類風(fēng)關(guān)巴布劑穴位貼敷對膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子-κβ表達(dá)的影響

1、類風(fēng)關(guān)巴布劑穴位貼敷對膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子-表達(dá)的影響 11-05-10 09:36:00 編輯：studa20 作者：葉天申,鄒賢斐,金可可,朱小春,林向陽,陳勇 【摘要】 目的 比較不同組合穴位貼敷類風(fēng)關(guān)巴布劑對牛型膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(CIA)大鼠滑膜細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子-(NF-)表達(dá)的影響。方法 大鼠背部5處皮內(nèi)注射牛型膠原誘導(dǎo)大鼠關(guān)節(jié)炎,觀察以雷公藤為主的中藥類風(fēng)關(guān)巴布劑不同組合穴位貼敷對模型大鼠免疫組化指標(biāo)NF-計分,以及滑膜細(xì)胞上清液的白細(xì)胞介素-1(IL-1)與腫瘤壞死因子-(TNF-)的影響。結(jié)果 類風(fēng)關(guān)巴布劑治療后,各穴位貼敷組大鼠的NF-計分較模型組降低, 其中系統(tǒng)

2、組(遠(yuǎn)近配穴)最接近正常組；各組滑膜浸液中IL-1、TNF-濃度降低。結(jié)論 類風(fēng)關(guān)巴布劑穴位貼敷能夠降低CIA大鼠滑膜細(xì)胞的NF-的蛋白表達(dá),并降低相關(guān)細(xì)胞因子的濃度,抑制正反饋效應(yīng)；遠(yuǎn)近配穴可能通過標(biāo)本兼治,多靶點起效,使其整體療效優(yōu)于單純遠(yuǎn)道取穴或局部取穴。 【關(guān)鍵詞】 關(guān)節(jié)炎,類風(fēng)關(guān)巴布劑；大鼠；核轉(zhuǎn)錄因子-；腫瘤壞死因子-；白細(xì)胞介素-1類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是慢性全身性自身免疫性疾病，其病理基礎(chǔ)為關(guān)節(jié)滑膜的過度增生,誘導(dǎo)異常增生的滑膜組織發(fā)生凋亡可能成為治療RA的有效途徑?；さ脑錾c凋亡之間的平衡受多種因素的制約,細(xì)胞因子是其因素之一。在眾多細(xì)胞因子中,腫瘤壞死因子(TNF)-和白細(xì)

3、胞介素(IL)-1扮演著重要的角色。研究表明,TNF-抑制細(xì)胞發(fā)生凋亡的機(jī)制受核轉(zhuǎn)錄因子-(Nuclear factor-,NF-)的調(diào)控1, Yamasaki等2研究認(rèn)為NF-可能是治療RA的目標(biāo)分子。本實驗通過對牛型膠原(Bc)誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(CIA)大鼠不同組合穴位貼敷類風(fēng)關(guān)巴布劑,觀察其對大鼠滑膜細(xì)胞NF-表達(dá)的影響,并初步探討經(jīng)絡(luò)腧穴在其中的作用。1 實驗材料1.1 動物 Wistar大鼠,清潔級健康雄性,80只,體重(12015)g,購于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司,正常飼養(yǎng)。1.2 藥物與試劑 雷公藤、白花蛇舌草、乳香、沒藥；Bc,Chondrex公司(美國)；完全弗氏佐劑,Sig

4、ma公司(美國)；IL-1ELISA kit購于Biosource公司(美國)；TNF- ELISA kit購于Biosource公司(美國)；NF-購于santa cruz Biotechnology,inc(美國)；多聚賴氨酸玻片100張,EiVisionPolymerHRP(Ms/Rb) IHC Kit 6 mL。1.3 儀器 顯微鏡OLYMPUS(日本),低溫高速離心機(jī)BECKMEN(美國),酶標(biāo)儀Bio-rad680(美國)。2 實驗方法2.1 類風(fēng)關(guān)巴布劑的組成及制作方法 雷公藤、白花蛇舌草、乳香、沒藥等,共12味,按固定劑量配伍(其中雷公藤占總藥量的28%),曬干,研粉,過20目

