內(nèi)層殼膜，經(jīng)小窗向氣室內(nèi)滴入一開一小窗，勿損傷內(nèi)層殼膜，經(jīng)小窗向氣室內(nèi)滴入一滴無菌液體石蠟。將卵置照卵燈上，可清楚地看到胚滴無菌液體石蠟。將卵置照卵燈上，可清楚地看到胚胎的位置。將注射器瞄準(zhǔn)胚胎的腭下胸前，刺入后注胎的位置。將注射器瞄準(zhǔn)胚胎的腭下胸前，刺入后注入入0.10.2ml接種物。用沾有碘酒通過火焰的小塊膠接種物。用沾有碘酒通過火焰的小塊膠布將窗口封上。接種后的受精卵根據(jù)接種的

20、病毒在布將窗口封上。接種后的受精卵根據(jù)接種的病毒在33、35或或37的條件下孵育的條件下孵育4872小時。小時。收獲：收獲： 收獲前先將雞卵置收獲前先將雞卵置4冷凍冷凍618小時，小時，時間時間不能過長，過長會引起散黃。冷凍后的雞卵鈍不能過長，過長會引起散黃。冷凍后的雞卵鈍端向上置于卵杯上，將氣室上方卵殼用碘酒或端向上置于卵杯上，將氣室上方卵殼用碘酒或75%75%的酒精消毒后去除，暴露殼膜，用無菌鑷子的酒精消毒后去除，暴露殼膜，用無菌鑷子小心地去除殼膜，使其與絨毛尿囊膜分開，不小心地去除殼膜，使其與絨毛尿囊膜分開，不要損傷絨毛尿囊膜。用注射器或吸管經(jīng)絨毛尿要損傷絨毛尿囊膜。用注射器或吸管經(jīng)絨毛

21、尿囊膜刺入尿囊腔，吸出尿囊液。然后，一只手囊膜刺入尿囊腔，吸出尿囊液。然后，一只手持鑷子將羊膜輕輕提起，另一只手持注射器或持鑷子將羊膜輕輕提起，另一只手持注射器或吸管刺入羊膜腔吸取羊水，置低溫保存。同時吸管刺入羊膜腔吸取羊水，置低溫保存。同時做無菌培養(yǎng)。做無菌培養(yǎng)。3.絨毛尿囊膜接種絨毛尿囊膜接種絨毛尿囊膜接種常常用于分離和繁殖在絨毛絨毛尿囊膜接種常常用于分離和繁殖在絨毛尿囊膜上產(chǎn)生斑和痘的病毒，如牛痘、天花、尿囊膜上產(chǎn)生斑和痘的病毒，如牛痘、天花、單純皰疹和鳥痘病毒?？稍诮q毛尿囊膜上滴單純皰疹和鳥痘病毒?？稍诮q毛尿囊膜上滴定這些病毒，因為感染性病毒顆粒的量可以定這些病毒，因為感染性病毒顆粒的

22、量可以通過產(chǎn)生的斑和痘的數(shù)目來計算。還可用于通過產(chǎn)生的斑和痘的數(shù)目來計算。還可用于抗體滴定試驗，因為斑和痘的個數(shù)減少的程抗體滴定試驗，因為斑和痘的個數(shù)減少的程度與抗體濃度有關(guān)。度與抗體濃度有關(guān)。定位：定位：將胎盤部分將胎盤部分及自然氣室部分用鉛及自然氣室部分用鉛筆畫出，在胎盤與蛋筆畫出，在胎盤與蛋白交界處（無血管區(qū)）白交界處（無血管區(qū)）畫一直徑約畫一直徑約1cm的等的等邊三角形。邊三角形。卵窗 氣室雞胚卵黃囊尿囊腔羊膜腔絨毛尿囊膜卵白卵膜取卵殼：取卵殼：消毒后取下所畫三角形區(qū)域的消毒后取下所畫三角形區(qū)域的卵殼，注意卵膜不要碰破，于卵膜中央刺卵殼，注意卵膜不要碰破，于卵膜中央刺一小口（不要傷及絨

23、毛尿囊膜），一小口（不要傷及絨毛尿囊膜），造人工氣室造人工氣室：在自然氣室部分用大注射：在自然氣室部分用大注射器針頭鉆一孔，用橡皮頭自氣室端小孔將器針頭鉆一孔，用橡皮頭自氣室端小孔將氣室中空氣吸出，使絨毛尿囊膜下陷形成氣室中空氣吸出，使絨毛尿囊膜下陷形成一一“人工氣室人工氣室”n接種：接種：去除卵膜，于絨毛尿囊膜上去除卵膜，于絨毛尿囊膜上滴上病毒滴上病毒0.10.2ml。n封口：封口：用膠布封口，膠布事先用碘用膠布封口，膠布事先用碘酒消毒，并通過火焰燒去余碘。酒消毒，并通過火焰燒去余碘。n培養(yǎng)：培養(yǎng)：放入溫箱培育放入溫箱培育4天，然后收天，然后收獲病毒。獲病毒。收獲：收獲：收獲前檢卵，看人工氣

