BCA蛋白濃度測定-酶標儀法

1、精選文檔BCA法測定蛋白濃度-酶標儀一、藥品1. BCA蛋白濃度測定試劑盒（P0012 , 500次酶標儀，碧云天），含以下成分：a） BCA試劑A （P0012-1 , 100ml ,碧云天），室溫保存b） BCA試劑B （P0012-2 , 3ml ,碧云天），室溫保存c） 蛋白標準（5mg/mlBSA ） （P0012-3 , 1ml ,碧云天），-20 度保存二、儀器和試劑1. 酶標儀（測定波長為 540-595nm 之間，562nm最佳），水浴鍋2. 96孔單條可拆酶標板（平底）3. 15 ml離心管1個（準備BCA工作液用）4. 1.5 ml離心管1個（準備蛋白標準品工作液用）5.

2、 單道移液器和槍頭，8道移液器（排槍）和槍頭6. PBS三、操作步驟1. 水浴鍋調(diào)至37 Co2. 蛋白標準品工作液（1mg/ml ）的配制：將蛋白標準品（5mg/ml ）從-20C冰箱中取 出，完全溶解并混勻。取60 /蛋白標準品（5mg/ml ）,加入240 /PBS ,即稀釋5倍, 即配成蛋白標準品工作液（1 mg/ml ）。3. 計算BCA工作液總量=0.2 ml X （樣本數(shù)+8 ） X 2 X 1.1 （標準品和樣本均需測復孔）。 BCA工作量按50體積的BCA試劑A加上1體積的BCA試劑B配制（即50:1 ）,需充分混 勻。BCA工作液室溫24小時內(nèi)穩(wěn)定。樣本數(shù)156781011

3、12131415161719202122232426A ( ml )6789101112131415B ( ml )0.120.140.160.180.20.220.240.260.280.3總量(ml)6.127.148.169.1810.211.2212.2413.2614.2815.3單條酶標板ABCDEFGH蛋白標準品工作液11 mg/ml ) ( l)PBS(l)蛋白標準品終濃度(mg/ml)S001000S15950.05S210900.1S320800.2S430700.3S540600.4S650500.5S710001.04.按下表配制8個蛋白標準液(S0S7),充分搖勻。可

4、編輯5.將96孔酶標板的A1孔放在左上角，按下表加入蛋白樣本和標準品。(1)先在第34條酶標板的蛋白樣本孔(N 1N8 )中加入待測蛋白樣本各2再用排槍在蛋白樣本孔中追加 PBS液各18使總量達到20科1(此時蛋白樣本的稀釋比為10,適用于預計蛋白濃度為 28mg/ml 時。如預計蛋白濃度太高或太低,可適當調(diào)整稀釋比例）(2)再在第12條酶標板的蛋白標準品孔（S0S7 ）中加入上面配制的 8個蛋白標準液各20 dS0S0N1N1S1S1N2N2S2S2N3N3S3S3N4N4S4S4N5N5S5S5N6N6S6S6N7N7S7S7N8N812ABCDEFGH89101112345676 .用排槍在各孔中加入200，BCA工作液，輕輕搖勻，37 c放量0分鐘或室溫放置2小時。（注意：每次測定時必須都做標準曲線。因為BCA法測定時顏色會隨著時間的延長不斷加深，且顯色反應的速度和溫度有關，所以除非精確控制顯色反應的時間和溫度，否則每次都做標準曲線。 如果濃度較低，可適當?shù)匮娱L孵育時間或在較高溫度孵育。）7 .用酶標儀測定562nm下標準品和樣本的吸光度。8 .用標準蛋白質(zhì)量為橫座標，用吸光度值A562為縱座標，做標準曲線，用線形回歸計算公式Y(jié)=