TBI和環(huán)磷酰胺選擇性去除同種異基因反應(yīng) 供者淋巴細(xì)胞的研究

1、TBI和環(huán)磷酰胺選擇性去除同種異基因反應(yīng) 供者淋巴細(xì)胞的研究    作者：陳寶安，董偉民, 丁家華，孫雪梅，鄧曉靜, 張琰，畢延智     趙剛, 高沖，孫耘玉，王駿，程堅(jiān)，Schmitt M2 ，Schmitt A2    【摘要】 本研究用全身照射(TBI)和環(huán)磷酰胺（CY）選擇性去除同種異基因反應(yīng)的供者淋巴細(xì)胞,為預(yù)防移植物抗宿主病(GVHD)的發(fā)生探索新的手段。以(BALB/c×C57BL/6)F1雌性小鼠（H?2d/b）為受鼠，于第0天接受亞致死量的60C

2、o?射線全身照射，總劑量為4 Gy，第1天接種P388D1白血病細(xì)胞，第2天輸注由C57BL6雄性小鼠（H?2b）為供鼠提供的MHC不匹配的供者脾淋巴細(xì)胞，在造血干細(xì)胞移植前誘導(dǎo)移植物抗白血病效應(yīng)（GVL）。第6天腹腔注射環(huán)磷酰胺（CY）200 mg/kg或再次TBI 9 Gy，選擇性去除同種異基因反應(yīng)供者淋巴細(xì)胞，第7天輸注(BALB/c×C57BL/6)F1雄性小鼠（H?2d/b）提供的骨髓造血干細(xì)胞。結(jié)果顯示：以CY和TBI選擇性去除同種異基因反應(yīng)供者淋巴細(xì)胞組的小鼠無白血病和GVHD的發(fā)生，生存期超過了210天，于移植后第21天出現(xiàn)完全供者嵌合，然后嵌合率下降，第90天表現(xiàn)為

3、混合嵌合體（MC）。對照組的小鼠出現(xiàn)了白血病和GVHD，出血、感染明顯，生存期短，為20-36天（P<0.01）。結(jié)論：同基因骨髓移植前輸注不相匹配的供者脾細(xì)胞誘導(dǎo)GVL效應(yīng),然后再通過TBI和CY選擇性去除同種異基因反應(yīng)的供者淋巴細(xì)胞來預(yù)防移植物抗宿主病(GVHD)的發(fā)生是可能的。    【關(guān)鍵詞】 同種異基因造血干細(xì)胞移植；同種異基因反應(yīng)供者淋巴細(xì)胞；移植物抗白血病效應(yīng)；移植物抗宿主病；全身照射；環(huán)磷酰胺 Selective Elimination of Alloreactive Donor Lymphocytes by Using TBI a

4、nd Cyclophosphamide    Abstract    This study was aimed to investigate a new method of avoiding graft?vs?host disease (GVHD) through selective elimination of alloreactive donor lymphocytes by using total body irradiation (TBI) and cyclophosphamide (Cy). Female

5、 (BALB/c×C57BL/6)F1 mice (H?2d/b) as recipients received 60Co ?ray sublethal TBI of 4 Gy on day 0 followed by being inoculated with P388D1 leukemia cell line on day 1,injection of allogeneic splenocytes from C57BL6 male mice（H?2b） was carried out for induction of graft?vs?leukemia (GVL) effect

6、prior to stem cell transplantation (SCT) , intraperitoneally injection of cyclophosphamide (Cy) (200 mg/kg) and TBI (9 Gy) was given on day 6. One day later, treated mice were rescued with bone marrow hematopoietic stem cells from (BALB/c×C57BL/6)F1 male mice（H?2d/b）. The results showed that re

7、cipients had no occurrence of leukemia and GVHD through selective elimination of alloreactive donor lymphocytes by Cy and TBI, survived more than 210 days，the complete?donor chimerism occured on day 21 after transplantation. The ratio of chimerism descended subsequently, but still displayed mixed?ch

