重癥肌無(wú)力患者外周血T、B淋巴細(xì)胞Bcl-2的表達(dá)

1、    重癥肌無(wú)力患者外周血T、B淋巴細(xì)胞Bcl-2的表達(dá)        摘要: 目的探討重癥肌無(wú)力(MG)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)及其臨床意義。方法以流式細(xì)胞儀雙標(biāo)記免疫熒光方法測(cè)定47例臨床確診的MG患者外周血T、B淋巴細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)和CD3+T細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度(MFI)。結(jié)果(1)MG組外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞和CD19+細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P0.01)，CD3+T細(xì)胞蛋白表達(dá)Bcl-2的M

2、FI(0.572±0.177)亦明顯高于對(duì)照組(0.170±0.147)(P0.01)。(2)MG組外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞及CD19+細(xì)胞的Bcl-2蛋白表達(dá)與年齡無(wú)明顯相關(guān)，而與臨床嚴(yán)重程度絕對(duì)評(píng)分密切相關(guān)(r=0.63、0.65、0.61、0.78，P0.05)。CD3+T細(xì)胞蛋白表達(dá)的MFI與MG患者病程相關(guān)密切(r=0.62，P0.01)。(3)免疫抑制治療后MG組臨床嚴(yán)重程度絕對(duì)評(píng)分與淋巴細(xì)胞亞群Bcl-2蛋白表達(dá)、CD3+T細(xì)胞蛋白表達(dá)的MFI同步地較治療前有明顯下降(P0.01)。結(jié)論外周血淋巴細(xì)胞Bcl-2蛋白異常表達(dá)對(duì)MG發(fā)病及臨床癥

3、狀有重要作用。關(guān)鍵詞: 重癥肌無(wú)力; 細(xì)胞凋亡; Bcl-2中分類(lèi)號(hào)： R746.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A文章編號(hào)： 1006-2963 (2000)04-230-05Expression of Bcl-2 of Peripheral T, B Lymphocytes in Patients with Myasthenia GravisZHANG Xu,XIA Jun-hui,SUN Cheng-chao,YE Hao-hao(Department of Neurology, First Affiliated Hospital, Wenzhou Medical College, Wenzhou 32

4、5000，China)ABSTRACT: ObjectiveTo investigate Bcl-2 expression in the peripheral blood mononuclear cells and its clinical significance of myasthenia gravis (MG). MethodsBcl-2 protein levels in T,B cells of 47 patients with MG was detected by two colourcytofluorography. ResultsCompared with MG patient

5、s and normal controls, T cells (including CD3+, CD4+ and CD8+ subgroups) and CD19+ B cells expressed Bcl-2 protein were increased significantly in MG patients (P0.01). Mean fluorescence intensity (MFI) of Bcl-2 protein on CD3+ T cells in MG patients (0.572±0.177) were higher than that in normal

6、 controls (0.170±0.147)(P0.01). There were positive correlation between Bcl-2 protein levels in T, B cell and clinical severity of MG patients, which weren?t related to age. MFI of Bcl-2 protein on CD3+ T cells were positively related to the course of the MG disease (r=0.62, P0.01). After treat

7、ment with immunosuppressive agents the disease showed improvement, the Bcl-2 protein levels in T, B cells and MFI Bcl-2 protein on CD3+ T cells came down simultaneously. ConclusionAbnormal expression of Bcl-2 in T, B cells might play an important role in the MG patients.Key words： myasthenia gravis;

8、 apotosis; Bcl-2Bcl-2基因(B cell lymphma/leukemia-2 gene)是人們?cè)谘芯緽細(xì)胞淋巴瘤中發(fā)現(xiàn)的一種異常表達(dá)的原癌基因，位于第18號(hào)染色體長(zhǎng)臂21.3(18q21.3)1。近年發(fā)現(xiàn)，Bcl-2為一種細(xì)胞凋亡抑制基因。Bcl-2轉(zhuǎn)基因鼠自身反應(yīng)性B細(xì)胞克隆消除功能抑制，B細(xì)胞記憶和生存期均延長(zhǎng)，可產(chǎn)生許多自身抗體，故有自身免疫基因之稱(chēng)2。我們檢測(cè)了重癥肌無(wú)力(MG)患者外周血淋巴細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)水平，并探討其臨床意義。1對(duì)象和方法1.1觀察對(duì)象觀察組選擇門(mén)診或住院治療的MG患者47例(男17例，女30例)，年齡2152(36.6±8.

