大腸菌群測(cè)定檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)

1、XXXXXXXXXXXXXXX 有限公司文件編號(hào)3-QC-TS-006制定單位質(zhì)檢部 頁(yè) 碼 1/7文件名稱大腸菌群測(cè)定方法及標(biāo)準(zhǔn)版本 A1 .范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中大腸菌群的測(cè)定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品中大腸菌群的測(cè)定。2 .引用標(biāo)準(zhǔn)下列標(biāo)準(zhǔn)所包含的條例，通過(guò)在本標(biāo)準(zhǔn)中引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條文。本 標(biāo)準(zhǔn)出版時(shí)，所示版本均為有效。所有標(biāo)準(zhǔn)都會(huì)被修訂，使用本標(biāo)準(zhǔn)的各方 應(yīng)探討使用下列標(biāo)準(zhǔn)最新版本的可能性。GB/T4798.3-2003 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群測(cè)定方法及標(biāo)準(zhǔn)GB/T4789.28-2003食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)染色法、培養(yǎng)基和試劑3 .術(shù)語(yǔ)和定義大腸菌群系指一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣

2、、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰 性無(wú)芽胞桿菌。該菌主要來(lái)源于人畜糞便，故以此作為糞便污染指數(shù)來(lái)評(píng)價(jià) 食品的衛(wèi)生質(zhì)量，推斷食品中有否污染腸道致病菌的可能。食品中大腸菌群 系以100mL（g）檢樣內(nèi)大腸菌群最可能數(shù)（MPN/示。4 .設(shè)備和材料4.1 恒溫培養(yǎng)箱：36 c 士 1C4.2 冰箱：0c-4 C4.3 恒溫水浴鍋：46 c 士 1C4.4 顯微鏡4.5 均質(zhì)器或乳缽4.6 滅菌培養(yǎng)皿：直徑為90mm4.7 滅菌試管：16X 1604.8 滅菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）4.9 滅菌錐形瓶或三角瓶：500mL4.10 滅菌玻璃珠：直徑約為 5mm4.11

3、架盤(pán)藥物天平：0g100g 精確至0.1g4.12 滅菌剪子、鐐子等。5 .培養(yǎng)基和試劑5.1 乳糖膽鹽發(fā)酵管：見(jiàn)附錄一中15.2 伊紅美藍(lán)瓊脂平板：見(jiàn)附錄一中25.3 乳糖發(fā)酵管：見(jiàn)附錄一中35.4 革蘭氏染色液：見(jiàn)附錄一中 4xxxxXt限公司文件編號(hào)3-QC-TS-006制定單位質(zhì)檢部頁(yè)碼2/7文件名稱大腸菌群測(cè)定方法及標(biāo)準(zhǔn)版本A5.5 0.85%滅菌生理鹽水6 .檢驗(yàn)程序大腸菌群檢驗(yàn)程序如下:7 .操作步驟:7.1 檢樣稀釋1.1 .1以無(wú)菌操作，將檢樣25g（或25mL）放于含有225 mL滅菌生理鹽 水或其它稀釋液的滅菌玻璃瓶?jī)?nèi)（瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠）或 滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分振搖

4、或研磨做成1: 10的均勻稀釋液。固體檢 樣最好置均質(zhì)器中，以800010000 r/min的速度處理1min,XXXXXXXX 有限公司文件編號(hào)3-QC-TS-006制定單位質(zhì)檢部頁(yè) 碼3/7文件名稱大腸菌群測(cè)定方法及標(biāo)準(zhǔn)版本A作成1: 10的均勻稀釋液。7.12 ,用1mL滅菌吸管吸取1: 10稀釋液1mL注入含有9mL滅菌生理 鹽水或其它稀釋液的試管內(nèi)（注意吸管尖端不要觸及管內(nèi)稀釋 液），振搖試管混勻，做成1: 100的稀釋液。7.13 3.另取1mL滅菌吸管，按上條操作依次做10倍遞增稀釋液，每 遞增稀釋一次，換用1支1 mL滅菌吸管。7.14 4.根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)z樣污染情況

5、的估計(jì)，選擇三個(gè)稀 釋度，每個(gè)稀釋度接種3管。7.2 乳糖發(fā)酵試驗(yàn)將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)（具體操作見(jiàn)附錄二種3）,接種 量在1mL以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管，1mL及1mL以下者，用單 料乳糖膽鹽發(fā)酵管。每一稀釋度接種三管，置 36 C ±1C溫箱內(nèi)，培 養(yǎng)24h±2h,如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管均不產(chǎn)氣，則可報(bào)告為大腸菌群 陰性，如有產(chǎn)氣者，則按下例程序進(jìn)行。7.3 分離培養(yǎng)將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)種在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上（具體操作見(jiàn)附錄二 中1）,置36c ±1C溫箱內(nèi)，培養(yǎng)18 h24h,然后取出，觀察菌落 形態(tài)，并作革蘭氏染色和證實(shí)試驗(yàn)。7.4 證實(shí)試驗(yàn)在

6、上述平板上，挑取可疑大腸菌群菌落 1-2個(gè)進(jìn)行革蘭氏染色，同時(shí) 接種乳糖發(fā)酵管（具體操作見(jiàn)附錄3中3.）,置36c ±1C溫箱內(nèi)培養(yǎng) 24h±2h,觀察產(chǎn)氣情況。凡乳糖產(chǎn)氣、革蘭氏染色為陰性的無(wú)芽胞 桿菌，即可報(bào)告為大腸菌群陽(yáng)性。7.5 報(bào)告根據(jù)證實(shí)為大腸菌群陽(yáng)性的管數(shù)，查 MPN僉索表，報(bào)告每100mL（g）大 腸菌群的MPN直（見(jiàn)表一）。xxxxxxX限公司文件編號(hào)3-QC-TS-006制定單位質(zhì)檢部頁(yè)碼4/7文件名稱大腸菌群測(cè)定方法及標(biāo)準(zhǔn)版本A大腸困群最可能數(shù)（MPN）僉索表（表一）陽(yáng)性管數(shù)MPN 100mL(g)95 %可信限1mL(g)x3).1mL(g) X30