5、篩,用80%乙醇滲漉提取,然后過濾取液,經(jīng)低溫低壓(50 ,-0.8個大氣壓)蒸餾去乙醇后得浸膏。將浸膏按一定比例加入事先配制的巴布劑基質(zhì)(主要成分明膠、甘油、聚丙烯酸鈉等)中,并加入0.5%的促滲劑(氮酮)、一定比例的乳化劑及防腐劑等,充分溶合,均勻涂布于無紡布上,覆蓋聚乙烯薄膜,切成3 cm3 cm的方塊(重量 g),密封包裝,陰涼處儲存?zhèn)溆谩?.2 造模和分組 隨機(jī)從100只大鼠中選出10只為正常對照,其余90只用于造模,參照文獻(xiàn)3方法配制成型膠原乳劑。具體方法為：在無菌條件下,用0.1 mol/L冰醋酸充分溶解Bc,濃度為4 mg/mL,置4 冰箱過夜后,與弗氏完全佐劑等體積混合、振蕩

6、乳化,制成Bc乳劑(即每0.5 mL含1 mg Bc)。置4 冰箱保存?zhèn)溆?。注射方法：于大鼠背部及尾根?點行皮內(nèi)注射,每點0.1 mL,總量0.5 mL(含1 mg Bc型膠原)。15 d后同法分2點皮內(nèi)激發(fā)注射。正常對照組予以生理鹽水同法注射。初次免疫25 d后參照關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分標(biāo)準(zhǔn)1對造模效果進(jìn)行評估,評分達(dá)6分以上的大鼠被用于繼續(xù)實驗。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為4組,即類風(fēng)關(guān)巴布劑局部穴位貼敷組(局部組)、類風(fēng)關(guān)巴布劑遠(yuǎn)道穴位貼敷組(遠(yuǎn)道組)、類風(fēng)關(guān)巴布劑系統(tǒng)穴位貼敷組(系統(tǒng)組)和模型對照組(模型組)各10只。2.3 給藥 根據(jù)臨床及有關(guān)動物實驗的取穴方案4取穴。系統(tǒng)組：大椎、雙側(cè)腎俞、

7、雙側(cè)太溪,共5個穴點；遠(yuǎn)道組：大椎、雙側(cè)腎俞,共3個穴點；局部組：雙側(cè)太溪,共2個穴點。根據(jù)貼敷總面積相同(劑量相等)的原則,系統(tǒng)組每穴貼敷面積為0.15 cm2的圓形巴布劑(半徑0.22 cm)；遠(yuǎn)道組每穴貼敷面積為0.25 cm2(半徑0.28 cm)；局部組每穴貼敷面積為0.375 cm2 (半徑0.35 cm)。在穴位處脫毛后貼敷,每3 d貼敷1次,共5次,每次雷公藤甲素劑量約為3.8 g5。正常組和模型組模仿局部組貼敷不含藥物的巴布劑基質(zhì)。15 d后各組同時處死取標(biāo)本。2.4 取材 大鼠稱重,用2%戊巴比妥納腹腔麻醉,仰位固定,沿著左側(cè)后腿膝關(guān)節(jié)正中縱行切開皮膚直至暴露出膝關(guān)節(jié)位中心

8、約3 cm3 cm的區(qū)域。沿髕骨上緣約0.30.4 cm處向下切割至股骨,再分別沿髕骨兩側(cè)向下分離至脛骨,此時即打開了膝關(guān)節(jié)腔,可見由髕骨下極向下延續(xù)有一層平滑光亮呈淺淡黃色的滑膜組織。用眼科直鑷輕輕夾住其中央,用眼科剪完整剪下,置10%的中性甲醛中固定,用于檢測NF-的免疫組織化學(xué)染色。同法取右側(cè)滑膜,滑膜取出之后,用生理鹽水1 mL沖洗關(guān)節(jié)腔,收集關(guān)節(jié)腔液和關(guān)節(jié)滑膜組織,用于IL-1、TNF-的檢測。2.5 檢測指標(biāo)IL-1、TNF-活性測定采用ELISA法,按照所附說明書測定關(guān)節(jié)滑膜組織溶漿的活性。先加入標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品,設(shè)置陰性對照,加入生物素結(jié)合的一抗(IL-1、TNF-),37 溫