8、imerism at 90 days. Control mice died of GVHD, leukemia or other death?related?transplantation within 20 to 36 days（P<0.01）.It is concluded that to induce GVL effects by MHC mismatched splenocytes given before syngeneic bone marrow transplantation followed by selective elimination of alloreactive

9、 donor lymphocytes through TBI and Cy, graft?vs?host disease was thus avoided.    Key words    allogeneic hematopoietic stem cell transplantation；alloreactive donor lymphocyte；graft?versus?leukemia；graft?versus?host disease; total body irradiation; cyclophosph

10、amide    異基因外周血造血干細(xì)胞移植(allo?HSCT)是治療惡性血液病和某些實(shí)體瘤的重要手段，移植物抗宿主病(GVHD)是異基因外周血造血干細(xì)胞移植主要的并發(fā)癥和死亡原因。目前預(yù)防GVHD的措施主要是在移植前后應(yīng)用細(xì)胞毒藥物和免疫抑制劑，雖可明顯降低GVHD的發(fā)生，但也減弱了移植物抗白血病效應(yīng)（GVL）或移植物抗腫瘤效應(yīng)（GVT），從而導(dǎo)致白血病或腫瘤的復(fù)發(fā)。本研究探討造血干細(xì)胞移植前誘導(dǎo)移植物抗白血病效應(yīng)。我們在造血干細(xì)胞移植前輸注不相匹配的供者淋巴細(xì)胞,然后再用全身照射（TBI）和環(huán)磷酰胺（CY）選擇性地去除同種異基因反應(yīng)的供者淋巴細(xì)胞來

11、預(yù)防移植物抗宿主病的發(fā)生。    白血病細(xì)胞株    小鼠急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系3881(388)購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫，然后將其置于RPMI 1640(Gibco公司產(chǎn)品)培養(yǎng)液(含15%小牛血清,碳酸氫鈉1-2 /, 2.38 /, 300 /,青霉素、鏈霉素各200 /)進(jìn)行傳代培養(yǎng),每3-4天傳代1次。培養(yǎng)條件:5% 2、飽和濕度、37。    動(dòng)物    受鼠為清潔級(BALB/c×C57BL/6

12、)F1雌性小鼠（H?2d/b），10-12周齡，體重19.5±1.5 g；供鼠為清潔級雄性C57BL/6小鼠(H?2b,B6)和(BALB/c×C57BL/6)F1雄性小鼠（H?2d/b），由揚(yáng)州大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院提供，均飼養(yǎng)于東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院SPF級動(dòng)物房內(nèi)，飼料及墊料均經(jīng)輻照消毒，飲用高壓消毒無菌水。    試劑及器材    環(huán)磷酰胺（CY，200毫克/支）為上海華聯(lián)制藥有限公司產(chǎn)品，TRIzoL RNA抽提試劑盒為Invitrogen公司產(chǎn)品，60Co放療機(jī)（中國核動(dòng)力研究設(shè)計(jì)院研制的GWGT

13、80型60Co遠(yuǎn)距離治療機(jī)），由南京市第二人民醫(yī)院提供幫助。    移植細(xì)胞的準(zhǔn)備    C57BL6雄性（H?2b）供鼠,頸椎脫位法處死, 75 %的乙醇中浸泡5分鐘,無菌條件下取出脾臟,置于200 目金屬過濾網(wǎng)上,用研磨棒輕輕按壓,用RPMI 1640 培養(yǎng)液沖洗,細(xì)胞懸液洗滌3 次,計(jì)數(shù),調(diào)整濃度為5×107/ml 。(BALB/c×C57BL/6)F1雄性供鼠（H?2d/b）同樣在無菌條件下剝離股骨及脛骨,剪去兩端,用RPMI 1640 培養(yǎng)液沖出骨髓,制成細(xì)胞懸液,洗滌3 次,計(jì)數(shù),調(diào)

