發(fā)酵工程試驗(yàn)

1、精心整理實(shí)驗(yàn)一酸奶的制作與乳酸菌的活菌計(jì)數(shù)（5學(xué)時(shí)）實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1、學(xué)習(xí)并掌握酸奶制作的基本原理與方法。2、了解市售酸奶的生產(chǎn)工藝。3、掌握乳酸菌活菌計(jì)數(shù)方法與操作。 實(shí)驗(yàn)原理：乳酸菌在乳中生長繁殖，發(fā)酵分解乳糖產(chǎn)生乳酸等有機(jī)酸，導(dǎo)致乳的pH值下降，使乳酪蛋白在其等電點(diǎn)附近發(fā)生凝集。乳酸菌屬于兼性厭氧微生物，在無氧條件下生長繁殖較好，實(shí)驗(yàn)室條件下利用混菌培養(yǎng)的方法，盡可能讓乳酸菌在無氧條件下 生長，每個(gè)單菌落代表一個(gè)微生物細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：（一）酸奶制作1、 10%脫脂奶粉溶解于熱水（80 C左右）中，充分?jǐn)嚢杈鶆颍涑烧{(diào)制乳；2、 添加蔗糖：為了緩和酸奶的酸味，改善酸奶口味，在調(diào)制乳中加人4-8

2、%的蔗糖。3、 滅菌：方法有兩種：將乳加熱至90 C，保溫5min ;4、 接種：往冷卻到 43-45 C滅過菌的乳中加入乳酸菌，接種量為2%-5% o5、分裝：酸奶受到振動(dòng)，乳凝狀態(tài)易被破壞，因此，不能在發(fā)酵罐容器中先發(fā)酵然后再進(jìn)行分裝，須是將含有乳酸菌的牛乳 培養(yǎng)基先分裝到小容器中，加蓋后送入恒溫室培養(yǎng)，在小容器中發(fā)酵制成酸奶。'6、發(fā)酵：發(fā)酵的溫度保持在40-43 C, 般發(fā)酵時(shí)間為 3-6ho發(fā)酵終點(diǎn)的確定有兩種方法：1） 檢測發(fā)酵奶的酸度，達(dá)到65-70T °2）傾斜觀察，瓶內(nèi)酸奶流動(dòng)性差，而且瓶中部有細(xì)微顆粒出現(xiàn)。10C以下，一般2h,使酸奶中的乳酸菌停止生長，防

3、止酸7、冷卻：發(fā)酵結(jié)束，將酸奶從發(fā)酵室取出，用冷風(fēng)迅速將其冷印到 奶酸度過高而影響口感。9、1)2)冷藏和后熟：經(jīng)冷卻處理的酸奶，貯藏在2-5 C的冷藏室中保存。感官指標(biāo)色澤：色澤均勻一致，呈乳白色，或稍帶微黃色。組織狀態(tài)：凝塊稠密結(jié)實(shí)均勻細(xì)膩，無氣泡，允許少量乳清析出。 氣味：具有清香純凈的乳酸味，無酒精發(fā)酵味，無霉味和其他外來不良?xì)馕丁?）（二）乳酸菌活菌檢測、檢測培養(yǎng)基：蛋白胨 15g，牛肉膏5g，葡萄糖20g，氯化鈉5g，碳酸鈣10g，瓊脂粉20g，水1000ml ，115121 C滅 菌20min，滅菌后放置水浴 52 C保溫備用。稀釋：取10克樣品放入添加90ml無菌水的帶4-6顆

4、玻璃珠的250ml三角瓶中，搖床180rpm 震蕩30min，即為10 一1 樣品溶液；再從中取1ml至添加9.0ml無菌生理鹽水三角瓶中，稀釋至 102，以此類推稀釋至108,即稀釋了 1億倍； 倒培養(yǎng)平板，從上述已稀釋了1億倍的乳酸菌懸液中取 1ml，在無菌操作臺(tái)上注入 9.0cm 培養(yǎng)皿中，再將已經(jīng)滅了菌的保持在52 C水浴鍋中的呈溶解狀態(tài)的培養(yǎng)基，倒入15毫升左右于培養(yǎng)皿中，全部浸到培養(yǎng)皿，養(yǎng)基后，馬上用手轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，轉(zhuǎn)動(dòng)幾下，讓其混合均勻），然后等其凝固再移入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 超凈臺(tái)無菌操作，以免雜菌污染。每次稀釋均要換滅好菌的移液管。培養(yǎng)條件：37 C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng) 4872h。、與

