高糖刺激腎小球系膜細(xì)胞Bcl-2、Smac、Fas的表達(dá)研究

1、高糖刺激腎小球系膜細(xì)胞Bcl-2、Smac、Fas的表達(dá)研究         10-02-03 13:40:00     作者：陶俊，陳曉嵐    編輯：studa20【摘要】  目的:研究高糖刺激腎小球系膜細(xì)胞后，凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Smac、Fas的表達(dá)情況。方法: 將體外培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞分為正常對(duì)照組（糖濃度為5.6 mmol/L）和高糖組（糖濃度為30 mmol/L），采用四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）比色法檢測(cè)

2、不同作用時(shí)間（12 h、24 h、36 h、48 h）下，系膜細(xì)胞的增殖狀況，且在各時(shí)間點(diǎn)，采用免疫熒光染色法觀察Bcl-2、Smac、Fas的表達(dá)情況并測(cè)定其熒光強(qiáng)度。結(jié)果：MTT比色法檢測(cè)結(jié)果顯示高糖組較對(duì)照組系膜細(xì)胞增殖明顯，與作用時(shí)間呈正相關(guān)。同時(shí)，免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示高糖組Bcl-2在以上不同時(shí)間作用下，與對(duì)照組相比，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)（P<0.05），且高糖組隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)，強(qiáng)度也相應(yīng)增強(qiáng)，24 h、36 h、48 h各時(shí)間點(diǎn)的熒光強(qiáng)度與12 h相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。而Smac、Fas的熒光強(qiáng)度與對(duì)照組相比則減弱（P<0.05），且隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)，

3、強(qiáng)度也逐漸減弱，24 h、36 h、48 h各時(shí)間點(diǎn)與12 h相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Bcl-2的熒光強(qiáng)度與Smac或Fas的熒光強(qiáng)度之間存在明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系（P<0.05）。Smac的熒光強(qiáng)度與Fas的熒光強(qiáng)度之間存在明顯的正相關(guān)關(guān)系（P<0.05）。結(jié)論：高糖刺激系膜細(xì)胞后，細(xì)胞增殖明顯， Bcl-2的表達(dá)增加，Smac、Fas的表達(dá)下降，呈時(shí)間依賴性。 【關(guān)鍵詞】  腎小球系膜細(xì)胞 高糖 Bcl-2 Smac Fas Abstract   Objective: To investigate the expressi

4、on of apoptosis gene associated with Bcl-2, Smac, Fas in glomeruli mesaginal (Mcs) cells under high concentration glucose. Methods: Mcs cells were divided into two groups: control group(with normal concentration glucose, 5.6 mmol/L), high glucose group(with high concentration glucose, 30 mmol/L). Us

5、ing MTT assay, the proliferation of Mcs after 12 h、24 h、36 h、48 h was examined respectively. The expression of Bcl-2、Smac、Fas in Mcs cells was observed by fluorescence microscope at each time point mentioned above and the fluorescent intensity was calculated by image analysis system. Results: The pr

6、oliferation of Mcs cells under high concentration glucose was more obvious, compared with controls（P<0.05), and was found in a time-dependent manner. At these time points, the fluorescent intensity of Bcl-2 in high concentration glucose was stronger than controls（P<0.05). But the fluorescent i

7、ntensity of Smac, Fas was weaker（P<0.05). And the effects were in time-dependent manners. In Mcs cells under high concentration glucose, the effects of 24 h, 36 h, 48 h were more obvious than that of 12 h. The correlation between the fluorescent intensity of Bcl-2 and the fluorescent intensity of

8、 Smac or Fas  was negative（P<0.05) The correlation between the fluorescent intensity of Smac and the fluorescent intensity of Fas was positive（P<0.05). Conclusion: High concentration glucose can promote the proliferation of Mcs. In Mcs cells under high concentration glucose , the expressi

