土霉素對酶催化產物的熒光猝滅機理研究及其測定

1、第28卷第3期分析測試學報Vol128No132009年3月FENXICESHIXUEBAO(JournalofInstrumentalAnalysis)353356土霉素對酶催化產物的熒光猝滅機理研究及其測定張苗,岳寧寧,呂慶鑾,宮斌,王懷友(山東師范大學化學化工與材料科學學院,山東濟南250014)摘要:酪氨酸在辣根過氧化物酶催化下被H2O2氧化為強熒光物質S,土霉素對其熒光產生猝滅作用,根據Stern-Volmer方程和熒光壽命研究發(fā)現土霉素對產物S的熒光猝滅為靜態(tài)猝滅。實驗得到土霉素與強熒6光物質S反應的形成常數K=1193×10L/mol(25),結合點數n=1195。反應

2、熱力學參數G<0,H>0,說明該反應是自發(fā)的吸熱過程。根據熒光猝滅原則建立了測定土霉素的新方法,土霉素質量濃度在51608010mg/L范圍內與IF/IF呈線性關系,線性相關系數為019968,檢出限為0190mg/L,相對標準偏差0為0173%。關鍵詞:辣根過氧化物酶;熒光猝滅;土霉素;熱力學參數中圖分類號:O65713;R978114文獻標識碼:A文章編號:1004-4957(2009)03-DeterminationofOxytetracyclineBasedtheofEnzyme2catalyzedZHANGMiao,YUENing2ning,2in,WANGHuai2yo

3、u(CollegeofChemistry,ChemicalMNormalUniversity,Jinan250014,China)Abstract:oxytetracycline(OTC)couldquenchthefluorescenceoftyrandH2O2undertheenzyme2catalyticreactionofhorseradishper2onamethodforthedeterminationofOTCwasdeveloped.AccordingtotheStern-merplotandthefluorescencelifetime,thefluorescencequen

4、chingwasconfirmedtobeastaticone.Resultsshowedthatthebindingconstant(K)andthenumberofbindingsites(n)obtainedfromthereactionofOTCwithsubstanceSwere1193×10L/mol(25)and1195,respectively.Thereactionthermodynamicparameters(G<0,H>0)indicatedthatthereactionwasaspontane2ousendothermicprocess.Thequ

5、enchedfluorescenceintensityofsubstanceSwasproportionaltotheconcentrationofOTCovertherangeof5160-8010mg/Lwithacorrelationcoefficientof019968.Thedetectionlimitandtherelativestandarddeviationwere0190mg/Land0173%,respectively.Keywords:horseradishperoxidase;fluorescencequenching;oxytetracycline;thermodyn

6、amicpa2rameters6土霉素為四環(huán)類抗生素,屬廣譜抗菌藥,可作為預防和治療畜禽疾病的獸藥或作為促進畜禽生長1的飼料添加劑而廣泛應用于可食性動物中。因其良好的殺菌、抑菌作用被用于防治動物和水產品的2疾病感染,但在發(fā)揮藥效的同時對動物體有較大的毒副作用。因此,研究土霉素與生物分子的結合機理及土霉素含量的檢測,對確保用藥安全具有重要的實際意義。目前,土霉素的研究和測定方法主要有高效液相色譜法、紫外可見分光光度法、電化學方法等。熒光分析法因其靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點被應用于化學、藥學、生命科學等領域。關于土霉素的熒光測定方法報道較少,本文采用熒光光度法對土霉素進行了測定。8辣根過氧化物酶(H

7、RP)是從植物中提取的一種重要的酶制劑,被廣泛應用于生物工藝技術、生物傳感器9-103-567、有機合成11等領域。已有報道酪氨酸在辣根過氧化物酶催化下被H2O2氧化為強熒光12物質(產物S),反應方程式如圖1所示。實驗研究了土霉素對產物S的熒光猝滅機理,并根據熒光猝滅原則建立了測定土霉素的新方法。收稿日期:基金項目:第一作者:通訊作者:2008-09-18;修回日期:2008-10-26山東省自然科學基金資助項目(Y2006B31)張苗(1980-),女,山東濰坊人,碩士研究生王懷友,TelE-mail:wanghuaiyousdnu1edu1cn354分析測試

8、學報第28卷1實驗部分111儀器與試劑FLS2920熒光分光光度計(Edinburgh,英國)可用于熒光壽命的測定;LS250熒光分光光度計(Perkin-El2mer,美國);pHS23C型酸度計(上海雷磁儀器廠);Di2rect2Q3(Millipore,美國)超純水系統(tǒng);YXCS型超級數顯恒溫器(山東鄄城永興儀器廠)。土霉素(化學對照品,純度9214%,中國藥品生物制品檢定所);L2酪氨酸(生化試劑,上海試劑廠);辣根過氧化物酶(HRP,酶活性為250330U/mg,酶的純度為310);土霉素片(山東金洋藥業(yè)有限公司);其他所用試劑均為分析純。土霉素標準儲備液(800mg/L);HRP溶