5、菌懸液充分混合均勻（倒入培 注意最后一步倒平皿必須在頁腳內(nèi)容如果有200個(gè)透明圈，則是200億/、培養(yǎng)完畢后，取出進(jìn)行計(jì)數(shù)，因?yàn)槭窍♂屃?億倍，所以一個(gè)透明圈菌落代表 1億/克,克。實(shí)驗(yàn)器材及試劑：菌種：市售酸奶試劑：白糖奶粉培養(yǎng)基各成分精心整理器材：培養(yǎng)箱、電爐、鋁鍋 5L,培養(yǎng)皿，酸奶發(fā)酵瓶（自帶）實(shí)驗(yàn)結(jié)果：詳細(xì)描述自己制作的酸奶結(jié)果：答：制作后酸奶與市場所售酸奶比較，比市場所售酸奶更稠密，酸奶的香味與酸味明顯，制作成功記錄個(gè)人酸奶中各菌數(shù)測定的平行數(shù)據(jù)，計(jì)算最終平均值。答：最終培養(yǎng)基上未出現(xiàn)乳酸菌菌落，全部為雜菌菌落，因此無法統(tǒng)計(jì)酸奶中的菌含量同時(shí)用圖片記錄實(shí)驗(yàn)過程中各現(xiàn)象與結(jié)果并對(duì)圖進(jìn)

6、行注釋。答：制備乳酸菌時(shí)，瓶子上方留有一部分空間，并未使乳酸菌完全處于無氧環(huán)境中發(fā)酵，但乳酸菌是兼性厭氧菌，因此在存 在少量氧氣的環(huán)境中，乳酸菌也可以生長，酸奶制備成功。但在平板接種時(shí)，由于污染雜菌，乳酸菌并未長出。乳酸菌計(jì)數(shù) 失敗。思考題：乳酸菌的保藏通常為低溫條件，這給運(yùn)輸、保藏帶來很大的成本，請(qǐng)問可采用什么方法使乳酸菌在常溫條件下有很高的存活率?答：在基因水平上對(duì)乳酸菌進(jìn)行基因重組，從而獲得耐高溫乳酸菌。在基因庫里篩選抗高溫的基因并利用基因重組技術(shù)將其重組在乳酸菌基因上，對(duì)乳酸菌的基因進(jìn)行修飾使其表達(dá)，以此來獲得耐高溫菌株。實(shí)驗(yàn)二枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵及活菌數(shù)測定（5學(xué)時(shí)）實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1、學(xué)

7、習(xí)了解固態(tài)發(fā)酵原理；2、以枯草芽抱桿菌為對(duì)象，了解固態(tài)發(fā)酵的控制技術(shù)；3、 掌握枯草芽抱桿菌活菌計(jì)數(shù)方法與操作。'.1 '-實(shí)驗(yàn)原理：作為抗生素的替代品，益生菌和酶制劑等的研究與開發(fā)近幾年成為綠色飼料添加劑的熱點(diǎn)，其中益生菌倍受關(guān)注。作為益生菌的一種，芽抱桿菌制劑在動(dòng)物生產(chǎn)中的研究和應(yīng)用一直都是畜牧業(yè)科研和生產(chǎn)人員關(guān)注的焦點(diǎn)。目前芽抱桿菌多采用液體深層發(fā)酵技術(shù)，再經(jīng)噴霧干燥進(jìn)行生產(chǎn)，對(duì)設(shè)備要求高，生產(chǎn)工藝復(fù)雜；而固體發(fā)酵采用的原料一般是廉價(jià)的農(nóng)副產(chǎn)品（如草粉、麩皮等），采用的設(shè)備也較液體發(fā)酵簡單，生產(chǎn)成本大大低于液體發(fā)酵。所以近年來各生產(chǎn)廠家都在積極探索芽抱桿菌的固體發(fā)酵技術(shù)，

