吡格列酮對脂多糖引起的體外培養(yǎng)大腦皮層神經(jīng)元NO釋放的影響

1、吡格列酮對脂多糖引起的體外培養(yǎng)大腦皮層神經(jīng)元NO釋放的影響【摘要】 目的 探討吡格列酮(pioglitazon, Pio)能抑制脂多糖(lipopolysaccharide, LPS) 引起的培養(yǎng)大腦皮層神經(jīng)元一氧化氮釋放增加. 并探討其抑制作用信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。方法 以體外培養(yǎng)67 d的乳鼠大腦皮層神經(jīng)元為研究對象,建立脂多糖損傷和吡格列酮保護模型。采用Griess法測定細胞培養(yǎng)上清液中NO含量。結(jié)果 脂多糖可導(dǎo)致神經(jīng)細胞損傷. 培養(yǎng)液中NO 含量升高；吡格列酮（1 mol/L）可明顯抑制脂多糖引起的NO含量的升高。結(jié)論 吡格列酮可明顯拮抗脂多糖誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞損傷。 【關(guān)鍵詞】 吡格列酮；脂多糖

2、；神經(jīng)元；NO Abstract：Objective To explore the express effects of pioglitazon (Pio) on lipopolysaccharide-induced NO production to cultured cortical neurons and investigate its signaling pathway. Methods The inflammatory neurotoxicity model was constructed in primary cortical neurons isolated from Spragu

3、e-Dawley rats 67 d neonate rats following a dose lipopolysaccharide to the neurons directly. The contents of NO was detected. Results The cells, exposed to LPS(10 g/mL for 8 h),showed charateristic change of damage, which could be relieved by pioglitazon(1 mol/L) with cell survival rate increment. P

4、ioglitazone could block the increase of NO induced by LPS. Conclusions Pioglitazone can prevent the neurons from the damage of LPS inflammatory neurotoxicity. Key words:pioglitazon; lipopolysaccharide; neurons; NO 近年來的研究已顯示腦內(nèi)炎癥反應(yīng)參與了阿爾茨海默病(Alzheimers disease. AD)以及帕金森病(Parkinson isease ,PD)等神經(jīng)元變性疾病的發(fā)

5、病過程1。脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）是一種以氨基苷為組成單位的磷脂. 構(gòu)成革蘭陰性菌細胞壁成分. 是一種強效的炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)劑。Heneka等研究表明布洛芬和吡格列酮可以通過激活過氧化物酶增殖物激活受體(peroxisome proliferators-activated receptor,PPAR)受體減輕神經(jīng)膠質(zhì)細胞的炎癥反應(yīng)2。Xing B等研究指出. 吡格列酮對抗脂多糖誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元損傷通過抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)表達和NO的產(chǎn)生3。NO是體內(nèi)廣泛存在的一種細胞信使分子. 具有生理性代償和病理性神經(jīng)毒雙重作用。本實驗通過體外培養(yǎng)乳鼠皮層神經(jīng)元細

6、胞. 經(jīng)LPS刺激造成神經(jīng)元損傷模型. 觀察吡格列酮是否能抑制LPS引起的神經(jīng)元NO釋放增加. 同時探討吡格列酮抑制NO釋放的可能的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。 1 材料與方法 1.1 藥品和試劑 吡格列酮由Takeda 公司提供 (批號：060901. 純度99% ). 用二甲基亞砜溶解。二甲基亞砜、脂多糖、DMEM、F12、胰蛋白酶（1250）、L-多聚賴氨酸購于SIGMA公司；GW9662(貨號：CAY-70785-M001)、SP600125(貨號：JBS-INH-006-M002)購于廈門勵遠有限公司；一氧化氮檢測試劑盒（貨號：S0021）購于碧云天生物技術(shù)研究所；胎牛血清、HEPES、馬血清購于