9、1)歲。病程418月，平均(9.5±4.2)月。所有患者均有典型的臨床表現(xiàn)，并經(jīng)新斯的明試驗(yàn)、肌電低頻重復(fù)電刺激和AChRAb檢測(cè)確診。47例患者經(jīng)CT或MRI掃描證實(shí)有胸腺增生或胸腺瘤者27例。按改良Osserman分型，其中型6例，a型 17例，b型19例，型5例。除3例已用強(qiáng)的松外，其余均未使用過(guò)免疫抑制劑。本組以免疫抑制劑(強(qiáng)的松、雷公藤多甙)治療，有胸腺異常者均行胸腺摘除術(shù)。治療前后用統(tǒng)一方法進(jìn)行臨床評(píng)估3，并行外周血淋巴細(xì)胞Bcl-2表達(dá)蛋白檢測(cè)。正常對(duì)照組系健康的自愿獻(xiàn)血者，共35例(男14例，女21例)，年齡1861(38.4±9.0)歲。1.2方法采用分層

10、液密度梯度離心獲取PBMC，用PBS將細(xì)胞濃度調(diào)至5×106個(gè)/mL，取4 mL均分于4支玻璃管中，各加等量的10 g/L多聚甲醛固定液，4 過(guò)夜后離心棄上清，以含1 g/L Triton X-100的PBS輕洗5 min，離心棄上清，每管分別加入FITC標(biāo)記的鼠抗人CD3+、CD4+、CD8+和CD19+單抗(immunotech)10 L，再加入兔抗人Bcl-2單抗(Dako)5 L，混合后于4 60 min，PBS洗2次，所有管都加入若丹明標(biāo)記的單抗兔IgG(Immunotech)5 L，混合后4 60 min，以流式細(xì)胞儀(FACSC, USA)分析每管樣品中10 000個(gè)細(xì)

11、胞，得出表達(dá)Bcl-2蛋白陽(yáng)性的百分率，并檢測(cè)CD3+T細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity，MFI)4，5。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析軟件包SAS6.04在微機(jī)上進(jìn)行分析處理，采用配對(duì)t、t或t檢驗(yàn)和Spearman相關(guān)分析。2結(jié)果2.1MG組與對(duì)照組外周血淋巴細(xì)胞亞群Bcl-2蛋白表達(dá)比較見(jiàn)表1。表1MG組與正常對(duì)照組外周血淋巴細(xì)胞亞群Bcl-2蛋白表達(dá)比較Table 1Comparison of Bcl-2 protein expression of peripheral blood lymphocyte subgro

12、upsin MG patients and normal subjects(%，±s)Control(n=35)MG(n=47)tPCD3+9.89±5.1361.30±17.7818.800.01CD4+8.86±5.7464.05±16.5621.220.01CD8+15.23±12.0459.13±17.4313.480.01CD19+43.06±15.3177.21±14.3110.370.01表1顯示，MG組CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞亞群和CD19+細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照

13、組，差異有顯著性意義(P0.01)。此外，外周血CD3+T細(xì)胞蛋白表達(dá)Bcl-2的MFI(0.572±0.177)亦明顯高于對(duì)照組(0.170±0.147)(P0.01)。2.2MG患者臨床嚴(yán)重程度絕對(duì)評(píng)分與淋巴細(xì)胞亞群Bcl-2蛋白表達(dá)的關(guān)系見(jiàn)表2。 表2年齡、病程、臨床嚴(yán)重程度評(píng)分與外周血淋巴細(xì)胞亞群Bcl-2蛋白表達(dá)相關(guān)性分析Table 2Analysis of correlation of age, course, clinical severity and bcl-2 protein expression of peripheral bloodlymphocyte