14、整細(xì)胞濃度為1×108/ml；    白血病細(xì)胞接種、脾淋巴細(xì)胞輸注和骨髓移植    (BALB/c×C57BL/6)F1雌性受鼠（H?2d/b）,移植前5 天 開始飲用含紅霉素250 mg/L 、慶大霉素320 mg/L 的冷卻開水。第0 天 置于清潔級包裝的塑料盒內(nèi)接受60Co 射線4.0 Gy全身照射，照射距離80 cm , 照射時(shí)均為立式體位,劑量率500 cGy/min。第1天接種P388D1白血病細(xì)胞株0.5 ml,含細(xì)胞數(shù)0.5×107,第2天輸注由C57BL6雄性小鼠（

15、H?2b）為供鼠提供的MHC不相匹配的供者脾淋巴細(xì)胞0.3 ml，細(xì)胞數(shù)1.5×107,第6天腹腔注射環(huán)磷酰胺（CY）200 mg/kg或再次TBI 9 Gy，照射方法同前,第7天輸注由(BALB/c×C57BL/6)F1雄性小鼠（H?2d/b）提供的骨髓細(xì)胞0.3 ml,含細(xì)胞數(shù)3×107。    實(shí)驗(yàn)分組    將(BALB/c×C57BL/6)F1雌性受鼠（H?2d/b）隨機(jī)分為6組。A組：TBI輸注白血病細(xì)胞株P(guān)388D1（n=8）；B 組：TBI輸注白血病細(xì)胞株P(guān)3

16、88D1脾淋巴細(xì)胞輸注（n=8）；C組：TBI輸注白血病細(xì)胞株P(guān)388D1脾淋巴細(xì)胞輸注TBI（n=8）；D組：TBI輸注白血病細(xì)胞株P(guān)388D1脾淋巴細(xì)胞輸注（n=8）；E組：TBI輸注白血病細(xì)胞株P(guān)388D1脾淋巴細(xì)胞輸注TBI骨髓細(xì)胞輸注（n=8）；F組：TBI輸注白血病細(xì)胞株P(guān)388D1脾淋巴細(xì)胞輸注CY骨髓細(xì)胞輸注（n=8）。    主要的觀察項(xiàng)目    一般狀況 移植后每日觀察受鼠體形、體位、毛發(fā)、進(jìn)食及精神情況,有無弓背、翹毛、腹瀉等表現(xiàn),定期稱量體重,記錄每只小鼠的存活時(shí)間并計(jì)算存活率，存活時(shí)間超過

17、60天者為長期存活。    外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)及形態(tài)學(xué)檢查 取尾血,白細(xì)胞稀釋液稀釋,常規(guī)計(jì)數(shù)白細(xì)胞,鏡下觀察白細(xì)胞形態(tài)并分類。    病理學(xué)檢查 解剖死亡受鼠,大體觀察臟器的形態(tài)，然后取肝、脾、肺、小腸和足底皮膚等組織標(biāo)本，用10 %的甲醛固定,常規(guī)包埋、切片、HE 染色后鏡下觀察形態(tài)變化，判斷白血病和GVHD情況。    異基因嵌合體 用RT?PCR測定，于移植后第21、60、90天分別經(jīng)內(nèi)眥靜脈取各組小鼠外周血250 l，EDTA抗凝后，F(xiàn)icoll分離淋巴細(xì)胞后再提取R

18、NA，然后經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。再行PCR擴(kuò)增： SRY基因引物用DNAStar軟件設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程公司合成，上游引物序列為5ATTTATGGT GTGGTCCCGTGGTGA3，下游引物序列為5ATG TGATGGCATGTGGGTTCCTGT3，擴(kuò)增產(chǎn)物為305 bp；以GAPDH為內(nèi)參照，上游序列為5GGTGTG AACGGATTTGGCCGTATT3，下游序列為5GAG CCCTTCCACAATGCCAAAGTT3，擴(kuò)增產(chǎn)物為504 bp。PCR反應(yīng)體系：10×PCR緩沖液5 l，25 mmol/L MgCl2 5 l，dNTPs 1 l，25 molL上游及下游引物各