9、液(100mg/L);L2酪氨酸溶液(400mg/L逐級稀釋至所需濃度,均于4下避光保存。H2O2溶液(01。pH815的Tris(三羥甲基氨基甲烷)-HCl緩沖溶液。圖1反應方程式Fig11Thereactionequation土霉素片樣品溶液的制備:取本品6片,研細,10100mL水,超聲處理50min,離心,取上層清液轉移到100mL,作為待測試樣。112實驗方法準確移取018050mLH2O2、210mLpH815的Tris-HCl緩沖溶液于10mL搖勻,作為溶液A。另取同量的上述試劑于另一比色管中,35min后加入110,用水稀釋至刻度并搖勻,作為溶液B。2211熒光猝滅光譜按照“1

10、12”步驟,繪制產物S加入土霉素前后的發(fā)射光譜,結果見圖2。產物S的最大發(fā)射波長為400nm。土霉素存在下,產物S的熒光強度明顯降低,表明發(fā)生了熒光猝滅。212熒光猝滅機理探討熒光猝滅分為動態(tài)猝滅、靜態(tài)猝滅及動態(tài)靜態(tài)相結合的猝滅,猝滅關系可用Stern-Volmer方程描述。如果靜態(tài)猝滅與動態(tài)猝滅同時存在,S-V曲線具有向上彎曲的非直線特征,并滿1002足下列多項式:IF/IF=1+(KD+KS)cQ+KDKScQ,KD、KS分別為動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅常數,IF、IF分別為未加入猝滅劑和加入猝滅劑時的熒光強度,cQ為猝滅劑的濃度。本實驗的線00性方程為IF/IF=017794+010244c,相

11、關系數為019968,S-V圖為線性,所以土霉素對產物S的熒光猝滅不是動態(tài)猝滅與concentrationofoxytetracycline:3010mg/L靜態(tài)猝滅結合的猝滅。0如果猝滅過程為動態(tài)猝滅,則滿足Stern-Volmer方程:IF/IF=1+kq0cQ=1+KsvcQ,kq為猝滅過-1-1程的速率常數(單位Lmols),0為沒有猝滅劑存在時熒光分子的熒光壽命,Ksv為Stern-1Volmer猝滅常數(單位Lmol),S-V方程呈線性。圖2加入土霉素前(a)、后(b)產物S的發(fā)射光譜Fig12EmissionspectraofsubstanceSbefore(a)andafter

12、(b)addingoxytetracycline如果猝滅過程為靜態(tài)猝滅,熒光強度降低是由于形成了非熒光化合物,則滿足S-V方程:I/IF=1+KcQ,K為形成常數,S-V方程也呈線性。通過熒光壽命的測定可區(qū)分動態(tài)與靜態(tài)猝滅。靜態(tài)猝滅時,猝滅劑的存在不改變熒光分子的壽命;0而在動態(tài)猝滅情況下,猝滅劑的存在使熒光分子壽命縮短。即0/1=1時為靜態(tài)猝滅,0/1=IF/IF0F時為動態(tài)猝滅。本實驗中土霉素作為熒光猝滅劑,產物S的熒光壽命在加入土霉素前后無明顯變化(圖3和圖4),表明產物S和土霉素之間發(fā)生靜態(tài)猝滅。0=5136ns,1=5137ns,即0/11。14第3期張苗等:土霉素對酶催化產物的熒光

13、猝滅機理研究及其測定355213靜態(tài)猝滅形成常數與結合點數對靜態(tài)猝滅反應來說,那么熒光分子和猝滅劑之間可按下式反應12:nQ+BQn-B,Qn-B是猝滅的熒光分子,n在本文中熒光分子即產物S,Ka=c(Qn-B)/(cQcB)。00()是cB,則cB=c(Qn-B)+cB,cB是未反應的cBcB=IF/IF,IF和IF分別為熒光分子在猝滅分子存在和不存在時的熒光強度,那么IFIF)/IF=lgK+nlgcQ,K是猝滅分子與熒光分子的形成常數,n為結合點數。用0lg(IF-IF)/IF對lgcQ作圖,直線斜率為n,截距為lgK,即得土霉素與產物S的形成常數K=1193×00010L/m

14、ol(25),結合點數n=1195,曲線的相關系數r=019914,為顯著性相關。6214反應熱力學參數根據vantHoff方程lnK=-H(RT)+SR,得到土霉素與產物S反應的熱力學參數。其中H-1S求與S由lnK對T作圖所得曲線的斜率(-HR)和截距(SR)求出,G由方程G=H-T得,見表1。G<0,H>0,說明反應是自發(fā)的吸熱過程。升高溫度有利于反應向產物的方向進行,這與表中形成常數顯示的大小變化規(guī)律相符。T/K表1反應熱力學參數Table1ReactionthermodynamicparametersK2913013113213331139214841646198215實