14、 subgroups in MG patientsAgeCourseClinical severityCD3+-0.050.460.63*CD4+-0.070.080.65*CD8+-0.28-0.010.61*CD19+-0.210.080.78* P0.01(spearman correlation) CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞亞群及CD19+細(xì)胞的Bcl-2蛋白表達(dá)與MG患者年齡、病程無(wú)明顯相關(guān)，而與臨床嚴(yán)重程度絕對(duì)評(píng)分密切相關(guān)。CD3+T細(xì)胞蛋白表達(dá)的MFI與病程相關(guān)密切(r=0.62，P0.01)，而與抗乙酰膽堿受體抗體(AChRAb)水平無(wú)相關(guān)關(guān)系(r=0.16, P0

15、.05)。2.3免疫抑制治療對(duì)MG患者淋巴細(xì)胞亞群Bcl-2蛋白表達(dá)的影響見(jiàn)表3。表3免疫抑制治療對(duì)MG患者淋巴細(xì)胞亞群Bcl-2蛋白表達(dá)的影響Table 3Effect of immunosuppress agents on Bcl-2 protein expression of peripheral bloodlymphocyte subgroups in MG patients(%，±s)Before treatmentAfter treatmenttPCD3+61.30±17.7825.55±11.5512.110.01CD4+64.05±16.

16、5626.05±10.6314.580.01CD8+59.13±17.4329.17±8.7712.180.01CD19+77.21±14.3140.30±12.3812.310.01免疫抑制治療1個(gè)月后MG患者臨床嚴(yán)重程度絕對(duì)評(píng)分從16.9±4.0降至9.5±3.4，而且其淋巴細(xì)胞亞群Bcl-2蛋白表達(dá)亦較治療前有明顯下降(P0.01)，CD3+T細(xì)胞蛋白表達(dá)的MFI從0.574±0.177減少到0.233±0.124 (P0.01)。雖然這些參數(shù)均有改善，但高于正常對(duì)照組(P0.01)。 3討論MG是

17、主要累及神經(jīng)-肌肉接頭處的自身免疫性疾病，免疫學(xué)特征是B細(xì)胞多克隆活化，T細(xì)胞活化增加，產(chǎn)生AChRAb，其確切機(jī)制尚不清楚。Shiono等報(bào)道MG患者胸腺生發(fā)中心B細(xì)胞Bcl-2高表達(dá)6，活動(dòng)期SLE患者T細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)明顯增高4,5，且PBMC Bcl-2 mRNA表達(dá)水平明顯升高7。本組結(jié)果顯示，MG患者外周血中CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞和CD19+細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組高，差異有顯著性意義(P0.01)。細(xì)胞凋亡抑制基因Bcl-2對(duì)成熟T細(xì)胞具有明顯效應(yīng)8，可表達(dá)Bcl-2的外周血T細(xì)胞在培養(yǎng)中不僅生存期較長(zhǎng)，而且也產(chǎn)生持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)而劇烈的抗原反應(yīng)，這種抗原反

18、應(yīng)的變化可能是活化T細(xì)胞凋亡被抑制的結(jié)果。此外，Bcl-2表達(dá)使得CD3+抑制性自身反應(yīng)性胸腺細(xì)胞出現(xiàn)，提示Bcl-2表達(dá)確實(shí)對(duì)胸腺內(nèi)克隆性刪除具有抑制效應(yīng)8。CD4+T細(xì)胞(T輔助細(xì)胞)和CD8+T細(xì)胞(T抑制細(xì)胞)亞群Bcl-2表達(dá)異常，可導(dǎo)致T細(xì)胞亞群凋亡的異常，從而引起MG患者T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能紊亂，而MG患者B細(xì)胞的活化是T細(xì)胞依賴(lài)性的，在B細(xì)胞多克隆化過(guò)程中，T細(xì)胞調(diào)節(jié)功能紊亂是一個(gè)重要因素。因此，T細(xì)胞Bcl-2異常表達(dá)在MG疾病活動(dòng)的過(guò)程中起重要作用。MG患者外周血淋巴細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)及其MFI與MG患者臨床嚴(yán)重程度、病程間的相互關(guān)系研究不多。我們的結(jié)果顯示，MG患者外