8、以求 簡化生產(chǎn)工藝，提高產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本。I固態(tài)發(fā)酵定義：指沒有或幾乎沒有自由水存在下，在有一定濕度的水不溶性固態(tài)基質(zhì)中，培養(yǎng)一種或多種微生物的生物反應(yīng)過程，是以氣相為連續(xù)相的生物反應(yīng)過程?？莶菅勘U菌屬于好氧微生物，實(shí)驗(yàn)室條件下利用稀釋涂布培養(yǎng)的方法，讓菌在有氧條件下生長，每個(gè)單菌落代表一個(gè)微生物 細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容:1、液體種子培養(yǎng)基配制：葡萄糖 0.2%, NaCl0.5%，酵母膏 0.5%，蛋白胨 1%，pH7.0。2、液體種子培養(yǎng)：每300mL三角瓶裝量50mL液體種子培養(yǎng)基，在115C條件下滅菌30min。降溫后從斜面接一環(huán)菌苔至種子培養(yǎng)基。置37 C控溫?fù)u床培養(yǎng)。轉(zhuǎn)速 200r -

9、 min-1，至芽抱率達(dá)90%以上時(shí)停止，約需24h。3、 固體發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮 60%，稻草粉10%，玉米粉5%，豆粕25%，硫酸鎂0.05%，硫酸銨0.5%，料水比為1:1.1。1:1.1,攪拌均勻，培養(yǎng)基經(jīng)121 C然后置37C培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)，間時(shí)4、三角瓶固體發(fā)酵培養(yǎng)： 每250mL三角瓶裝量20-30g （濕重），固體發(fā)酵培養(yǎng)基原料試劑混合料，加水，料水比為滅菌30min，降溫后接種量為2%（V/M : V 液體菌種體積數(shù)，M 固體發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量），拍打，使其均勻生長。至脫落芽抱率為80%以上時(shí)，停止發(fā)酵，約需 48h。（二）枯草芽抱菌活菌檢測NaCIO.5%，酵母膏0.5%，蛋

10、白胨1%，瓊脂粉2%，pH7.0。115 C滅菌20min，滅菌后放置水浴52 C保溫備用。、稀釋：取10克樣品放入添加再從中取1ml至添加9.0ml、檢測培養(yǎng)基：葡萄糖 0.2%，90ml無菌水的帶玻璃珠的 250ml三角瓶中，搖床180rpm 震蕩30min，即為10 一1樣品溶液;無菌生理鹽水的三角瓶中，稀釋至102，以此類推稀釋至108，即稀釋了 1億倍；精心整理、倒培養(yǎng)平板，將已經(jīng)滅了菌的保持在52 C水浴鍋中的呈溶解狀態(tài)的培養(yǎng)基，倒入15毫升左右于培養(yǎng)皿中，全部浸到培養(yǎng)皿，待培養(yǎng)基凝固；從上述已稀釋了1億倍的菌懸液中取 0.2ml于已凝固的培養(yǎng)基表面，用玻璃刮鏟涂布均勻，靜止10m

11、in，然后再移入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 、培養(yǎng)條件：37 C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng) 2448h ; 、培養(yǎng)完畢后，取出進(jìn)行計(jì)數(shù)。（三）芽抱率測定：采用芽抱革蘭氏染色后顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)器材及試劑：菌種：枯草芽抱桿菌試劑：培養(yǎng)基成分器材：培養(yǎng)箱、滅菌鍋，培養(yǎng)皿 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：詳細(xì)描述枯草芽抱桿菌固態(tài)培養(yǎng)物（外觀、氣味、培養(yǎng)物狀態(tài)等）：答：枯草芽抱桿菌淡黃色，中間色深，表面較平整，無光澤，邊緣不整齊，形成的菌落為圓形。培養(yǎng)基中的枯草芽抱桿菌 有腥臭味，長勢良好，觀察培養(yǎng)基，無明顯染菌現(xiàn)象。2、答:記錄活菌測定中各平行數(shù)據(jù)，計(jì)算最終平均值。數(shù)量稀釋倍數(shù)密度（/g）第一個(gè)平板1125X10795.6 X 10第二個(gè)平板65

