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1、靶向遞送人顆粒溶素與小鼠單鏈IL(1)】 目的:構(gòu)建攜帶編碼人天然顆粒溶素(GLS)和小鼠單鏈IL12基因的真核共表達(dá)載體pZM03,并構(gòu)建可將其靶向遞送入巨噬細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)的重組恥垢分枝桿菌菌苗. 方法:將人GLS,小鼠單鏈IL12基因和分枝桿菌復(fù)制子OriM同時(shí)克隆進(jìn)多啟動(dòng)子真核共表達(dá)載體pBudCE4.1中,得到穿梭質(zhì)粒pZM03.以pZM03電轉(zhuǎn)化恥垢分枝桿菌mc2155,通過(guò)PCR方法檢測(cè)重組菌中攜帶的真核共表達(dá)質(zhì)粒;通過(guò)與小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7共孵育檢測(cè)重組菌的靶向性. 結(jié)果:成功得到了可靶向遞送GLS/IL12真核共表達(dá)質(zhì)粒pZM03進(jìn)入巨噬細(xì)胞的新型重組菌. 結(jié)論:利用
2、恥垢分枝桿菌作為減毒生物體載體向巨噬細(xì)胞中靶向遞送真核表達(dá)質(zhì)粒是可能的.【關(guān)鍵詞】 顆粒溶素;白細(xì)胞介素12;恥垢分枝桿菌;穿梭質(zhì)粒;巨噬細(xì)胞0引言結(jié)核病位居單一病原引起死亡的嚴(yán)重傳染病之首1. 在結(jié)核病的感染、發(fā)病與治療過(guò)程中,宿主本身的免疫素質(zhì)和免疫狀態(tài)是決定預(yù)后轉(zhuǎn)歸的重因素2. 其中巨噬細(xì)胞既是重的抗原呈遞細(xì)胞,也是參與形成潛伏感染的關(guān)鍵環(huán)節(jié). 本研究目的旨在構(gòu)建一種攜帶人天然顆粒溶素(granulysin,GLS)和小鼠單鏈IL12基因的真核共表達(dá)載體pZM03、并可將其靶向遞送入巨噬細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)的重組恥垢分枝桿菌治療性活疫苗. 為明確該重組疫苗的靶向遞送和目標(biāo)基因在巨噬細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄
3、和表達(dá)效果,我們首先在細(xì)胞水平上進(jìn)行了初步探索.1材料和方法1.1材料攜帶人GLS基因的質(zhì)粒pGLS738由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建;攜帶小鼠單鏈IL12基因的質(zhì)粒pSFGmIL12由Graham J.Liechke博士惠贈(zèng),其中p40,p35兩亞單位基因由一45 bp的Linker連接,其編碼產(chǎn)物的生物學(xué)活性已在活體內(nèi)證明;含有分枝桿菌復(fù)制子OriM的質(zhì)粒pMV261及恥垢分枝桿菌mc2155由Torin博士3惠贈(zèng);多啟動(dòng)子真核共表達(dá)載體pBudCE4.1購(gòu)自Invitrogen公司;質(zhì)粒pUC118購(gòu)自大連寶生物公司;質(zhì)粒pEGFPC1,E.coli Top10為本室保存;小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.
