林蛙抗菌肽基因原核表達載體的構(gòu)建及表達條件的優(yōu)化

1、項目編號：KFJJ-大學(xué)生開放性實驗基金項目申 請 書項目名稱：林蛙抗菌肽基因原核表達載體的構(gòu)建及表達條件的優(yōu)化申 請 人：汪 林所在院系：生命科學(xué)學(xué)院指導(dǎo)教師：李 治聯(lián)系電話：88038248申報時間：2008年6月填 表 須 知 一、陜西師范大學(xué)大學(xué)生開放性實驗基金項目申請表要按順序逐項填寫，內(nèi)容要實事求是，表達要明確、嚴謹?？杖表椧睢盁o”。要求一律用A4紙打印，于左側(cè)裝訂成冊。 二、申請參加陜西師范大學(xué)大學(xué)生開放性實驗基金項目團隊人數(shù)不得超過5人（1人為項目負責(zé)人，項目參與者1-4人）。三、陜西師范大學(xué)大學(xué)生開放性實驗基金項目申請表由申報學(xué)生所在學(xué)院初審，簽署意見后，一式三份（均為原件

2、），報送實驗室建設(shè)與管理處。四、如填表有不明事宜，請與實驗室建設(shè)與管理處聯(lián)系和咨詢。（聯(lián)系電話：85310378）一、基本情況項目名稱林蛙抗菌肽基因原核表達載體的構(gòu)建及表達條件的優(yōu)化項目來源自擬課題 綜合設(shè)計 科學(xué)研究 計算機應(yīng)用 人文素質(zhì)起止時間2008年6月至2009年6月申請人姓名學(xué)院、專業(yè)、年級學(xué)號項目中的分工聯(lián)系電話簽 名負責(zé)人汪林生科院05級生物基地班40508047參與所有實驗內(nèi)目參加人岑文生科院06級生物技術(shù)班40608217參與所有實驗內(nèi)川生科院06級生物技術(shù)班40608216參與所有實驗內(nèi)小玉生科

3、院06級生物基地班40608180參與所有實驗內(nèi)導(dǎo)教師姓名學(xué)院職稱研究方向聯(lián)系電話簽 名李治生科院副教授抗菌肽功能及應(yīng)用88038248項目所依托的實驗室分子微生物學(xué)實驗室摘要（不超過300字）：抗菌肽具有廣譜抗菌、抗病毒、抗癌能力，是理想的抗生素替代品。蛙類的皮膚分泌液含有大量的抗菌肽類物質(zhì)，目前已經(jīng)分離的蛙類抗菌肽超過數(shù)百種。然而直接從蛙類提取純化抗菌肽存在多方面問題。如，從蛙類皮膚分類純化抗菌肽工藝繁瑣費時、產(chǎn)量??；從蛙類皮膚提取抗菌肽必然需要處死蛙，這樣對物種保護、環(huán)境保護等也會造成不好的影響。因此，本項目擬在前期實驗基礎(chǔ)上，以基因工程技術(shù)構(gòu)建含有林蛙抗菌肽基

4、因的原核表達載體，于體外表達抗菌肽；并優(yōu)化原核系統(tǒng)表達抗菌肽的條件，期望可以通過體外表達的方式大量合成抗菌肽，為后期抗菌肽的開發(fā)利用提供技術(shù)支持。二、申請書正文1、立項依據(jù)（研究項目的意義、國內(nèi)外研究現(xiàn)狀、和發(fā)展動態(tài)）研究意義：抗菌肽是由10-50個氨基酸殘基組成，常帶正電荷。其分子量小，理化性質(zhì)穩(wěn)定、水溶性好、熱穩(wěn)定性好，同時具有廣譜抗菌、抗病毒、抗癌能力，并具有活性濃度低、無致畸變作用、無蓄積毒性、不易引起病原產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點，而且作為生物體的天然綠色產(chǎn)物，是理想的抗生素替代品。兩棲類動物皮膚長期裸露，在自然選擇的過程中，為抵御有害環(huán)境因子侵襲逐漸形成了一系列保護機制，即它們的皮膚分泌液含

5、有大量的殺菌和防御天敵的抗菌肽類物質(zhì)；目前已經(jīng)分離的兩棲類抗菌肽超過數(shù)百種。然而，直接以蛙類作為提取純化抗菌肽的來源，存在多方面問題。如，從蛙類皮膚分類純化抗菌肽存在工藝繁瑣費時、產(chǎn)量小的問題；從蛙類皮膚提取抗菌肽必然需要處死蛙，這樣對物種保護、環(huán)境保護等也會造成不好的影響。因此，本項目擬在前期實驗基礎(chǔ)上，以基因工程技術(shù)構(gòu)建含有林蛙抗菌肽基因的原核表達載體，于體外表達抗菌肽；并優(yōu)化原核系統(tǒng)表達抗菌肽的條件，期望可以通過體外表達的方式大量合成抗菌肽，為后期抗菌肽的開發(fā)利用提供技術(shù)支持。研究現(xiàn)狀及發(fā)展動態(tài)：1970年，Csordas等在研究歐洲鈴蟾皮膚分泌物中的向性細胞性物質(zhì)時發(fā)現(xiàn)了第一個具有溶血