19、0.5 l，DNA模板2 l，TaqDNA聚合酶0.5 U（大連寶生物公司提供），用滅菌雙蒸水補(bǔ)足至50 l。擴(kuò)增條件：94預(yù)變性2分鐘，94變性30秒，60退火30秒，72延伸1分鐘，循環(huán)35次，72再延伸7分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物在含0.5 mmolL溴化乙錠的1瓊脂糖凝膠中以4-5 V/cm電壓降電泳30-45分鐘，于Image Master VDS凝膠掃描儀上成像。用Total lab V2.01凝膠圖像分析軟件進(jìn)行定量分析。    死亡原因判別標(biāo)準(zhǔn)    白血病死亡 接種白血病細(xì)胞后肝脾明顯腫大、腹水、外周血白細(xì)胞

20、升高,涂片見大量細(xì)胞,病理學(xué)見肝、脾、肺等組織中大量P388D1細(xì)胞浸潤。    GVHD 在移植后2 周左右出現(xiàn)弓背、翹毛、腹瀉、體重減輕、精神萎靡等表現(xiàn),參照文獻(xiàn)1判別有無GVHD 病理學(xué)改變。    出血、感染死亡 在本實(shí)驗(yàn)中除白血病死亡及GVHD死亡外,在移植前后出現(xiàn)的造血抑制所致感染、出血等原因引起的死亡。    統(tǒng)計(jì)學(xué)處理    采用SPSS 11.O專業(yè)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±SD表示，進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn)。

21、60;   結(jié)    果    生存時(shí)間    各組生存時(shí)間見附表。由附表可見，C組與D組和E組與F組生存時(shí)間，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理差異無顯著性(P>0. 05) ； E組和F組與其他組比較，生存時(shí)間經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理有顯著性差異（P 均<0. 01）。A 組最大生存時(shí)間明顯短于其他組；A組、B 組、C 組和D組小鼠均在30天內(nèi)死亡，E組和F組小鼠生存時(shí)間則明顯延長。    體重變化情況  

22、;  A組：出現(xiàn)腹水，體重增加，很快死亡。B組：在脾淋巴細(xì)胞輸注后1周左右體重開始減輕，直至死亡。C組和D組：在大劑量TBI和CY后3-5天左右體重開始減輕，直至死亡。E組和F組：在用同基因骨髓解救后2-3周體重減輕，至第6周開始體重穩(wěn)步增加，生存期超過210天。    GVHD的發(fā)生    B組的小鼠均出現(xiàn)不同程度的弓背體位、翹毛、體重下降、消瘦、精神萎靡、腹瀉等表現(xiàn)，死于嚴(yán)重的GVHD。取肝脾行病理檢查，結(jié)果符合GVHD表現(xiàn)。肝臟：肝細(xì)胞空泡樣變，匯管區(qū)內(nèi)有大量淋巴細(xì)胞浸潤，可見灶狀出血。脾

23、臟：體積萎縮，巢狀結(jié)構(gòu)破壞，可見大量散在浸潤的淋巴細(xì)胞、出血壞死灶及含鐵血黃素的沉積；C組和D組生存時(shí)間短，無GVHD的發(fā)生。E組和F組小鼠目前仍存活，無GVHD的發(fā)生，生存時(shí)間超過230天。    移植相關(guān)并發(fā)癥和相關(guān)死亡    A 組小鼠100 %在8天死于白血病，B組小鼠均在4周內(nèi)死于嚴(yán)重的GVHD，C組和D組在3周內(nèi)死于造血抑制所致的感染、出血，而E 組及F組均無移植相關(guān)并發(fā)癥引起的死亡。    外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)及形態(tài)觀察    