9、on of Bcl-2 increases, while the expression of Smac and Fas decreases, compared with controls.Key words   Glomeruli mesaginal cell; High concentration glucose; Bcl-2; Smac; Fas增生性腎小球腎炎的早期病變表現(xiàn)為球內(nèi)細(xì)胞數(shù)量和（或）細(xì)胞外基質(zhì)的異常增多，隨著病變發(fā)展呈球內(nèi)硬化，甚至全球硬化，并引起嚴(yán)重的腎功能障礙。腎小球細(xì)胞的異常增殖尤其是系膜細(xì)胞的異常增殖是腎小球炎癥的基本病變，是導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)異常堆積

10、和腎小球硬化的一個(gè)共同途徑。因而遏制球內(nèi)細(xì)胞和基質(zhì)的異常增多，是有效防治腎小球硬化的關(guān)鍵。以往研究多集中在增殖方面，隨著凋亡研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)維持細(xì)胞數(shù)目穩(wěn)定需要增殖與凋亡兩者作用的平衡。細(xì)胞凋亡參與了腎臟正常發(fā)育和腎臟病發(fā)生等多個(gè)過(guò)程。細(xì)胞凋亡受多種因素調(diào)控，在自身免疫性疾病及其腎臟損害的發(fā)病過(guò)程中，凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Fas備受關(guān)注，近年來(lái)對(duì)新發(fā)現(xiàn)的一種促凋亡基因Smac研究也逐漸升溫。Smac通過(guò)誘導(dǎo)procaspase-3的活性及增加成熟Caspase-3的酶活性促進(jìn)凋亡，這兩種功能均依賴于IAPs與Smac的相互作用。目前國(guó)內(nèi)對(duì)凋亡基因Bcl-2，F(xiàn)as研究較多，Smac研究尚

11、不多見(jiàn)，尤其是Smac與Fas及Bcl-2的關(guān)系國(guó)內(nèi)外報(bào)道少見(jiàn)。我們通過(guò)高糖刺激腎小球系膜細(xì)胞增殖，同時(shí)觀察凋亡基因Bcl-2、Smac、Fas表達(dá)的變化，以探討高糖刺激對(duì)系膜細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其機(jī)制，進(jìn)一步了解糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制，從而為糖尿病腎病的防治提供理論依據(jù)，對(duì)預(yù)防其發(fā)生，延緩其進(jìn)展，具有重要的理論和實(shí)踐意義。1   材料與方法1.1   材料   （1）細(xì)胞：腎小球系膜細(xì)胞購(gòu)自上海第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院腎內(nèi)科腎臟病實(shí)驗(yàn)室，是大鼠系膜細(xì)胞系；（2）試劑：DMEM粉劑購(gòu)于GIBCO公司，胎牛血清購(gòu)于杭州四季青生物工程材料

12、有限公司，胰蛋白酶和四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）購(gòu)于AMRESCO公司，二甲亞砜（DMSO）購(gòu)于上海實(shí)生公司?？贵w：兔抗大鼠Bcl-2、兔抗大鼠Fas和熒光素標(biāo)記羊抗兔IgG購(gòu)于北京博奧森，羊抗大鼠Smac(C-20) 和熒光素標(biāo)記驢抗羊IgG購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司。1.2   方法1.2.1   MTT法測(cè)定系膜細(xì)胞增殖狀況   將鋪滿培養(yǎng)瓶底的310代系膜細(xì)胞胰酶消化，用吸管充分吹打成單細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。用含10%FCS的DMEM培養(yǎng)液，調(diào)細(xì)胞密度為1×104個(gè)/ml。取細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔20

13、0 L。待培養(yǎng)至60%70%的融合度時(shí)，改用含2%FCS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，于不同時(shí)間點(diǎn)換成含10%FCS的培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)組換高糖培養(yǎng)液，對(duì)照組換低糖培養(yǎng)液，每孔200 l，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，用MTT法測(cè)定A570吸光度。1.2.2   免疫熒光法觀察系膜細(xì)胞Bcl-2、Smac、Fas的表達(dá)情況并測(cè)定其熒光強(qiáng)度   對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的系膜細(xì)胞胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，接種于24孔培養(yǎng)板，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到60%70%融合后，換含2%胎牛血清的培養(yǎng)液同步化。于不同的時(shí)間點(diǎn)，對(duì)照組（低糖組）和實(shí)驗(yàn)組（高糖組）加入相應(yīng)的培養(yǎng)液，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。對(duì)細(xì)胞染色，檢測(cè)熒光強(qiáng)度。1.