6、作用的蛙皮抗菌肽Bombinin；1987年，Zasloff從非洲爪蟾的皮膚分泌物中提取得到magainin蛙皮抗菌肽。迄今為止，國內(nèi)外對蛙類分泌物中生物活性肽的研究有四十多年歷史，涉及500多種蛙類。所分離的抗菌肽按照其結(jié)構(gòu)特征可以分為多個家族，主要有Magainin、Bombsnin、Bombinin-like、Brevinin、Eseulentin、Ranatuerin、Temporin、Ranalexin、Aurein、Caerin和Citropin家族等。目前對兩棲類抗菌肽的功能研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽不僅具有抗菌（包括細菌和真菌）活性，很多抗菌肽還有抗腫瘤活性、抗病毒活性、抗原蟲活性、抗精

7、子作用及溶血作用等。目前，隨著對蛙皮多肽分子結(jié)構(gòu)與生物功能研究的不斷深入，已將其應(yīng)用到醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)等多個領(lǐng)域。國內(nèi)許多學(xué)者都對其所在地區(qū)的特有兩棲類種屬進行了大量的研究，其中比較突出的是對云南臭蛙屬以及長白山林蛙的研究。目前尚未有研究者對我省秦嶺山區(qū)分別的中國林蛙進行抗菌肽方面的研究工作。分子微生物學(xué)實驗室在前期的工作中，從秦嶺林蛙皮膚中分離、克隆了數(shù)個抗菌肽基因，經(jīng)過分析比較，均為未報道的新基因。本實驗在前期基礎(chǔ)上，擬研究新抗菌肽基因的表達特征。2、項目的主要內(nèi)容和創(chuàng)新點、擬解決的關(guān)鍵問題主要內(nèi)容：以基因工程技術(shù)構(gòu)建含有林蛙抗菌肽基因的原核表達載體，于體外表達抗菌肽；并優(yōu)化原核系統(tǒng)表達抗

8、菌肽的條件，期望可以通過體外表達的方式大量合成抗菌肽，為后期抗菌肽的開發(fā)利用提供技術(shù)支持。創(chuàng)新點：本實驗擬表達的林蛙抗菌肽基因為分子微生物實驗室獲得的一個新基因，從未有其他研究報道。擬解決問題：通過實驗研究優(yōu)化抗菌肽體外表達的條件，為后期抗菌肽的開發(fā)利用積累實驗數(shù)據(jù)，并提供技術(shù)支持。3、研究方案（技術(shù)路線）及可行性分析研究方案：第一部分：原核表達載體的構(gòu)建1) 引物設(shè)計：根據(jù)已克隆的林蛙抗菌肽基因(lw-3)設(shè)計引物2) 原核表達載體制備：提取質(zhì)粒(pGEX-6p-1)，進行酶切得到載體3) 目的基因的獲得：提取含有l(wèi)w-3基因的克隆載體質(zhì)粒，以其為模板，用1）中設(shè)計好的引物進行PCR擴增，酶

9、切獲得插入片段4) 連接和轉(zhuǎn)化：將純化回收插入片段和載體，在T4噬菌體連接酶的作用下進行連接反應(yīng)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞HB1015) 陽性克隆的篩選：將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布至含抗生素的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，進行抗性篩選；再以菌落PCR和質(zhì)粒雙酶切兩種方法對克隆進行的進一步鑒定6) 測序：對陽性克隆進行序列測定第二部分：原核表達載體的誘導(dǎo)表達1） 構(gòu)建表達菌株：將確定的原核表達載體pGEX6p1-lw3轉(zhuǎn)入表達菌株BL21中2） 誘導(dǎo)表達：將表達菌株接種培養(yǎng)至OD6000.6時，用IPTG誘導(dǎo)lw-3基因表達；表達4hr后收集表達產(chǎn)物3） 表達產(chǎn)物檢測：將表達產(chǎn)物制備為蛋白質(zhì)電泳樣品，進行SDS-PAG

10、E電泳，檢測表達結(jié)果4） 表達條件優(yōu)化：分別優(yōu)化接種量、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度、IPTG濃度等因素，獲得最佳表達條件可行性分析：本實驗相關(guān)的微生物學(xué)、分子生物學(xué)及生物化學(xué)等相關(guān)學(xué)科的理論知識及技術(shù)方法我們都已經(jīng)學(xué)習(xí)了。本項目所依托的分子微生物學(xué)實驗室也能夠提供研究所需的材料、試劑及相關(guān)儀器設(shè)備。相信在李治老師的指導(dǎo)下，我們可以完成相關(guān)的研究內(nèi)容。4、研究計劃2008年6月10月： 原核表達載體的構(gòu)建2008年10月： DNA測序 (送交上海生工公司完成)2008年11月2009年1月：原核表達載體的誘導(dǎo)表達及表達效果檢測2009年2月-4月： 表達條件的優(yōu)化2009年5月-6月： 整理實驗結(jié)果，完成項目結(jié)題報告；論文寫作及投稿5、成果形式及預(yù)期結(jié)果獲得一個含有新抗菌肽基因的基因工程表達菌株發(fā)表論文1篇經(jīng)費預(yù)算支出類別預(yù)算金額（元）主要用途實驗耗材800實