9、箱孵育2 h,然后用洗滌液充分洗滌4次,向濾紙印干。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗工作液25 孵育1 h,再用洗滌液充分洗滌4次,向濾紙印干。加入顯色液25 孵育30 min后加入終止液。上機(jī)檢測吸光度值。準(zhǔn)備組織切片(石蠟切片脫蠟至水,冰凍切片和細(xì)胞培養(yǎng)片用適當(dāng)方法固定)；抗原修復(fù)(微波加熱法,適用石蠟切片),將切片置于耐高溫容器中,注入抗原修復(fù)液,使切片位于液面以下。置微波爐內(nèi)加熱使容器內(nèi)液體溫度保持在9298 之間并持續(xù)5 min,取出容器,室溫冷卻,3050 min后降至室溫。用TBS 沖洗切片45次,甩干,擦凈,加20 L 3% H2O2-甲醇溶液(Reagent F),于室溫濕盒中封

10、閉30 min。取出切片,用TBS沖洗45次,甩干,擦凈。用封閉液(Reagent B)20 L覆蓋,室溫濕盒孵育30 min。用吸水紙將封閉液吸去,勿洗,滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗。37 孵育12 h或4 過夜。TBS沖洗45次,甩干,擦凈。滴加生物素標(biāo)記二抗(Reagent C)20 L,室溫濕盒孵育12 h。TBS沖洗45次,甩干,擦凈。滴加酶標(biāo)親和素(Reagent D)20 L,室溫濕盒孵育30 min。TBS沖洗45次,滴加DAB工作液(Reagent E)約30 L/片,著色后迅速(約1 min內(nèi))沖洗干凈。20 L蘇木精(Reagent G)復(fù)染。沖洗干凈脫水封片,鏡檢。在滑膜組織

11、中NF-表達(dá)陽性的滑膜組織細(xì)胞核呈橘黃色或棕黃色,每張切片沿滑膜組織帶計算400倍視野中陽性細(xì)胞的占有率,計數(shù)3個視野,標(biāo)出每個視野平均陽性細(xì)胞占有率,并按陽性細(xì)胞占有率分為5級：“0”為無陽性細(xì)胞,“+”為陽性細(xì)胞025%,“+”為陽性細(xì)胞25%50%,“+”為陽性細(xì)胞50%75%,“+”為陽性細(xì)胞75%100%。0級積分為0,“+”積分為1,以此類推。2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS11.0統(tǒng)計軟件,若數(shù)據(jù)為正態(tài)分布總體比較采用多組單因素方差分析,組間比較用q檢驗(Newman- Keuls法),否則用秩和檢驗的Kruskal-Wallis法和Nemenyi法,P0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。3

12、 結(jié)果(見表1、表2)表1 各組大鼠滑膜細(xì)胞NF-的表達(dá)(略)注：與模型組比較,P0.05,P0.01(下同)表2 各組大鼠滑膜浸液的TNF-、IL-1水平比較(xs,ng/mL) 11-05-10 09:36:00 編輯：studa204 討論 NF-是1986年由Sen和Baltimore首先報道7,并發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞核提取物中有一種核蛋白能與免疫球蛋白K輕鏈基因增強(qiáng)子序列特異結(jié)合,促進(jìn)了K輕鏈的表達(dá),被稱為NF-。越來越多的證據(jù)表明,在RA發(fā)病的過程中,NF-做為轉(zhuǎn)錄因子家族成員參與了滑膜組織的過度增生和炎癥過程8。NF-在胞漿中與其抑制亞單位-結(jié)合而處于未活化狀態(tài),并可被TNF-、IL-等不

13、同的信號所激活,其活化則有賴于胞漿中-的降解。在正?；?NF-的表達(dá)量很低9。在RA的滑膜中,免疫活性NF-蛋白p50和p65大量表達(dá)于襯里層細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中10。NF-的活化在RA早期滑膜炎癥和增生的過程中起中心罪犯作用11。 在正常細(xì)胞構(gòu)成性表達(dá)活化的NF-僅見于成熟B細(xì)胞、漿細(xì)胞和某些神經(jīng)元中,而其他大多數(shù)細(xì)胞的NF-需在外界的刺激誘導(dǎo)下發(fā)生激活。許多細(xì)胞外因素可誘導(dǎo)NF-的活化,如炎性細(xì)胞因子TNF-、IL-1等,但最終都通過IKK使-降解而與NF-解離,暴露NF-的NLS,使NF-經(jīng)核孔進(jìn)入核內(nèi),與DNA靶序列結(jié)合,發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控效應(yīng)；而NF-的活化導(dǎo)致了許多基因的表達(dá),以直接或