4、7購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)藥理學(xué)教研室. 質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、PCR產(chǎn)物及凝膠回收試劑盒均購(gòu)自上海華舜公司;小量組織/細(xì)胞總RNA抽提試劑盒、正常熔點(diǎn)瓊脂糖(NMA)、限制性核酸內(nèi)切酶、高保真ProbestTaq酶、T4 DNA連接酶、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Ver.3.0)、DNAMarker DL2000等均購(gòu)自大連寶生物公司;Lipofectamin 2000購(gòu)自Invitrogen公司;山羊抗人GLS抗體購(gòu)自基因公司;即用型免疫細(xì)胞化學(xué)試劑盒購(gòu)自武漢博士德公司;RPMI 1640培養(yǎng)液購(gòu)自Gibco公司;小牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品.1.2方法1.2.1pZM03質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)GenBank(登錄
5、號(hào):NM_006433)中人GLS的cDNA序列,設(shè)計(jì)引物P1,P2,分別含有BspEI,HindIII和BamHI酶切位點(diǎn). P1的序列為 5GCTCCGGAAAGCTTCATATGGGCCGTGACTACAGGACCT3; P2的序列為5TAGGATCCGTCGACGAGCTCTCACCTGAGGTCCTCACAGAT3,引物由大連寶生物公司合成. 由于表達(dá)產(chǎn)物定位于巨噬細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)表達(dá),因此在引物設(shè)計(jì)中去除了GLS的分泌肽序列. 根據(jù)小鼠IL12 p40,p35兩亞單位編碼基因的序列設(shè)計(jì)P3,P4引物,分別含有EcoRI,NotI和HindIII,KpnI酶切位點(diǎn). P3的序列為5GAAT
6、TCGCGGCCGCATATGGGTCCTCAGAAGCTAAC3; P4的序列為5GATAAGCTTGGTACCGGATCCTCAGGCGGAGCTCAGAT3. 引物由上海博亞生物公司合成. 根據(jù)pAL5000中OriM的編碼序列設(shè)計(jì)P5,P6引物,分別含有BamHI,NheI和NheI,HindIII酶切位點(diǎn). P5的序列為5GGATCCGCTAGCTAAAGCCAGGTGAGCCCACCAGCTC3; P6的序列為5GCGAAGCTTGCTAGCGCACTACAACGGAGTTCGCCACGT3.引物由上海博亞生物公司合成. pZM03質(zhì)粒的構(gòu)建路線見(jiàn)圖1.圖1pZM03真核共表達(dá)質(zhì)粒
7、的構(gòu)建程序1.2.2重組質(zhì)粒的細(xì)胞轉(zhuǎn)染及表達(dá)小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7以含100 mL/L小牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液,置24孔板內(nèi),以37, 50 mL/L CO2培養(yǎng),按轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)用重組pZM03質(zhì)粒和空質(zhì)粒pBudCE4.1分別轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞. 轉(zhuǎn)染48 h后分別收集實(shí)驗(yàn)孔及對(duì)照孔的細(xì)胞做:以RTPCR法對(duì)兩種目的基因的mRNA進(jìn)行檢測(cè):抽提細(xì)胞總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,以各自的cDNA為模板,分別以P1和P2, P3和P4為引物,作PCR擴(kuò)增;GLS表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè):取出培養(yǎng)孔內(nèi)細(xì)胞爬片進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè),具體方法按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行.1.2.3重組恥垢分枝桿菌菌苗的構(gòu)