12、5X1073.25 X 109第三個(gè)平板225X1071.1 X 109平均值r-3.32 X 1093、同時(shí)用圖片記錄實(shí)驗(yàn)過程中各現(xiàn)象與結(jié)果，并對(duì)圖進(jìn)行注釋。,:菌落成白色，菌落表面有褶皺思考題：在枯草芽抱桿菌固態(tài)生產(chǎn)過程中，為了防止霉菌與酵母的污染，可如何進(jìn)行操作? 答：加入抗真菌抑制劑實(shí)驗(yàn)三、淀粉糖化與酒精發(fā)酵（5學(xué)時(shí)）實(shí)驗(yàn)類型：綜合性實(shí)驗(yàn)?zāi)康?工藝原理及其控制條件掌握酒精發(fā)酵的操作方法1了解酒精發(fā)酵的主要類型、2. 熟悉酒精生產(chǎn)的工藝流程、3. 掌握用酶法從淀粉原料到水解糖的制備原理及方法4. 掌握在實(shí)驗(yàn)室中模擬酒精發(fā)酵的工藝流程實(shí)驗(yàn)原理_玉米粉、大米粉中可供發(fā)酵的物質(zhì)主要是淀粉，而釀

13、酒酵母由于缺乏相應(yīng)的酶，所以不能直接利用淀粉進(jìn)行酒精發(fā)酵，因此必 須對(duì)原料進(jìn)行預(yù)處理，包括蒸煮（液化）、糖化等，蒸煮可使淀粉糊化，并破壞細(xì)胞，形成均一的醪液，能更好的接受糖化酶的作 用，并轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵性糖，以便酵母進(jìn)行酒精發(fā)酵。在無氧條件下酵母菌利用可發(fā)酵性糖轉(zhuǎn)化為酒精和二氧化碳的作用，稱為酒精 發(fā)酵，是生產(chǎn)酒精及各種酒類的基礎(chǔ)，可通過測定發(fā)酵過程中產(chǎn)生CO2的量和最終產(chǎn)物酒精的量得知酵母的發(fā)酵能力。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1、原料的粉碎將玉米、大米用粉碎機(jī)粉碎，玉米淀粉含量為70%，大米淀粉含量為75%。2、蒸煮糊化 稱取一定量的粉碎后淀粉質(zhì)原料，按一定的料水比（100g： 200ml），調(diào)制淀粉乳，90-

14、100C條件下恒溫水浴加熱，淀粉乳受熱后，在一定溫度范圍，淀粉粒開始破壞，晶體結(jié)構(gòu)消失，體積膨大，粘度急劇上升，呈粘稠的糊狀，即成為非結(jié)晶性的淀 粉。3、糖化經(jīng)蒸煮糊化后的醪液，經(jīng)過淀粉酶的糖化作用，將原料中的淀粉轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵性糖，供酵母利用。酶參考用量：淀粉乳 33%，60C，Ph4.5,酶240U/g絕干淀粉，糖化時(shí)間16h。糊化醪液調(diào)整pH4.5，往其中加入一定量的淀粉酶（120U/g ）、糖化酶（120U/g ），60 C恒溫下不斷攪拌，直至粘度下降到一 定程度，淀粉完全糖化精心整理4、發(fā)酵(1)干酵母活化將干酵母按 1:20的比例投放于37C的溫水中復(fù)水20min。目的：恢復(fù)酵母細(xì)胞

15、的正常功能。(2)淀粉醪液糖化后，取400ml上清液于潔凈的大可樂瓶中，加相同體積的水稀釋，加入活化好的酵母種液5ml，混勻，28度培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng) 36h左右。5、二氧化碳生成的檢驗(yàn)(1)觀察三角瓶中的發(fā)酵液有無氣泡溢出；(2)滴入10%氫氧化鈉1ml于發(fā)酵液試管中，觀察，如氣體逐漸消失，則說明有二氧化碳的存在；6、 二氧化碳生產(chǎn)量的測定 (1)接種完，擦干瓶外壁，于天平上稱量，記為W1;(2)實(shí)驗(yàn)結(jié)束，取出瓶輕輕搖動(dòng)，使二氧化碳盡量溢出，在同一天平上稱量，記為W2 ; ( 3)二氧化碳生成量=W1-W27、酒精生成的檢驗(yàn)(1) 打開瓶塞，嗅聞?dòng)袩o酒精氣味；(2) 取發(fā)酵液5ml，力n 10