14、2.3   統(tǒng)計(jì)學(xué)方法   運(yùn)用Stata 7.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。計(jì)量資料以x±s表示，用方差分析，兩兩比較用q檢驗(yàn)，兩變量關(guān)系用直線相關(guān)與回歸分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)均取=0.05。     10-02-03 13:40:00     作者：陶俊，陳曉嵐    編輯：studa202   結(jié)      果2.1   高糖刺激

15、下，腎小球系膜細(xì)胞持續(xù)增殖   為了觀察高糖對(duì)腎小球系膜細(xì)胞增殖情況的影響，把腎小球系膜細(xì)胞分別培養(yǎng)在葡萄糖濃度為30 mmol/L（高糖組）和5.6 mmol/L（對(duì)照組）的培養(yǎng)基中。用MTT法檢測(cè)系膜細(xì)胞增殖狀況，高糖組與對(duì)照組相比，細(xì)胞明顯增殖（P<0.05），見(jiàn)表1。高糖組隨刺激時(shí)間延長(zhǎng)，增殖作用也更明顯。2.2   高糖刺激下，腎小球系膜細(xì)胞Bcl-2、Smac、Fas蛋白的表達(dá)   高糖刺激下，系膜細(xì)胞持續(xù)增殖，是否由于凋亡被抑制，是否與某些調(diào)亡基因有關(guān)？為了解決這個(gè)問(wèn)題，我們采用了免疫熒光法觀察高糖培養(yǎng)后系膜細(xì)胞的

16、凋亡相關(guān)基因（Bcl-2、Smac、Fas）表達(dá)變化。高糖培養(yǎng)系膜細(xì)胞12 h，24 h，36 h，48 h后，胞漿所顯示的Bcl-2綠色熒光較低糖(對(duì)照)組明顯增強(qiáng)（圖1），且隨時(shí)間延長(zhǎng)作用越明顯。低糖組12 h，24 h，36 h，48 h的綠色熒光強(qiáng)度之間沒(méi)有明顯改變。高糖同樣作用于系膜細(xì)胞后，胞漿所顯示的Smac綠色熒光較低糖（對(duì)照）組明顯減弱，低糖組各時(shí)間點(diǎn)間的熒光強(qiáng)度沒(méi)有明顯改變,而高糖組隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光強(qiáng)度逐漸減弱（圖2）。同樣處理后，胞漿所顯示的Fas綠色熒光較低糖（對(duì)照）組明顯減弱，低糖組各時(shí)間點(diǎn)的熒光強(qiáng)度之間沒(méi)有明顯改變，而高糖組隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光強(qiáng)度逐漸減弱（圖3）

17、。為了對(duì)Bcl-2、Smac、Fas蛋白表達(dá)變化進(jìn)行定量分析，觀察各組間表達(dá)是否有差異，我們使用圖像分析系統(tǒng)來(lái)測(cè)定熒光強(qiáng)度，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2，Bcl-2在不同作用時(shí)間（12 h、24 h、36 h、48 h）下，與對(duì)照組相比，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)（P<0.05），且隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)，強(qiáng)度也相應(yīng)增強(qiáng)，高糖組在24 h，36 h，48 h，與12 h相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。而Smac、Fas的熒光強(qiáng)度與對(duì)照組相比則減弱（P<0.05），且隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)，強(qiáng)度也逐漸減弱，高糖組在24 h，36 h，48 h，與12 h相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。糖刺激系膜細(xì)