7、北京華美轉(zhuǎn)導(dǎo)科技有限公司；臨用前用DMEM稀釋到所需濃度. 其余試劑均為分析純。 1.2 大腦皮層神經(jīng)元細胞原代培養(yǎng) 參照文獻4 , 取出生24 h內(nèi)的SD 大鼠乳鼠, 75%酒精浸泡消毒. 無菌條件下取出大腦皮層. 置于培養(yǎng)基中. 剔除血管和軟腦膜. 用培養(yǎng)基清洗12 次。將腦組織移入另一含培養(yǎng)基的容器中. 然后剪成1 mm3 大小的組織塊。加入 0.125%胰蛋白酶溶液37消化10 min, 并不時輕輕吹打。待大部分細胞分散后. 即加入完全培養(yǎng)基終止消化。200 目篩網(wǎng)過濾,1 000轉(zhuǎn)離心10 min, 用含10%胎牛血清、10%馬血清的完全培養(yǎng)基將細胞制成懸液, 調(diào)整細胞密度, 以51

8、05 /mL接種在多聚賴氨酸處理過的培養(yǎng)板中, 置于37 、5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后加入含阿糖胞苷(終濃度為5 mg/L)的維持培養(yǎng)基, 抑制非神經(jīng)細胞增殖。以后每3天換液1次,培養(yǎng)7 d后用于實驗。 1.3 藥物處理 神經(jīng)元細胞培養(yǎng)7 d后. 首先用終濃度為10 g/mL的LPS分別加入培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)1、2、4、8、16、24、48 h觀察LPS對NO釋放的時間變化規(guī)律；加吡格列酮組：在培養(yǎng)基中加入終濃度為1 mol/L吡格列酮作用1 h后加入LPS10 g/mL共同培養(yǎng)8 h ；阻斷劑組：在培養(yǎng)基中加入終濃度為5 mol/L的JNK通路的特異性阻斷劑SP600125共同培養(yǎng)一

9、小時后加入LPS10 g/mL再共同培養(yǎng)8 h。 1.4 指標檢測 Griess 法測定培養(yǎng)液中NO 的含量5 。Griess法原理是根據(jù)NO2+ 與Griess試劑反應(yīng)生成紅色化合物. 顏色深淺與體系中的NO3+ / NO2+ 含量成正比. 從而測定NO含量. 是一種間接檢測NO 的方法。以1 molL -1亞硝酸鈉溶液,配制終濃度分別為0、1、2、5、10、20、40、60、100 molL-1的亞硝酸鈉液。按50 L/孔. 在96孔板中加入標準品和樣品。按50 L/孔. 各孔中分別加入室溫Griess Reagent I 和Griess Reagent II。于540 nm 處測吸光度值

10、(OD540)。以亞硝酸鈉濃度(molL-1) 為橫坐標,所測OD值為縱坐標,作出標準曲線,并求出回歸方程及相關(guān)系數(shù)。 1.5 統(tǒng)計學處理 實驗結(jié)果采用均值標準差（s）表示. 用SPSS11.5軟件包進行統(tǒng)計分析. 采用方差分析及q檢驗進行統(tǒng)計學處理. 以P0.05表示差異的顯著性。 2 實驗結(jié)果 2.1 脂多糖作用于原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元不同時間對培養(yǎng)液中NO含量的影響 神經(jīng)元細胞培養(yǎng)7 d后. 加入終濃度為10 g/mL的LPS到培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)1、2、4、8、16、24、48 h. 收集各個時間點的上清液檢測NO的含量。NO標準曲線回歸方程：Y=0.0628+0.0159X(r=0.975

11、1)。由表1可知. LPS作用于皮層神經(jīng)元不同時間后. NO含量均有明顯變化。LPS 2 h組與正常對照組經(jīng)統(tǒng)計學處理（t檢驗）. P0.01有顯著性意義。LPS作用8 h. 培養(yǎng)液中NO含量達高峰. 然后逐漸下降. 48 h恢復(fù)到正常水平。 在神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細胞混合培養(yǎng)模型中. 同樣加入終濃度為10 g/mL的LPS到培養(yǎng)基中作用4 h. 培養(yǎng)液中NO的含量較LPS作用于單純神經(jīng)細胞培養(yǎng)上清液中NO的含量增加更明顯. 分別為7.8740.689和19.5721.304. 二者比較具有明顯的統(tǒng)計學意義（P0.01）。表1 LPS作用于皮層神經(jīng)元不同時間對培養(yǎng)液中NO含量的影響 2.2 吡格列

