宏基因組實驗計劃.

1、宏基因組學方法研究明永冰川的初步實驗計劃起草人：李浩宇宏基因組學研究方向及意義研究：環(huán)境脅迫對集體遺傳變異的過程和機理。發(fā)掘：環(huán)境應激和應答基因的多態(tài)性。探究：多態(tài)性基因的功能。實驗大體步驟：克It霍解詵*冏cd片那廿離提聲詵（初叩血負I. 環(huán)境樣品的采集：1）避免人源污染，采樣的器具都要高溫滅菌，采樣過程中要戴手套。2）樣品的迅速處理保存。 有條件最好用液氮冷凍運輸， 沒有條件可以將裝有樣品的容器至 于干冰泡沫箱中。帶回實驗室之后要盡快處理，特別是固體樣品，迅速用預冷緩沖液（多為PBS）重懸，離心收集沉淀。分裝成小份，凍存于液氮或者-80 °C冰箱中，避免反復凍融。3）如果后續(xù)用間

2、接法提取總 DNA 的話，此處需要收集菌體，采取的策略是稀釋之后的差 速離心，一般適用于水樣。II.DNA 提取方法的選擇：總 DNA 的提取按照處理樣品方式的不同劃分為 直接提取法 和 間接提取法 。 直接提取法就是直接對樣品進行裂解，釋放其中的 DNA 。間接提取法則是先分離樣品中的微生物，后對微生物進行裂解。兩種方法的適用范圍不同， 各自都有優(yōu)缺點。直接提取法的優(yōu)缺點 ：直接提取法多用在提取固體樣品（如土壤、污泥、湖泊沉積物等 ） 總DNA 的試驗中。其最大的優(yōu)點在于得率高，在某些環(huán)境樣品總DNA 提取實例中，比間接提取法高數(shù)倍至數(shù)百倍。 造成這種情況的最主要原因一是環(huán)境樣品中存在豐富的

3、胞外DNA ；二是許多微生物與基質形成復雜的結構， 間接提取法不易對其進行分離。 在樣品較珍貴時多 采用此法。其缺點同樣明顯，所得 DNA 的純度遠不及間接提取法所得，基質中含的腐殖質 一并被保留下來，使得所得 DNA 呈現(xiàn)黃褐色甚至黑色。可以考慮 MoBio 和 Epicentre 的 DNA 提取的商業(yè)試劑盒 （主要用于提取土壤樣品 ）。間接提取法的優(yōu)缺點 ：間接提取法則既可以用來提取固相樣品總 DNA 也可以用來提取液體 樣品總 DNA 。在提取液體樣品 （如海水、 河流等樣品 ）總 DNA 時， 需要用抽濾的方式濃縮。 與直接提取法剛好相反， 其最大的優(yōu)點在于提取 DNA 純度高， 既

4、使在提取固體樣品微生物 總 DNA 時，也可以用緩沖液對收集的菌體進行反復沖洗以去除表面所帶雜質。其缺點是 DNA 得率低。土壤 DNA 直接提取法：(1) 從超低溫冰箱中取出保存樣品(5 g)；(2) 于室溫融化； 加入13.5 ml CTAB抽提緩沖液和50匕蛋白酶K貯存液；(4) 離心管于 37oC 225 rpm 水平振蕩 30 min ；(5) 加入 1.5 mL20%SDS ；65oC水浴2 h,每隔15 min輕輕顛倒數(shù)次；(7) 室溫 6,000g 離心 10 min ，收集上清液，轉移至一個新的 50 ml 離心管中；(8) 沉淀中再加入4.5 ml提取液和0.5 ml 20

5、%SDS，輕輕渦旋至混勻；(9) 浸入液氮中冷凍 3 min 后,于沸水中煮沸 3 min；(10) 室溫6,000g離心10 min，收集上清液，與上次上清液合并；(11) 重復 (8)、(9)、(10)一次；(12) 將三次提取所獲上清液與等體積的苯酚：氯仿(1:1 v/v)混合，搖勻后于 4 C12,000g 離心 10 min；(13) 將上層水相轉移至一新的 50 ml 離心管中,加入等體積的氯仿：異戊醇 (24:1), 混勻后于4 °C 12,000g離心10 min ；(14) 再次轉移上清至一新的離心管中,加入 0.6 倍體積的異丙醇于室溫沉淀 1 h；(15) 室溫

6、 12,000g 離心 20 min；(16) 收集沉淀,用預冷的 70%乙醇洗滌沉淀；(17) 向離心管中加入1 ml TE，于4 C放置過夜，分裝保存于-20 C。實驗過程中的注意事項及一些技巧：(1) 整個提取過程吹吸動作要輕柔,避免劇烈震蕩(試劑盒提取除外 )。(2) 用到的槍頭在滅菌之前最好將頭部剪掉,避免機械剪切。(3) 酚氯仿抽提時,中間相一定不要吸到,寧可多丟棄一些。(4) 異丙醇沉淀時不要放在低溫, 0.7 倍體積室溫沉淀足夠了。(5) DNA 溶解時可以放在 4C 靜置過夜,次日離心取上清去除多余雜質。(6) 水平震蕩可以用左右搖晃的震蕩器。水樣 DNA 間接提取法：(1)