24、;正常(BALB/c×C57BL/6)F1雌性受鼠（H?2d/b）WBC 為(9.25±1.75) ×109/L ,接種白血病細(xì)胞后發(fā)生白血病，WBC 高峰值達(dá)(156.6±32.35) ×109/L,涂片有大量P388D1細(xì)胞。A組小鼠在接種P388D1白血病細(xì)胞株后均于5-9天發(fā)病并很快死亡，其余組無白血病發(fā)病死亡。    嵌合狀態(tài)    E組和F組小鼠分別于移植后21天、60天、90天取外周血行RT?PCR檢查嵌合率。結(jié)果表明，E組小鼠在21天、60天、90天

25、的嵌合率分別為98.5、75、60%左右；F組小鼠在21天、60天、90天的嵌合率分別為98、73、55%左右（附圖）。E組和F組的小鼠在21天是為完全異基因嵌合,但隨移植后時(shí)間的推移異基因嵌合比例逐漸下降，在90天仍保持混合嵌合狀態(tài)。    討    論    同種異基因反應(yīng)性T細(xì)胞對外來異己的主要組織相容性復(fù)合體（）分子和結(jié)合肽產(chǎn)生直接的免疫應(yīng)答，是和同種異基因移植物排斥的原因。同種異基因反應(yīng)性T細(xì)胞介導(dǎo)了移植后的GVL或GVT效應(yīng)2。直接的同種異基因反應(yīng)性是自身限制性T

26、細(xì)胞交叉反應(yīng)識(shí)別的結(jié)果，并且逃脫了胸腺陽性選擇的限制3。我們的實(shí)驗(yàn)研究表明，有意使用不相匹配的供者淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)了恰當(dāng)?shù)?、快速的移植前GVL（pGVL）效應(yīng)，緊接著用大劑量CY或TBI在GVHD的早期階段選擇性地去除了同種異基因發(fā)應(yīng)的淋巴細(xì)胞，從而預(yù)防了GVHD的發(fā)生。當(dāng)前防治GVHD的方法主要是應(yīng)用霉酚酸酯（MMF）、環(huán)孢霉素A（CsA）、甲氨蝶呤（MTX）、環(huán)磷酰胺（CY）和皮質(zhì)醇激素等，然而GVHD仍然是成功進(jìn)行異基因造血干細(xì)胞移植的主要障礙。從上個(gè)世紀(jì)80年代開始，在惡性血液病和某些轉(zhuǎn)移性實(shí)體瘤中已經(jīng)觀察到了GVHD與GVL（或GVT）效應(yīng)呈正相關(guān)，同樣在一些非惡性血液病中也觀察到了有益

27、的抗宿主效應(yīng)4,5。    Gendelman等6報(bào)道了移植前選擇性地去除同種異基因反應(yīng)供者淋巴細(xì)胞可以減輕GVHD和促進(jìn)T細(xì)胞的免疫功能重建。我們的實(shí)驗(yàn)研究的主要目的是最大化GVL效應(yīng)，同時(shí)通過去除對于和TBI敏感的供者淋巴細(xì)胞的同種異基因反應(yīng)性，阻斷T細(xì)胞的同種異體活性、增殖性和一系列的炎癥因子的產(chǎn)生，防止了GVHD的發(fā)生。雖然一些通過靶向殺死供者T細(xì)胞和阻斷炎性細(xì)胞因子來預(yù)防和治療早期GVHD的方法目前仍處于臨床前和臨床試驗(yàn)階段，但是對于pGVL效應(yīng)的應(yīng)用研究卻尚未起步。我們的研究是基于pGVL效應(yīng)可以被用來去除對放化療耐藥的白血病細(xì)胞的假設(shè)，特別