19、周血CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞和CD19+細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)與臨床嚴(yán)重程度絕對(duì)評(píng)分呈正相關(guān)關(guān)系，而CD3+T細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)的MFI則與病程呈正相關(guān)關(guān)系，故檢測(cè)MG患者外周血T淋巴細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)水平可作為判斷MG臨床嚴(yán)重程度的指標(biāo)之一。但CD3+T細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)的MFI與AChRAb抗體水平無(wú)相關(guān)關(guān)系，提示T細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)可能是MG患者除AChRAb外又一獨(dú)立指標(biāo)。免疫抑制治療1個(gè)月后MG患者臨床嚴(yán)重程度絕對(duì)評(píng)分與外周血淋巴細(xì)胞亞群Bcl-2蛋白表達(dá)、CD3+T淋巴細(xì)胞蛋白表達(dá)的MFI同步地較治療前有明顯下降(P0.01)，但其因果關(guān)系不詳。EB病毒和

20、白細(xì)胞介素2可刺激Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高已有報(bào)道5，但MG患者淋巴細(xì)胞Bcl-2基因及蛋白的高表達(dá)是否與之有關(guān)尚未明了。研究顯示，Bcl-2基因易位于14號(hào)染色體上免疫球蛋白重鏈基因區(qū)(JH)的基因重排可使Bcl-2蛋白高表達(dá)。Aringer等在研究具有Bcl-2蛋白及mRNA高表達(dá)的活動(dòng)期SLE患者時(shí)未見(jiàn)Bcl-2基因重排，認(rèn)為尚有其他機(jī)制調(diào)節(jié)SLE患者Bcl-2高表達(dá)，并推測(cè)SLE患者循環(huán)Bcl-2陽(yáng)性淋巴細(xì)胞數(shù)明顯增多是由于骨髓大量釋放(an augmented release)且生存延長(zhǎng)4。MG患者是否有類(lèi)似的機(jī)制，尚待進(jìn)一步研究?；痦?xiàng)目：浙江省教委科研基金資助項(xiàng)目(97165)

21、作者簡(jiǎn)介：張旭(1963-),男，溫州市人，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事神經(jīng)免疫學(xué)研究。通訊地址：溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，溫州 325000。張旭(溫州醫(yī)學(xué)院附屬一院神經(jīng)內(nèi)科, 溫州 325000)夏君慧(溫州醫(yī)學(xué)院附屬一院神經(jīng)內(nèi)科, 溫州 325000)孫成超(溫州醫(yī)學(xué)院附屬一院神經(jīng)內(nèi)科, 溫州 325000)葉好好(溫州醫(yī)學(xué)院附屬一院神經(jīng)內(nèi)科, 溫州 325000)參考文獻(xiàn)：1 Tsujimoto Y,Finger LR,Yunis J,et al. Cloning the chromosome breakpoint of neoplastic B cells with the t

22、(14;18) chromosome locationJ. Science, 1984,226(4678)：1097-1099.2 Tala N. Concluding remarks:autogenes and oncogenesJ. Clin Immunol Immunopathol, 1994,72(2)：208-209.3 王秀云，許賢豪，孫宏，等. 重癥肌無(wú)力病人的臨床絕對(duì)評(píng)分法和相對(duì)評(píng)分法J. 中華神經(jīng)科雜志， 1997,30(2)：87-90.4 Aringer M,Wintersberger W,Steiner CW,et al. High levels of bcl-2 protein in circulating T lymphocytes,but not B lymphocytes,of patients with syst