18、胞各時(shí)間段Bcl-2、Smac、Fas表達(dá)的相關(guān)與回歸分析結(jié)果顯示，Bcl-2的熒光強(qiáng)度與Smac的熒光強(qiáng)度之間存在明顯負(fù)相關(guān)（r=-0.9969，P<0.05），回歸方程是Y=264.9157-0.9399515x。Bcl-2的熒光強(qiáng)度與Fas的熒光強(qiáng)度之間存在明顯負(fù)相關(guān)（r=-0.9986，P<0.05），回歸方程是Y=282.9206-0.9897176x。Smac的熒光強(qiáng)度與Fas的熒光強(qiáng)度之間存在明顯正相關(guān)（r=0.9994，P<0.05），回歸方程是Y=4.183698+1.050507x。3   討   

19、0;  論Gosio2研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖濃度從1 gL至4.5 gL對(duì)系膜細(xì)胞生長(zhǎng)具有雙重作用，培養(yǎng)2448 h可刺激細(xì)胞增生，而培養(yǎng)7296 h則抑制細(xì)胞增生。我們的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn)，高糖刺激系膜細(xì)胞12 h、24 h、36 h、48 h后，系膜細(xì)胞明顯增殖，隨時(shí)間作用的延長(zhǎng)，增殖越明顯。我們的研究表明：高糖組Smac的熒光強(qiáng)度明顯減弱，隨時(shí)間延長(zhǎng)，作用更明顯。這提示高糖狀態(tài)改變了凋亡基因Smac的表達(dá)，使Smac的表達(dá)下調(diào)，抑制了細(xì)胞的凋亡。近年又有研究表明Bcl-2家族通過(guò)減低或增加線粒體膜的通透性而調(diào)節(jié)促凋亡因子的釋放，高表達(dá)Bcl-2不僅抑制細(xì)胞色素c氧化酶從線粒體的釋放，

20、同時(shí)抑制Smac的釋放4-6。我們研究也發(fā)現(xiàn)，高糖刺激系膜細(xì)胞12 h、24 h、36 h、48 h后凋亡基因Smac的平均熒光強(qiáng)度逐漸減弱，而B(niǎo)cl-2的平均熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，Smac的表達(dá)和Bcl-2的表達(dá)之間存在著負(fù)相關(guān)的關(guān)系，可能和上述機(jī)制有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)研究表明，高糖組Fas的熒光強(qiáng)度明顯減弱，也呈時(shí)間依賴性。提示高糖刺激后腎小球系膜細(xì)胞增生也可能部分是由于Fas的低表達(dá)阻止了Mcs的死亡所致。近來(lái)也有文獻(xiàn)報(bào)道Bcl-2通過(guò)激活磷脂酶A2抑制Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程3。而我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，F(xiàn)as的表達(dá)與Bcl-2的表達(dá)之間存在著負(fù)相關(guān)的關(guān)系，其機(jī)制可能與此有關(guān)。已有研究表明，糖尿病腎病

21、早期以腎臟體積增大和細(xì)胞增生為特征。并且近來(lái)有報(bào)道細(xì)胞凋亡可能參與了糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制7。根據(jù)本研究的結(jié)果，我們可以推斷：高糖刺激的腎小球系膜細(xì)胞增生可能部分是由于Bcl-2的表達(dá)上升，Smac、Fas的表達(dá)下降而引起的細(xì)胞凋亡抑制。提示糖尿病腎病早期細(xì)胞異常增殖，凋亡被抑制，致使機(jī)體不能及時(shí)清除增殖細(xì)胞，而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)異常堆積，最后發(fā)展為晚期的腎小球硬化。因此，可以嘗試通過(guò)增加或降低某些特定的細(xì)胞對(duì)凋亡的敏感性來(lái)尋找干預(yù)糖尿病腎病早期進(jìn)展的新方法和藥物；同時(shí)凋亡受一系列相關(guān)基因如Bcl-2、Smac、Fas的調(diào)控，可以通過(guò)調(diào)控其表達(dá)強(qiáng)度來(lái)誘導(dǎo)或抑制細(xì)胞凋亡，這有可能成為防治糖尿病腎病的又一新途徑?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 Morris MC, Heitz A, Mery J, et al. An essential phosphorylation-site domain of fuman cdc25C interacts with both 14-3-3 and cyclinsJ. J Biol Chem, 2000, 275(37): 288