14、間接的方式調(diào)節(jié)機(jī)體的生理和病理反應(yīng)。在此過程中,TNF-、IL-1等前炎細(xì)胞因子在NF-作用下生成增加,它們作為外界刺激因子進(jìn)一步活化NF-信號通路,產(chǎn)生正反饋放大作用,這是NF-迅速動員、反應(yīng)靈敏的重要條件。然而,由于NF-活化導(dǎo)致大量細(xì)胞因子、酶等生物活性物質(zhì)的產(chǎn)生,它的過度活化必然導(dǎo)致機(jī)體的病理反應(yīng)和損傷,正常細(xì)胞內(nèi)NF-的活化是在細(xì)胞內(nèi)外通路的正、負(fù)反饋的精細(xì)調(diào)節(jié)下,使NF-的活化保持在適當(dāng)?shù)乃?。正、?fù)兩種反饋調(diào)節(jié)往往同時進(jìn)行,NF-是否處于活化狀態(tài)則取決于何種調(diào)節(jié)占優(yōu)勢。 CIA的產(chǎn)生和發(fā)展與RA有著很多的相似性,二者都依賴于自身反應(yīng)性T細(xì)胞和B細(xì)胞的激活,并能產(chǎn)生類似類風(fēng)濕因子的

15、抗體。Seetharaman等12在CIA大鼠的研究表明,對于型和型T細(xì)胞依賴的免疫應(yīng)答而言,抗體誘導(dǎo)NF-的活化主要導(dǎo)致T細(xì)胞依賴的免疫應(yīng)答,抑制NF-信號通路,使血清TNF-、IgG2a抗型膠原(C)抗體水平明顯下降而IgG1水平不變,CD8+T細(xì)胞減少,CIA發(fā)病率及嚴(yán)重性明顯減少和減輕。因此,本實驗選用CIA大鼠為模型。 RA屬于中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇,近年來,大量研究認(rèn)為雷公藤對CIA大鼠有效,并有采用含雷公藤的復(fù)方中藥穴位貼敷治療CIA大鼠的研究13。我們將以雷公藤為主藥的復(fù)方中藥制劑與針灸穴位有機(jī)結(jié)合,研制類風(fēng)關(guān)巴布劑,并進(jìn)行了毒理、制劑學(xué)及臨床的研究,在大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎穴位貼敷研究

16、中,證明相同的給藥劑量(貼敷面積)不同的穴位組合作用有差異,以系統(tǒng)組(遠(yuǎn)近配穴)最佳14。另據(jù)研究,雷公藤甲素可以下調(diào)CIA大鼠滑膜細(xì)胞TNF-的表達(dá),同時還可以有效抑制NF-的表達(dá)與活性15。本實驗中,造模后NF-積分水平明顯升高,治療后各組都有所下降,以系統(tǒng)組最接近正常,同時治療后各組滑膜浸液的TNF-、IL-1水平也有明顯下降。因此,類風(fēng)關(guān)巴布劑穴位貼敷能夠有效打破NF-與TNF-、IL-1之間的正反饋調(diào)節(jié)的惡性循環(huán)。 在本次實驗中,除了藥物的療效外,合理用穴也是關(guān)鍵要素,一方面,通過經(jīng)絡(luò)腧穴給藥對藥效的放大作用來提高療效,另外,遠(yuǎn)近配穴可能通過標(biāo)本兼治,多靶點起效,使其整體療效優(yōu)于單純

17、遠(yuǎn)道取穴或局部取穴?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 Aggarwal BB. Tumor neerosis factors recepotor associated signaling molecules, JNK and NF-J. Ann Rheum Dis,2000, 59(suppl 1)：616.2 Yamasaki S, Kawakami A, Nakashima T, et al. Importance of NF- in rheumatoid arthritis synovial tissues：in situ NF- expression and in vitro study using

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