28、是在微小殘留病變階段（MRD）。在臨床上，可以通過使用單倍相合的異基因T細(xì)胞或NK細(xì)胞增強(qiáng)供者淋巴細(xì)胞的同種異基因反應(yīng)潛能，從而獲得快速有效的GVL效應(yīng)。Nagler等7已經(jīng)證明了清髓性放化療耐藥的白血病細(xì)胞能在5天之內(nèi)被單倍相合性的異基因淋巴細(xì)胞清除。Solomon等8在老年患者的非清髓移植治療中通過抗CD?25免疫毒素體外選擇性去除同種異基因反應(yīng)供者淋巴細(xì)胞有效降低了GVHD的發(fā)生的嚴(yán)重程度，提高了存活率。Yung等9的最近的研究顯示，在DLI后的2周用CTX（200 mg/kg）可以去除同種異基因反應(yīng)性供者淋巴細(xì)胞來預(yù)防GVHD的發(fā)生。    應(yīng)用

29、異體移植物細(xì)胞清除白血病細(xì)胞和應(yīng)用同種異基因反應(yīng)淋巴細(xì)胞清除某些實(shí)體瘤細(xì)胞的方法都已經(jīng)得到了證明10。由于快速增殖的T細(xì)胞對CY和TBI敏感，而且CY和TBI在細(xì)胞分裂間期能夠阻斷淋巴細(xì)胞的分裂和影響復(fù)制的、非復(fù)制的淋巴細(xì)胞，所以應(yīng)用CY和TBI作為GVHD的防治手段，即在用完大劑量的CY和清髓性的TBI后，可再用同基因的造血干細(xì)胞來拯救是可行的。在我們的實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，用CY和TBI選擇性地去除異基因反應(yīng)供者淋巴細(xì)胞組的小鼠無白血病和GVHD的發(fā)生，生存期超過了210天，于移植后第21天出現(xiàn)完全供者嵌合(CDC)，然后嵌合率有下降，第90天時(shí)表現(xiàn)為混合嵌合體（MC）。而對照組的小鼠出現(xiàn)了明顯

30、的GVHD、白血病或其他的移植相關(guān)死亡，生存期短20-36天。大體而言，在臨床上，同種異基因的骨髓細(xì)胞在完全匹配的受者身上做拯救治療時(shí)是更有效的，由供者淋巴細(xì)胞（T、NK）誘導(dǎo)的GVL效應(yīng)能夠預(yù)期出現(xiàn)。而在不相匹配的造血干細(xì)胞移植中只有強(qiáng)制性去除T細(xì)胞或使用陽性選擇的CD34細(xì)胞或AC133細(xì)胞時(shí)才能避免GVHD的發(fā)生。在我們的實(shí)驗(yàn)研究中，選用同基因的而不是同種異基因的造血干細(xì)胞來做拯救性治療是因?yàn)橄朐u估由GVHD的接種物誘導(dǎo)的pGVL效應(yīng)，同時(shí)也避免了同種異基因造血干細(xì)胞自身拯救過程中誘導(dǎo)的GVL和GVHD的發(fā)生。    在誘導(dǎo)pGVL效應(yīng)前用亞致死性

31、TBI（4 Gy）的原因有三：第一，去除受者的淋巴細(xì)胞，為供者淋巴細(xì)胞提供適當(dāng)?shù)墓撬杩臻g，產(chǎn)生更為有效的GVL效應(yīng)，而TBI是創(chuàng)造骨髓空間最為有效的方法之一；第二，去除公認(rèn)的受者起源的veto淋巴細(xì)胞，下調(diào)供者起源的同種異基因反應(yīng)細(xì)胞的功能；第三，移植前的免疫抑制能導(dǎo)致供者GVL效應(yīng)細(xì)胞較好的植入，產(chǎn)生期望的GVL效應(yīng)，隨后通過去除同種異基因反應(yīng)的供者淋巴細(xì)胞來預(yù)防GVHD發(fā)生11。 【參考文獻(xiàn)】 1吳祖澤主編. 造血干細(xì)胞移植基礎(chǔ). 北京: 人民衛(wèi)生出版社,1988.235-2482Nguyen S, Dhedin N, Vernant JP, et al. NK?cell reconsti

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