7、 抽濾的方式濃縮采集到的水樣。(2) 采取差速離心取得水樣中的菌體。(3) 取得微生物后進行裂解提取。此方法還在查證中,具體前期對樣品的處理方法還在整理中。 例如：用多少的水樣進行濃縮,差速離心的轉速選擇。 會不會有 DNA 的丟失等等。Epicentre 推出了宏基因組 DNA 分離試劑盒(Metagenomic DNA Isolation Kit for Water ),能 從水樣中分離已隨機剪切的，可直接用于fosmid克隆的DNA片段。4Okb大小的Epicentre 的 PCC1FOS此試劑盒能從水樣中的培養(yǎng)或未培養(yǎng)微生物(包括革蘭氏陽性菌)中提取DNA。提取的DNA可立即進行末端修

8、復，并在乙醇沉淀洗滌后克隆到 載體上。優(yōu)勢：1無需化學剪切，瓊脂糖塊或大小選擇。2無需純化柱或酚/氯仿提取。3產(chǎn)量更高，從低豐度的微生物中回收DNA的概率更大。4.Fosmid載體與DNA的克隆只需要90分鐘。F圖為方法與流程:Him &工沖 ¥粗提 DNA 的純化 采用直接提取法提取的總 DNA 或多或少都含有腐殖質的存在。 它的存在對后續(xù)的分子生物 學操作會有影響， 時常會導致 PCR 擴增不出來， 酶切困難， 連接轉化率低。 需要進行純化。 純化的方法包括：膠回收，柱純化，電泳 /電洗脫，梯度離心。a 膠回收膠回收最大的優(yōu)點在于快捷， 可以在很短的時間內完成。 純化后的

9、 DNA 往往能夠滿足 PCR 要求。但其缺點在于， 膜截留式的純化方式難免會對 DNA 分子造成機械損傷， 使得 DNA 彌 散，完整度下降。如果后續(xù)的實驗室分析16S r DNA ，則這種純化方式不失為一種好方法。b 柱純化柱純化相對于膠回收來說更為快速， 十幾分鐘內可完成。 與膠回收相比， 其純化效果要差一 些。但通常情況下，純化之后的 DNA 也能夠滿足 PCR 需求。這種方法也會造成 DNA 分 子的機械損傷，使得 DNA 彌散，完整度下降。c 電泳 /電洗脫電泳 /電洗脫法相對于前兩種有很多優(yōu)點：其一，其價格低；其二，整個過程都很溫和，能 夠保證 DNA 的完整性；其三，純化后的

10、DNA 純度較之前兩種要好一些。但是其亦有些許 不便：其一，過程耗時長，包括透析袋的準備，電洗脫，洗脫液的濃縮等；其二， DNA 損 失量較前兩種大， 透析袋上會殘留 DNA 。如果樣品不是很珍貴， 并且后續(xù)要進行 Metagenomic 研究， 這種方法不失為一種好方法。 如果有脈沖場凝膠電泳系統(tǒng)， 用此方法可以得到高純大 片段 DNA ，可以滿足后續(xù)的 metagenomic C/Fosmid 文庫構建。d 蔗糖 /氯化銫密度梯度離心如果實驗室有超速離心機 （100,000g 以上 ），那么這種方法無疑也是一種好方法。與電泳電 洗脫法相同，這種方法在連續(xù)介質中對 DNA 及雜質進行分離，可

11、以很好的純化 DNA 。純 化得到的 DNA 經(jīng)過低熔點凝膠電泳切膠回收，可以得到高純度大片段的 DNA ，可以滿足 后續(xù)的 metagenomic C/Fosmid 文庫構建。純化質量的檢測DNA 純化完畢之后往往需要對純化效果做一個初步的判斷，主要包括兩方面：其一，完整 度判斷；其二，純度判斷。a 完整度判斷完整度判斷同前所述， 千萬要記得的是加純化之前的 DNA 樣品做對照。 結果可以告訴我們 純化得率及完整度。同樣，最好能跑脈沖場凝膠電泳。b 純度判斷 純度判斷通?？梢圆捎脙煞N方法：分光光度計法和 PCR 擴增法。分光光度計可以測定雙鏈 DNA 在 260nm 處的吸收值及雜質在其他波

12、長的吸收值。通過不同波長吸收值的比，可以 對 DNA 純度做出判定。通常這種方法由于靈敏性較高，所以在存在雜質時誤差較大。III. 所提 DNA 完整性檢測DNA 的完整性主要采用普通瓊脂糖凝膠電泳進行指示。最好采用 0.8% 瓊脂糖凝膠電泳， 低電壓長時間跑。至少要用 lambda DNA/Hind III 做 marker ，如果在 23 kb 處有一條完整或 略拖尾的帶， 則證明 DNA 完整性尚好。 如有條件， 可以采用脈沖場凝膠電泳對提取DNA 的完整度進行分析。用脈沖場凝膠電泳分析時，除了上面提及的那個maker，至少還應該有完整 lambda DNA （約 48 kb）充當另一個