12、酮抑制LPS引起的皮層神經(jīng)元培養(yǎng)液中NO含量的增加 由表1可以看出. 加入LPS作用8 h. 使NO釋放達高峰. 因此. 本實驗選擇了吡格列酮與LPS共同培養(yǎng)8 h這個時間點. 觀察吡格列酮對LPS引起NO釋放的抑制作用。結(jié)果表明. 吡格列酮(0.1,1和10 mol/L)可劑量依賴性抑制LPS引起的NO釋放增加, 吡格列酮(10 mol/L)可使LPS引起的NO釋放恢復(fù)到正常水平(表2)。表2 吡格列酮對LPS作用于皮層神經(jīng)元培養(yǎng)液中NO含量的影響 2.3 LPS引起的皮層神經(jīng)元NO增加的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制 為了觀察LPS引起的皮層神經(jīng)元NO增加是否與JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān),我們觀察了JNK特異性

13、阻斷劑SP600125對LPS引起的NO產(chǎn)生的影響,結(jié)果表明,在加入LPS前2 h 加入SP600125共同作用8 h,可明顯對抗LPS引起的神經(jīng)元NO產(chǎn)生增加,說明LPS引起的神經(jīng)元NO產(chǎn)生增加是通過JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。單獨應(yīng)用SP600125對正常神經(jīng)元NO產(chǎn)生沒有影響（表3）。表3 吡格列酮影響LPS作用于皮層神經(jīng)元 培養(yǎng)液中NO含量變化的作用機制 3 討 論 一氧化氮（nitric oxide,NO）是一種神經(jīng)遞質(zhì). 在神經(jīng)發(fā)育及衰老過程中有非常重要作用。正常情況下. 參與多種神經(jīng)功能. 但若合成和釋放過多. 則會誘發(fā)細胞毒作用. 導(dǎo)致細胞損傷. 加速神經(jīng)元凋亡或死亡。本實驗通過體外培

14、養(yǎng)皮層神經(jīng)元細胞. 經(jīng)LPS刺激造成神經(jīng)元損傷模型. 結(jié)果顯示LPS可引起培養(yǎng)神經(jīng)元細胞上清液中NO含量明顯增加. 從而引起神經(jīng)元細胞凋亡。為了進一步研究起作用機制. 我們選用了JNK通路的特異性阻斷劑SP600125. 其顯著抑制JNK介導(dǎo)的c-Jun磷酸化. 抑制IL-2、IFN-、TNF-和COX2等基因的表達。實驗結(jié)果表明LPS引起的皮層神經(jīng)元培養(yǎng)液中NO含量的增加可能是通過JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。噻唑烷二酮類(thiazolidinediones,TZDs)和非甾體類抗炎藥(nonsteroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)是PPAR主要的合成配體

15、。吡格列酮是TZDs類化合物的一種. 其通過激活PPAR受體抑制LPS引起的皮層神經(jīng)元培養(yǎng)液中NO含量的增加。Reilly等研究表明前列腺素和吡格列酮通過激活PPAR受體抑制了NO的生成6,7。本實驗結(jié)果顯示吡格列酮通過部分激活PPAR受體抑制了NO的生成。以上都說明吡格列酮可以拮抗脂多糖誘導(dǎo)的神經(jīng)元細胞的損傷,其具體機制有待進一步研究證實。【參考文獻】 1 Martino G,Furlan R,Brambilla E,et al.Cytokines and immunity in multiple sclerosis: tha dual signal hypothesis J. Neuroi

16、mmunol, 2000,109:3-9.2 Heneka MT, Sastre M, Dumitrescu-Ozimek L, et al. Acute treatment with the PPARgamma agonist pioglitazone and ibuprofen reduces glial inflammation and Abeta 1-42 levels in APPV7171 transgenic mice J.Brain, 2005, 128(6): 1442-1453.3 Bin Xing, Tao Xin, Randy Lee Hunter, et al. Pi

17、oglitazone inhibition of lipopolysaccharide-induced nitric oxide synthase is associated with altered activity of p38 MAP kinase and PI3K/Akt J. Neuroinflammation , 2008, 5:4.4 Copani AM, Koh JY. Cotman CW1Beta - amyloid increases neuronal suscep tibility to injury by glucose dep rivationJ. Neuroreport, 1991, 2: 763 - 765.5 張均田. 現(xiàn)代藥理實驗方法M. 北京:北京醫(yī)科大學中國協(xié)和醫(yī)科大學聯(lián)合出版社,1998：1225-1226.6 Reilly CM, Oates JC, Cook JA, et al. Inhibition of mesangial cell nitr