16、%硫酸2ml;(3) 再加入1%K2Cr2O7溶液10-20滴，如顏色由黃色變?yōu)辄S綠色說明有酒精產(chǎn)生。K2Cr2O7+H2SO4+CH 3CH2OH CH3COOH+K 2SO4+Cr2 (SO4) 310%H2SO4、1%K2Cr2O7、實(shí)驗(yàn)器材及試劑：菌種：活性干酵母試劑：培養(yǎng)基各成分、大米粉、活性干酵母、淀粉酶、糖化酶、大可樂瓶溶液：10%NaOH器材：試管、培養(yǎng)箱、滅菌鍋、三角瓶、水浴鍋、粉碎機(jī)、離心機(jī) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1、詳細(xì)記錄實(shí)驗(yàn)過程中各參數(shù)及數(shù)據(jù)。淀粉淀粉酶CaCl2糖化酶100g10g0.17g2.5g2. 對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷與分析。r答：1二氧化碳生成的檢驗(yàn)培養(yǎng)約 48h后，觀察瓶

17、中混合液，淀粉大部分沉降在瓶底，上清濃度較 稀，靠瓶壁邊緣有一連串微小氣泡2酒精生成的檢驗(yàn)打開瓶塞，聞到有濃重酒精氣味。 取發(fā)酵液5ml,加10%硫酸2ml,加1%KCr2O7稍加熱后現(xiàn)象產(chǎn)生更快，更明顯。請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)與本實(shí)驗(yàn)操作不同的實(shí)驗(yàn)，判斷哪株酵母發(fā)酵;溶液10-20滴，顏色由黃色變?yōu)辄S綠色，思考題：現(xiàn)有3株不同來源的酒精酵母，答：按實(shí)驗(yàn)步驟配制等量的三組醪液，可發(fā)酵性糖，向三組糖化后的淀粉上清中加入等量酒精能力最強(qiáng)？實(shí)驗(yàn)四黑曲霉固體發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶及酶解底物反應(yīng)(5學(xué)時(shí))實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、了解黑曲霉固體發(fā)酵產(chǎn)酶情況2、掌握微生物固體發(fā)酵操作技術(shù)3、了解纖維素酶提取方法及酶活性定性測定方法實(shí)驗(yàn)原理

18、：纖維素酶是降解纖維素的一組酶的總稱，是起協(xié)同作用的多組分酶系，屬于誘導(dǎo)酶，其產(chǎn)生需要纖維素類物質(zhì)的誘導(dǎo)。 實(shí)驗(yàn)中以米曲霉為發(fā)酵菌株，稻草作為產(chǎn)酶誘導(dǎo)物。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1、黑曲霉菌種活化(1)配制PDA培養(yǎng)基：稱取200g馬鈴薯，洗凈去皮切碎，加水1000ml煮沸半個(gè)小時(shí)，紗布過濾，再加20g葡萄糖和20g瓊脂，充分溶解后趁熱紗布過濾，分裝試管，每試管約5-10ml (視試管大小而定)，15磅蒸氣(121 C)滅菌20分鐘左右后取出試精心整理管擺斜面，冷卻后貯存?zhèn)溆?。?）在無菌超凈臺(tái)上接種保藏的黑曲霉于PDA斜面，28 C培養(yǎng)5-7天，斜面上長滿抱子。2、 配制發(fā)酵培養(yǎng)基：15g麩皮+10g稻草粉

19、，0.5%KH2PO4， 0.5%（NH4）2SO4，力H 15ml水（加水量40%60%），拌勻，裝瓶;3、滅菌：121 C滅菌30min，冷卻至室溫。4、黑曲霉抱子懸浮液制備已培養(yǎng)好的黑曲霉抱子斜面一支，加入約10ml無菌水，洗下抱子，制成抱子懸液。30度條件下培養(yǎng)96h，期間每隔12h搖5、接種：用移液管在無菌條件下吸取一定量的懸液，移入滅菌好的固體培養(yǎng)基中，于 動(dòng)三角瓶一次。6、提取粗酶液向瓶中加入無菌水約 50ml，浸泡固體曲30min-1h ;過濾得粗酶液。7、酶活性測定（1）配制1%CMC底物平板：配方：1g羧甲基纖維素鈉，1.8g瓊脂，100ml，瓊脂完全溶解后，加入 0.03