13、 maker。以上為送測序前樣品的采集， DNA 的提取，驗證等前期處理與方法 的大致步驟與方法。Illumina 所進行的測序是 由 Genome Analyzer測序儀所完成的：Genome Analyzer技術的基本原理：仁文庫制備將基因組DNA打成幾百個堿基(或更短)的 小片斷，在片斷的兩個末端加上接(adapter)2. 產(chǎn)生DNA簇利用專利的芯片，具表面連接有-層單鏈引 物,DNA片斷成單鏈后通過與芯片表面的引物堿 基互補被一端“固泄”在芯片上。引物擴增使得單鏈 DNA成為雙鏈，該雙鏈變性后成為單鏈,貝一端'固 定”在芯片上，另外一端(5或3')隨機和附近的另 外一

14、個引物互補，也被倘定住L形成淅(bridge) 反復30輪擴增，每個單分子得到了 1000倍擴 增，成為單克隆DNA簇”3. 測序四種熒光標記的染料應用邊合成邊測序(Sequencing By Synthesis)的原理，在每個循 壞過程里，熒光標記的核昔和聚合酚被加入到單分 子陣列中。互補的核昔和核昔酸片斷的第一個堿基 配對，通過酶加入到引物上。多余的核昔被移走。 這樣每個單鏈DNA分子通過互補堿基的配對被 延伸，利用生物發(fā)光蛋白，比如螢火蟲的熒光索酚, 對通過堿基加到引物后端時所釋放出的焦磷酸鹽 來提供檢測信號。針對每種堿基的特定波長的激光 激發(fā)結合上的核昔的標記，這個標記會釋放出熒 光。

15、熒光信號被CCD采集，CCD快速掃描整個陣 列檢測特定的結合到每個片斷上的堿基。通過上述 的結合，檢測町以重復幾十個循環(huán)，這樣就有可能 決定核昔酸片斷中的幾十個堿基。4. 數(shù)據(jù)分析自動讀取堿基，數(shù)據(jù)被轉移到自動分析通道進 行二次分析。Genome Analyzer的技術優(yōu)勢：1對擴展的超高通量Genome Analyzer系統(tǒng)每次配對末端運行后 對以得到超過3GB的高品質過濾數(shù)據(jù)。這個技術 的可擴展性保證了更高的數(shù)據(jù)密度和輸出，能用更 少的經(jīng)費完成更復雜的項冃。2.需要樣品量少Genome Analyzer系統(tǒng)需要的樣品量低至 100ng,能應用在很多樣晶有限的實驗（比如免疫 沉淀、顯微切割等

16、）中。3簡單、快速、自動化Genome Analyzer系統(tǒng)提供了最簡單和簡潔 的工作流程。即使是最小的實驗室也能像基因組中 心一樣進行大規(guī)模的實驗。制備樣品文庫可以在幾 小時內完成，一個星期內就能得到高精確度的數(shù) 據(jù)。Cluster Station 可以說是 Genome Analyzer 的核心。由獨立軟件控制的自動生成DNA簇的過 程可以在5小時之內（30分鐘手工操作）完成， 并同時處理8個樣胡。這個自動化的流程不需要進 行油包水PCR,減少了手工操作誤差和污染可能 性，不需要機器人操作或潔凈室。快速的實驗流程 使Genome Analyzer的能力增至最大，而自動化 步移降低了項冃的時

17、間和費用。4.新穎的測序化學技術Genome Analyzer通過合成測序來支持人規(guī) 模并行測序。利用新穎的可逆熒光標記終止子，可 以在DNA鏈延伸的過程中檢測單個堿基摻入。由 于四個可逆終止子dNTP在每個測序循環(huán)都存在， 自然的競爭減少了摻入的誤差。5. 高產(chǎn)量的有效數(shù)據(jù)測序系統(tǒng)產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)的質量是評價實驗 是否成功的最重要因索。川umina Genome Analyzer系統(tǒng)在一個配對末端運彳亍之后能產(chǎn)生超 過3GB的堿基數(shù)。高質量的數(shù)據(jù)以及每個堿基的 質量度量，意味著町以用更少的運行和更大的信心 來完成這個實驗。6. 單個或配對末端支持Genome Analyzer系統(tǒng)支持單個片段或配對 末端文庫。文庫構建過程簡單，減少了樣品分離和 制備的時間。制備基因組DNA的單個片段或配對 末端文庫需要6個小時，只有3個小時需要手工操作。2x36個堿基或更長的片段增加了比對基囚組的能力，并拓展了在其他方面的應用。7. DNA分析支持Illumina提供了測序系統(tǒng)的分析軟件和硬件， 用于從原始數(shù)據(jù)中快速獲得町發(fā)表的、生物學有意 義的結果。IPAR （整合的初級分析和報告）系統(tǒng) 提供了初級數(shù)據(jù)輸出的實時圖像分析。圖像分析之 后，Pipeline軟件自動進行堿基讀取和與參考序列 進彳亍比對。BeadStudio單元針對