8、建及其靶向性檢測(cè)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的mc2155菌株以預(yù)冷的100 mL/L甘油在4低溫洗滌3次4,取90 L感受態(tài)細(xì)菌加入10 L純化的pZM03質(zhì)粒,輕輕混勻,冰浴10 min,轉(zhuǎn)入預(yù)冷的1 mm電轉(zhuǎn)杯中,2500 V,4 ms電擊一次,迅速加入0.8 mL完全7H9培養(yǎng)基,37孵育3 h后涂布到含Zeocin 40 mg/L的7H10固體平板上,37孵育72 h后挑取陽(yáng)性菌落增菌后抽提質(zhì)粒,同時(shí)取1 mL菌液,離心棄上清,沉淀加入0.5 mL三蒸水,100熱裂解8 min,取上清2 L或質(zhì)粒抽提物1 L為模板,分別作GLS,IL12和OriM的PCR擴(kuò)增. 以鑒定正確的重組菌11011 cfu
9、/L感染培養(yǎng)的RAW264.7細(xì)胞,12 h后取出培養(yǎng)孔內(nèi)的細(xì)胞爬片進(jìn)行抗酸染色并觀察. 同時(shí)將鑒定正確的重組菌劃線傳代510代后再次以PCR法進(jìn)行鑒定,以觀察重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性.作者:伊正君,朱道銀,楊春,李俊明,何永林,陳全【關(guān)鍵詞】靶向comConstruction and identification of a Mycoba 本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的,論文版權(quán)屬原作者,請(qǐng)不用于商業(yè)用途或者抄襲,僅供參考學(xué)習(xí)之用,否者后果自負(fù),如果此文侵犯您的合法權(quán)益,請(qǐng)聯(lián)系我們。2結(jié)果2.1pZM03質(zhì)粒在小鼠RAW264.7細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)在轉(zhuǎn)染有pZM
10、03質(zhì)粒的RAW264.7細(xì)胞中同時(shí)擴(kuò)增出了編碼人GLS和小鼠單鏈IL12的cDNA片段(圖2). 圖中第1,4泳道分別為約267 bp的GLS片段和約1671 bp的IL12片段,與理論預(yù)計(jì)值圖2pZM03真核共表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞后轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的RTPCR結(jié)果完全相符. 用山羊抗人GLS抗體為一抗,生物素化的兔抗山羊抗體為二抗,對(duì)pZM03質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的小鼠RAW264.7細(xì)胞作免疫酶染色,發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)中有強(qiáng)陽(yáng)性染色顆粒(圖3).A:用pZM03質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的RAW264.7細(xì)胞;B: 用pBudCE4.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的陰性對(duì)照.圖3pZM03質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞48 h后顆粒溶素
11、的表達(dá)2502.2重組恥垢分枝桿菌菌苗的構(gòu)建及其靶向性檢測(cè)以重組菌裂解物或質(zhì)粒抽提物為模板,作GLS,IL12和OriM的PCR擴(kuò)增(圖4). 圖中第1,2和3泳道分別為約267 bp的GLS片段、約1671 bp的IL12片段和約1914 bp的分枝桿菌復(fù)制子OriM片段,與理圖4攜帶pZM03質(zhì)粒的重組恥垢分枝桿菌菌落PCR鑒定論預(yù)計(jì)值完全相符. 感染RAW264.7細(xì)胞后進(jìn)行抗酸染色觀察證明,重組菌具有良好的靶向遞送能力,能夠在目標(biāo)細(xì)胞中巨量富集,鏡下可見(jiàn)紅色的抗酸染色菌株在巨噬細(xì)胞胞質(zhì)中富集,巨噬細(xì)胞核呈藍(lán)色,在細(xì)胞間隙中只有極少量散在分枝桿菌的存在(圖5).圖5感染12 h后RAW2
12、64.7細(xì)胞中重組分枝桿菌的富集10003討論細(xì)胞免疫是宿主抗結(jié)核感染的主保護(hù)機(jī)制,活動(dòng)性結(jié)核病患者全身整體免疫狀態(tài)傾向于Th2型5-6. IL12是一種功能強(qiáng)大的Th1型免疫反應(yīng)誘導(dǎo)劑,外源給予IL12可產(chǎn)生Th2免疫狀態(tài)向Th1型免疫狀態(tài)的逆轉(zhuǎn). 在一個(gè)已建立Th2型免疫反應(yīng)的感染動(dòng)物中,外源給予IL12仍能誘導(dǎo)出一個(gè)獨(dú)立的與新免疫原相關(guān)的Th1型免疫反應(yīng),Pollock等7發(fā)現(xiàn)能夠促進(jìn)Th2反應(yīng)和強(qiáng)烈IgE反應(yīng)的CPB2.8抗原當(dāng)與IL12共同免疫小鼠時(shí),依舊能夠引發(fā)出Th1型反應(yīng)并與一定程度上的保護(hù)作用有關(guān). 將共表達(dá)小鼠單鏈IL12與分枝桿菌保護(hù)性抗原Ag85B的真核質(zhì)粒免疫小鼠,通