20、g曲利本藍(lán)，倒平板，每皿約 打孔：打孔器經(jīng)酒精燃燒滅菌后，每平板打15ml 。（2）放冷卻。4孑L,并在酒精燈火焰上稍稍加熱打孔處，使孔周圍的培養(yǎng)基微融，然后平頁腳內(nèi)容(3)(4)(5)，同時(shí)需設(shè)對(duì)照。30 C培養(yǎng)箱，放置20小時(shí)左右。實(shí)驗(yàn)器材及試劑：菌種：黑曲霉加樣：往孔內(nèi)加入粗酶液適量（約100ul）培養(yǎng)（反應(yīng)）：將加樣后的平板小心平端放入 觀察結(jié)果：可直接觀察透明圈有無、測定透明圈直徑。試劑:器材:實(shí)驗(yàn)結(jié)果:土豆、稻草、麩皮、硫酸銨、羧甲基纖維素鈉（CMC）培養(yǎng)箱、滅菌鍋、三角瓶、搖床、離心機(jī)、天平、三角瓶1、仔細(xì)觀察固體培養(yǎng)基發(fā)酵前后的狀態(tài)，并描述；答：固體培養(yǎng)基發(fā)酵前：培養(yǎng)基顏色較淺

21、，各成分（麩皮、稻草）新鮮，粘度大成團(tuán)狀固體培養(yǎng)基發(fā)酵后：培養(yǎng)基中產(chǎn)生較多黑色抱子及菌體，培養(yǎng)基營養(yǎng)成分被利用，體積縮小2、仔細(xì)觀察底物平板酶解前后的現(xiàn)象，并測量水解圈大小。現(xiàn)象：紙片周圍出現(xiàn)淺淺的水解圈，打孔培養(yǎng)基未出現(xiàn)水解圈，紙片直徑2.5cm,水解圈3cm,直徑比5:6思考題：纖維素是自然界最豐富的資源，從理論角度分析如何最大限度地通過酶法利用該資源？而現(xiàn)實(shí)存在什么問題？目前對(duì)纖維素降解有哪些研究進(jìn)展？答：要想最大限度的利用纖維素，可從兩個(gè)方面入手。一是通過生產(chǎn)高性能纖維素酶的方法，二是找到蘊(yùn)含能量較高的纖維素。而現(xiàn)實(shí)中存在的問題是高性能纖維素酶的獲取，而可以通過誘變和篩選獲得可產(chǎn)生纖維

22、素酶的新菌株。目前在纖維素的降解方面，微生物的研究較多，降解纖維素的真菌有很多， 如木霉屬、青霉屬、曲霉屬、根霉屬、漆斑霉屬、枝頂抱霉屬、毛殼霉屬和脈抱霉屬等。其中，很多纖維素降解真菌在生長過程 中能產(chǎn)生菌絲，？菌絲具有很強(qiáng)的穿透能力，能穿透植物角質(zhì)層的阻礙，緊緊依附和穿插在纖維物質(zhì)上，？曾大降解酶與纖維物質(zhì)的接觸面積，從而加快降解速率。如木霉屬、青霉屬、漆斑霉屬、毛殼霉屬和脈抱霉屬為絲狀真菌。目前，木霉屬是迄今所知纖維 素酶系最全面和研究較多的一個(gè)屬。實(shí)驗(yàn)五甘露聚糖酶液體發(fā)酵及酶解反應(yīng)（6學(xué)時(shí)）實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1. 了解并掌握液體發(fā)酵產(chǎn)酶操作及酶反應(yīng)條件的控制2. 與固體發(fā)酵產(chǎn)酶進(jìn)行比較分析實(shí)驗(yàn)原