7、.01mL(g) X3下限上限000000000123<30306090<590000011110123306090120<51300000222201236090120160000033330123901301601901111000001234070110150<51020021011111111012370110150190103023036011112222012311015020024030360111133330123160200240290222200000123901402002601030360370XXXXXXXXX 有限公司文件編號(hào)3-QC-TS-

8、006制定單位質(zhì)檢部頁(yè)碼5/7文件名稱大腸菌群測(cè)定方法及標(biāo)準(zhǔn)版本A大腸菌群最可能數(shù)(MPN)僉索表陽(yáng)性管數(shù)MPN 100mL(g)95 %可信限1mL(g)X3 0.1mL(g) X30.01mL(g) X3卜限上限210150304402112007089021227021334022021040470221280100150022235022342023029023136023244023353030023040120030139070130030264015038003039503104307021003117501402300312120030038003131600320930150

9、3800321150030044003222100350470032329003302400360130003314600710240003321100015004800033324000注：1.本表采用三個(gè)稀釋度1mL(g)、0.1mL(g)和0.01mL(g)，每稀釋度三管。2.表內(nèi)所例檢量如改用10mL(g)、1mL(g)和0.1mL(g)時(shí)，表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低10倍， 如改用0.1mL(g)、0.01mL(g)和0.001mL(g)時(shí)，則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)增加 10倍。其余 可類推。XXXXXXXXXXXXXXX 有限公司文件編號(hào)3-QC-TS-006制定單位質(zhì)檢部頁(yè)碼6/7文件名稱大腸菌

10、群測(cè)定方法及標(biāo)準(zhǔn)版本A附錄一：大腸菌群測(cè)定方法及標(biāo)準(zhǔn)中所用培養(yǎng)基的配置和染色法1,乳糖膽鹽發(fā)酵管1.1 本品為淡黃色干燥粉末，易吸潮，加水和勻溶解后即可分裝（必要時(shí)加熱溶解）。1.2 雙料發(fā)酵時(shí)稱取乳糖膽鹽7.0g ,單料發(fā)酵時(shí)稱取乳糖膽鹽3.5g。均加入 100mL蒸儲(chǔ)水中，溶解后分裝于試管中，并放入小導(dǎo)管，115c高壓滅菌15分鐘備用。PH 7.42,伊紅美藍(lán)瓊脂平板2.1 本品為微紅色干燥粉末，易吸潮，加水煮沸后呈半透明狀液體，冷至 45c開(kāi)始凝固。2.2 制法稱取伊紅美藍(lán)瓊脂3.75g加蒸儲(chǔ)水100mL混勻，121c高壓滅菌15分 鐘。3,乳糖發(fā)酵管3.1 本品為淡黃色干燥粉末，易吸潮

11、，加水混勻溶解后即可分裝（必要時(shí)加熱溶解）。3.2 稱取乳糖3.0g加入100mLi儲(chǔ)水中，溶解后分裝于試管中，并放入小倒 管，115c高壓滅菌15分鐘備用。pH 7.44.染色法4.4.1 將涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染色液，染上 1min,水洗。4.4.2 滴加革蘭氏碘液，作用1min,水洗。4.4.3 滴加95 %乙醇脫色，約30s;或?qū)⒁掖嫉螡M整個(gè)涂片，立即傾去，再 用乙醇滴滿整個(gè)涂片，脫色10s。4.4.4 水洗，滴加復(fù)染液，復(fù)染1min。水洗，待干，鏡檢。革蘭氏陽(yáng)性菌呈紫色。革蘭氏陰性菌呈紅色。注：亦可用1: 10稀釋石碳酸復(fù)紅染色液作復(fù)染液，復(fù)染時(shí)間僅需4.4.5 結(jié)果10s。

12、XXXXXXXXXXJO公司文件編號(hào)3-QC-TS-006制定單位質(zhì)檢部頁(yè) 碼7/7文件名稱大腸菌群測(cè)定方法及標(biāo)準(zhǔn)版本A附錄一：接種的操作方法1 .平板劃線分離法1.1 將無(wú)菌培養(yǎng)基加熱融化后，倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中（每皿約15mL）,迅速搖勻， 靜置凝固后，即成平板備用。1.2 用接種環(huán)沾取含菌樣品，接種環(huán)在試管壁輕輕研磨，避免菌體濃度過(guò)大， 按下圖方式劃線，劃線時(shí)環(huán)要放平勿用力，否則會(huì)使培養(yǎng)基表面劃破。覆（1、2、3指劃線的順序與方向）1.3 劃線完畢，倒置于36士 1C溫箱中培養(yǎng)。待長(zhǎng)出菌落，挑取單菌落于斜面 培4 L基中。2 .液體接種法2.1 用無(wú)菌吸管將待測(cè)樣品移到試管培養(yǎng)基中后，擰好瓶塞，將試管在手掌 中輕輕敲打，使待測(cè)樣品充分分散。3 .斜面接種3.1 點(diǎn)燃酒精燈，再用75 %酒精棉球擦手。3.2 在左手的中指、無(wú)名指間分別夾住待轉(zhuǎn)接試管，接種時(shí)要注意略使試管 口向上，以免使培養(yǎng)基流出。在酒精燈火焰無(wú)菌區(qū)域（以5 cm為半徑的圓 內(nèi)）書(shū)開(kāi)試管塞。3.3 右手拿接種針或環(huán)，在