15、驗條件的優(yōu)化21511pH值的影響試驗了pH(1101210)對體系熒光強度的影響,結果表(-1)(-1)(-1mol-1)-341244217126413×1066-36187×106-39171×106-42108×107-45136明,pH為810819時體系熒光強度穩(wěn)定,故選擇pH815的Tris-HCl緩沖溶液控制體系的pH值。21512H2O2用量與HRP加入量的影響按照“112”分析步驟,當H2O2加入量為0150mL時體系熒光強度最大,故加入0150mL01003(體積分數)的H2O2。當加入HRP(50mg/L)的體積大于0180mL時

16、,體系熒光強度最大且保持不變,所以實驗時選擇加入0180mL50mg/L的HRP。21513試劑加入順序及反應時間的影響試驗了試劑加入順序對體系熒光強度的影響。實驗表明,最佳加入順序為HRP、酪氨酸、H2O2、緩沖溶液、土霉素。測定了不同反應時間對體系熒光強度的影響。室溫下反應30min后,體系熒光強度趨于穩(wěn)定,因此選擇反應時間為35min。加入土霉素后熒光強度降低,5min后熒光強度達到穩(wěn)定且保持不變,故加入土霉素6min后再進行測定。21514干擾離子的影響分析了常見離子對測定3010mg/L土霉素溶液的影響。相對誤差控制在356分析測試學報第28卷±5%內。干擾離子以500mg

17、/L為起始質量濃度,如果存在干擾,降低干擾離子的質量濃度直至干擾+-+-2-3-消除。結果如下:K、H2PO4、Cl允許存在量500mg/L;Na、Ac、HPO4、PO4允許存在量400mg/L;NO3、SO4、Mg允許存在量250mg/L;CO3、HCO3與Ca允許存在量分別為200、150、1mg/L。-2-2+2-2+216工作曲線、精密度與檢出限土霉素質量濃度在51608010mg/L范圍內與IF/IF呈良好的線性關系,線性回歸方程為c=40198IF/IF-31194,IF為產物S的熒光強度,IF為土霉素存在時產物S的熒光強度,c為土霉素的濃度,線性相關系數為019968。同一樣品測

18、定11次,測得土霉素的平均質量濃度為30114mg/L,相對標準偏差為0173%。同法測定空白11次,測得檢出限為0190mg/L。217樣品分析與回收率實驗分別取0150、110、310mL待測試樣,測定土霉素的質量濃度,13果對照。測定3次取平均值,在置信度等于95%時,用Cochran檢驗,2異。樣品分析與回收率結果見表2。表2Table2No123ProposedmethodUVspectrophot-1±01120170116/(mgL-1)7151±010815130456Found-1Recovery-1101015102010/(mgL61006100610

19、0)L/(mg161219172516)RSDs/%0162013421621037893參考文獻:1馬玉紅,史海燕.土霉素研究概況J.青海畜牧獸醫(yī)雜志,2007,37(4):45-46.2張美金,林峰,林海丹,等.飼料中四環(huán)素類藥物含量的高效液相色譜測定J.分析測試學報,2007,26(6):918-920.3PATRICIAPM,SUANNER,FELIXGRR.DeterminationofoxytetracyclineintomatoesbyHPLCusingfluorescencedetectionJ.FoodChem,2008,17(1):212-218.4WANGLinling,

20、YANGHai,ZHANGChunwei,etal.Determinationofoxytetracycline,tetracyclineandchlorampheni2colantibioticsinanimalfeedsusingsubcriticalwaterextractionandhighperformanceliquidchromatographyJ.AnalChimActa,2008,619(1):54-58.5龐國芳,曹彥忠,張進杰,等.高效液相色譜法同時測定禽肉中土霉素、四環(huán)素、金霉素、強力霉素殘留的研究J.分析測試學報,2005,24(4):61-63.6邱光成,高宏艷.紫

21、外分光光度法測定土霉素片中間體(顆粒)的含量J.黑龍江醫(yī)藥,2007,20(5):434-435.7張敏,程發(fā)良,姚海軍.土霉素的電化學性質及其與DNA相互作用的研究J.分析測試學報,2007,26(5):634-637.8RYANBJ,CAROLAN,OFAGAINC.Horseradishandsoybeanperoxidases:comparabletoolsforalternativenichesJ.TrendsBiotechnol,2006,24(8):355-363.9XUShiyi,PENGBo,HANXiaozu.Athird2generationH2O2biosensorbasedonhorseradishperoxidase2labeledAunan