23、理甘露聚糖是植物半纖維素的重要組分，其主鏈?zhǔn)怯蛇拎事短菤埢?,4-性D糖苷鍵連接而成。當(dāng)主鏈的某些殘基被葡萄糖取代，或半乳糖通過1,6- a糖苷鍵與甘露糖殘基相連形成分枝，則稱之為異甘露聚糖，主要有半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖和半乳葡 萄甘露聚糖。甘露聚糖是半纖維素的第二大組分，在自然界中分布廣泛，且多以異甘露聚糖的形式存在，同型甘露聚糖十分少見。精心整理B-甘露聚糖酶以內(nèi)切方式降解甘露聚糖主鏈產(chǎn)生不同聚合度的甘露寡糖和少量甘露糖，是甘露聚糖降解酶中最關(guān)鍵的酶。甘露聚糖酶可廣泛應(yīng)用于食品、造紙、紡織印染等行業(yè)。利用性甘露聚糖酶可以制取有特殊保健作用的甘露寡糖。在紙漿制造業(yè)，可用于代替堿法進(jìn)行

24、脫色、漂白。在紡織印染方面，利用&甘露聚糖酶與其它酶聯(lián)合作用，能有效去除產(chǎn)品上粘附的多余染料，降低能耗和對(duì)環(huán)境的污染等。甘露聚糖酶的工業(yè)化生產(chǎn)將在許多行業(yè)產(chǎn)生很大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。因此，近年來甘露聚糖酶逐 漸成為國內(nèi)外關(guān)注和研究的熱點(diǎn)之一。甘露聚糖酶是一種半纖維素酶，其產(chǎn)生需要一定的誘導(dǎo)物存在。本實(shí)驗(yàn)以枯草芽抱桿菌為菌 株，以魔芋粉為誘導(dǎo)物。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1. 菌種活化（1）配制LB固體培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉10g/L，瓊脂20g/L，待瓊脂充分溶解后趁熱紗布過濾, 分裝試管，每試管約 5-10ml （視試管大小而定），15磅蒸氣（121 C）滅菌20分鐘左右后

25、取出試管擺斜面，冷卻后貯存?zhèn)溆谩?2)在無菌超凈臺(tái)上接種保藏的枯草芽抱桿菌于LB斜面，28 C培養(yǎng)2天。2.3.配制產(chǎn)酶培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉10g/L，魔芋粉30g/L，以10%的體積量分裝于三角瓶中（25ml液體培養(yǎng)基/250ml三角瓶），12仁C滅菌20分鐘; 菌懸液的制備4.已培養(yǎng)好的枯草桿菌斜面一支，加入約10ml無菌水，洗下菌體，制成菌懸液。5. 接種用移液管在無菌條件下吸取一定量的懸液，移入滅菌好的固體培養(yǎng)基中，于37度200rpm條件下培養(yǎng)72h。6.7.粗酶液提?。?000rpm離心收集得到粗酶液酶解底物分析：準(zhǔn)備兩三角瓶，分別加入50ml自來水

26、，46度水浴保溫往兩三角瓶中各加入1g魔芋粉，然后其中一個(gè)加入粗酶液，1ml，另一個(gè)加入1ml蒸餾水（做空白對(duì)照）。以后每隔5-10min8.往兩三角瓶中各加入1g魔芋粉，前后共加 5g9.酶解反應(yīng)30-60min，期間觀察反應(yīng)現(xiàn)象。 實(shí)驗(yàn)器材及試劑：菌種：枯草芽抱桿菌試劑：蛋白胨、酵母粉、氯化鈉、魔芋粉器材：培養(yǎng)箱、滅菌鍋、三角瓶、搖床、離心機(jī)、天平、三角瓶實(shí)驗(yàn)結(jié)果：仔細(xì)觀察液體培養(yǎng)基發(fā)酵前后的狀態(tài)，并描述；答： 發(fā)酵之前的液體培養(yǎng)基的狀態(tài)：在配制產(chǎn)酶培養(yǎng)基時(shí)，魔芋粉難溶解，依舊是固體顆粒。等完全滅完菌后，放正在實(shí) 驗(yàn)臺(tái)上，等冷卻后，狀態(tài)比較像固體培養(yǎng)基，但魔芋粉依舊不溶解，其顆粒均勻地分布