24、室是否仍然存在，收獲前檢卵，看人工氣室是否仍然存在，如果不存在，輕輕地吸氣室上的孔。用如果不存在，輕輕地吸氣室上的孔。用碘酒消毒人工氣室上的卵殼，去掉殼和碘酒消毒人工氣室上的卵殼，去掉殼和殼膜至人工氣室的邊緣，盡量最大范圍殼膜至人工氣室的邊緣，盡量最大范圍地暴露地暴露絨毛尿囊膜，用無菌剪子沿人工絨毛尿囊膜，用無菌剪子沿人工氣室的邊緣將接種病毒的絨毛尿囊膜剪氣室的邊緣將接種病毒的絨毛尿囊膜剪下，低溫保存。同時做無菌培養(yǎng)。下，低溫保存。同時做無菌培養(yǎng)。4.卵黃囊接種卵黃囊接種 卵黃囊接種常用于分離和繁殖卵黃囊接種常用于分離和繁殖立克次體，也可用于分離和傳代衣立克次體，也可用于分離和傳代衣原體。這些

25、大的病原微生物易于在原體。這些大的病原微生物易于在沿卵黃排列的內(nèi)胚層細(xì)胞中生長。沿卵黃排列的內(nèi)胚層細(xì)胞中生長。 接種方法：接種方法： 選用選用5 56 6日齡雞胚，因為卵黃囊在這個階日齡雞胚，因為卵黃囊在這個階段比較大，易于接種，并為病毒的繁殖提供段比較大，易于接種，并為病毒的繁殖提供了一個比較大的表面。檢卵后，用碘酒消毒了一個比較大的表面。檢卵后，用碘酒消毒氣室端卵殼，在氣室中心的卵殼上鉆一孔，氣室端卵殼，在氣室中心的卵殼上鉆一孔，再次用碘酒消毒鉆孔處，將注射器的針頭經(jīng)再次用碘酒消毒鉆孔處，將注射器的針頭經(jīng)鉆孔沿卵的縱軸刺入鉆孔沿卵的縱軸刺入3 3cmcm左右，進入卵黃囊中，左右，進入卵黃囊

26、中，通常注入通常注入0.50.51 1mlml接種物。用蠟熔化封口，接種物。用蠟熔化封口，35353737孵育孵育3 38 8天，視接種的病毒或立天，視接種的病毒或立克次體而定?？舜误w而定。圖5-5 卵黃囊接種示意圖收獲：收獲： 先將雞胚冷凍，去除氣室上方卵殼，先將雞胚冷凍，去除氣室上方卵殼，用無菌鑷子揭去殼膜，撕開用無菌鑷子揭去殼膜，撕開絨毛尿囊膜絨毛尿囊膜后，將雞胚內(nèi)容物倒入無菌培養(yǎng)皿中，后，將雞胚內(nèi)容物倒入無菌培養(yǎng)皿中，注意要避免內(nèi)容物沿卵殼流下而發(fā)生污注意要避免內(nèi)容物沿卵殼流下而發(fā)生污染。將雞胚從卵黃囊上剪下，如收獲雞染。將雞胚從卵黃囊上剪下，如收獲雞胚，則去雙眼、爪和嘴，置無菌瓶中低胚，則去雙眼、爪和嘴，置無菌瓶中低溫保存。倒出卵黃囊中的卵黃，用生理溫保存。倒出卵黃囊中的卵黃，用生理鹽水將卵黃囊洗凈，置無菌培養(yǎng)皿或燒鹽水將卵黃囊洗凈，置無菌培養(yǎng)皿或燒瓶中低溫保存。并取一塊做無菌試驗。瓶中低溫保存。并取一塊做無菌試驗。注意事項 雞胚為一活的有機體，因此要嚴(yán)格無菌操作，同時動作要仔細(xì)，以免造成物理死亡。接種后24小時內(nèi)死亡應(yīng)不計結(jié)果。收獲物的檢測收獲物的檢測（一）無菌試驗（一）無菌試驗雞胚培養(yǎng)所收獲的材料應(yīng)當(dāng)未受細(xì)菌污染。檢查雞胚培養(yǎng)所收獲的材料應(yīng)當(dāng)未受細(xì)菌污染。檢查收獲物是否