13、過(guò)細(xì)胞因子本身的生物學(xué)活性及其佐劑作用可以優(yōu)化宿主抗結(jié)核的特異性免疫反應(yīng),誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更加有效的免疫保護(hù)作用8. 同時(shí)IL12對(duì)維持一定數(shù)量的Th1記憶細(xì)胞也是必需的9,但I(xiàn)L12只能通過(guò)刺激免疫系統(tǒng)間接發(fā)揮治療作用,不能對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)的Mtb產(chǎn)生直接的殺傷作用.研究發(fā)現(xiàn)短尾猿用BCG第二次接種免疫后可激發(fā)2到9倍于初免時(shí)的V2V2 T細(xì)胞擴(kuò)增,這是由于激活了初免時(shí)的記憶性T細(xì)胞,產(chǎn)生的回憶性反應(yīng)引起的,并且這種擴(kuò)增可持續(xù)7 mo之久,其擴(kuò)增強(qiáng)度與保護(hù)短尾猿免受致死性Mtb攻擊有正相關(guān)10;另有學(xué)者利用來(lái)自PPD反應(yīng)陽(yáng)性健康者的外周血單個(gè)核細(xì)胞,研究了受抗原刺激后擴(kuò)增的T細(xì)胞抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)分枝桿
14、菌生長(zhǎng)的作用,發(fā)現(xiàn)BCG活菌苗和Mtb全細(xì)菌裂解液刺激的記憶性T細(xì)胞能顯著抑制分枝桿菌的胞內(nèi)生長(zhǎng),而休眠T細(xì)胞缺乏此抑制能力,這表明休眠T細(xì)胞需特定的抗原刺激來(lái)激活.恥垢分枝桿菌是人體的正常菌群,使用重組恥垢分枝桿菌菌苗,一方面可作為新型減毒有機(jī)體載體向巨噬細(xì)胞靶向遞送GLS/IL12真核共表達(dá)質(zhì)粒,另一方面還可對(duì)已經(jīng)感染結(jié)核桿菌的機(jī)體進(jìn)行二次免疫激發(fā),以對(duì)結(jié)核病進(jìn)行交叉基因治療和免疫治療(同時(shí)還可以結(jié)合藥物治療)的綜合治療. 其原理是利用恥垢分枝桿菌菌體抗原與IL12共同作用于結(jié)核感染的機(jī)體后,通過(guò)分枝桿菌屬共同抗原促進(jìn)并激發(fā)宿主針對(duì)結(jié)核桿菌的特異性細(xì)胞免疫,糾正機(jī)體的免疫狀態(tài),間接清除體內(nèi)
15、的結(jié)核桿菌;與此同時(shí)恥垢分枝桿菌還可以作為基因治療的減毒生物體載體,將含有激活的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞分泌的GLS基因的真核共表達(dá)質(zhì)粒pZM03靶向?qū)刖奘杉?xì)胞中表達(dá),通過(guò)GLS與傳統(tǒng)藥物完全不同的機(jī)制直接殺滅胞內(nèi)潛伏的結(jié)核桿菌,從而阻斷結(jié)核桿菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的潛伏.我們將編碼人GLS的DNA片段和小鼠單鏈IL12基因、分枝桿菌復(fù)制子OriM同時(shí)克隆入pBudCE4.1后,構(gòu)建了可在分枝桿菌中復(fù)制,同時(shí)又可以在真核細(xì)胞中進(jìn)行共表達(dá)的穿梭質(zhì)粒pZM03,并轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7,在體外從細(xì)胞水平同時(shí)檢測(cè)到了兩種基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)產(chǎn)物,一方面表明在小鼠來(lái)源的巨噬細(xì)胞中同時(shí)獲得此兩種功能基因的表
16、達(dá)是可能的,另一方面也證明利用分枝桿菌作為生物體載體靶向遞送治療性基因是可能的. 這為后續(xù)在活體動(dòng)物模型中應(yīng)用該方法研究GLS,IL12及恥垢分枝桿菌的協(xié)同細(xì)胞免疫作用機(jī)制和免疫治療作用奠定了基礎(chǔ).【參考文獻(xiàn)】1 Bryk R, Lima CD, ErdjumentBromage H, et al. Metabolic enzymes of mycobacteria linked to antioxidant defense by a thioredoxinlike protein J. Science, 2002,295(5557):1073-1077.2 Ottenhoff TH, Ver
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