27、于培養(yǎng)基中。 經(jīng)過三天的培養(yǎng)之后，產(chǎn)酶培養(yǎng)基被液化，得到的是含有粗酶液的液體培養(yǎng)基，完全呈黃褐色的液體狀2、仔細(xì)觀察底物水解前后的現(xiàn)象。 答：對(duì)照組：魔芋粉結(jié)成團(tuán)，透明，具有彈性，黏度很大，無法攪拌，實(shí)驗(yàn)難以繼續(xù)。實(shí)驗(yàn)組：魔芋粉已被完全酶解，三角瓶中完全是液體狀的酶解產(chǎn)物，溶液呈透明狀。思考題：以本人液體發(fā)酵產(chǎn)酶為例，請(qǐng)?jiān)敿?xì)介紹甘露聚糖酶定量測定的原理與方法。答：原理：樣品中的甘露聚糖酶對(duì)底物-半乳甘露聚糖進(jìn)行水解，用DNS試劑（3,5-二硝基水楊酸）分光光度法測定水解所產(chǎn)生的還原糖量。置50C水浴中保溫5min。在其中一支試管中加入 200卩L稀釋酶樣，磁力旋轉(zhuǎn)攪拌3.0mLDNS試劑至兩支

28、試管中，攪拌均勻。在另一支試管（空白管）中加入200卩L稀5min，取出置入冷水中冷卻至室溫。于540nm處測量酶樣對(duì)空白的吸光度，在酶方法：別向2支試管中加入1.8mL底物溶液， 均勻，置于50 C水浴中準(zhǔn)確保溫 5min。加入 釋酶樣，同時(shí)將兩支試管放入沸水浴中準(zhǔn)確保溫 活標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取酶活，再乘以酶樣稀釋倍數(shù)。 實(shí)驗(yàn)六從土壤中分離篩選產(chǎn)抗生素放線菌及抗菌譜分析 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、從土壤中分離產(chǎn)抗生素的放線菌。2、抗生素產(chǎn)生菌的抗菌譜測定。精心整理3、掌握微生物的基本操作。實(shí)驗(yàn)原理：放線菌是重要的抗生素產(chǎn)生菌，主要分布在土壤中，其數(shù)量僅次于細(xì)菌，一般在中性偏堿性、有機(jī)質(zhì)豐富、通氣性好的土壤中

29、含量較多。由于土壤中的微生物是各種不同種類微生物的混合體，為了研究某種微生物，就必須把它們從這些混雜的微生物群體中 分離出來，從而獲得某一菌株的純培養(yǎng)。分離放線菌常用稀釋倒平板法。根據(jù)放線菌的營養(yǎng)、酸堿度等條件要求，常選用合成培養(yǎng) 基或有機(jī)氮培養(yǎng)基。如果培養(yǎng)基成分改變，或土壤預(yù)先處理（120 C熱處理1h），或加入某種抑制劑（如加數(shù)滴 10%酚等），都可以使細(xì)菌（本實(shí)驗(yàn)加入重鉻酸鉀 150 mg/ L），霉菌出現(xiàn)的數(shù)量大大減少，從而淘汰了其它雜菌。再通過稀釋法，使放線菌在固體 培養(yǎng)基上形成單獨(dú)菌落，并可得到純菌株。放線菌可以產(chǎn)生抗生素，抑制其他菌種的生長，挑取純菌落進(jìn)行抗菌譜分析，指示菌為 大

30、腸桿菌（G-）和枯草芽抱桿菌（G+ ）。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1、高氏一號(hào)培養(yǎng)基的制備可溶性淀粉 20g，硝酸鉀 1g,氯化鈉 0.5g，K2HPO4?3H2O0.5g，MgSO4?7H2O0.5g，F(xiàn)eS04?7H200.01g，瓊脂 20g，水 1000ml，1000ml。PH7.4。配制時(shí)，先用冷水，將淀粉調(diào)成糊狀，倒入煮沸的水中，在火上加熱，邊攪拌邊加入其他成分，溶化后，補(bǔ)足水分至112 C滅菌20分鐘（實(shí)驗(yàn)中所用無菌器具均在此時(shí)滅菌）。2、土壤取樣及其懸液梯度稀釋選定取樣點(diǎn)（最好是有機(jī)質(zhì)含量高的菜地），按對(duì)角交叉（五點(diǎn)法）取樣。先除去表層約2cm的土壤，將鏟子插入土中數(shù)次,然后取210cm處的土壤。盛土的容器應(yīng)是無菌的。將5點(diǎn)樣品約1kg充分混勻，除去碎石、植物殘根等，土樣取回后應(yīng)盡快投使土樣中的菌體、芽抱或抱子均勻分散，此即為 1