氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和光譜相關(guān)色譜法用于清肝注射液及茵陳藥材中

1、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和光譜相關(guān)色譜法用于清肝注射液及茵陳藥材中揮發(fā)性成分的相關(guān)分析                      作者：高海燕 郭方遒 易倫朝 梁逸曾【摘要】  目的對(duì)清肝注射液和茵陳藥材中的揮發(fā)性成分進(jìn)行定性、定量測(cè)定，并分析注射液和藥材之間的相關(guān)性。 方法采用氣相色譜-質(zhì)譜（GC?MS）法測(cè)定清肝注射液及茵陳藥材中的揮發(fā)性成分并用光譜相關(guān)色譜法對(duì)它們之間

2、的相關(guān)性進(jìn)行分析。揮發(fā)性成分采用水蒸氣蒸餾法提取。結(jié)果清肝注射液中分離出的23個(gè)主要物質(zhì)，有21個(gè)來(lái)源于茵陳藥材。茵陳藥材中分離28個(gè)物質(zhì)，定性25個(gè)。 結(jié)論GC?MS法與光譜相關(guān)色譜法結(jié)合可對(duì)具有揮發(fā)性成分的中藥注射液及其對(duì)應(yīng)藥材的相關(guān)性進(jìn)行快速比較分析。 【關(guān)鍵詞】  清肝注射液 茵陳 氣相色譜 質(zhì)譜聯(lián)用 光譜相關(guān)色譜清肝注射液具有清熱利濕、利膽退黃之功效1，在臨床上已得到廣泛應(yīng)用，其揮發(fā)性成分主要來(lái)自茵陳藥材。茵陳（Herba Artemisiae Scopariae）為傳統(tǒng)中藥2，臨床上被廣泛用于治療黃疸、肝炎等疾病，其揮發(fā)油具有廣譜抗菌和殺菌作用3。在中藥制劑的質(zhì)量控制中，

3、注射液中有效成分的來(lái)源，即其與對(duì)應(yīng)藥材的相關(guān)性十分重要。中藥及其注射液的成分非常復(fù)雜，即使用正交投影法(OPA)4，子窗口因子分析法(SFA)5，直觀推導(dǎo)式演進(jìn)特征投影法(HELP)6，7等二維數(shù)據(jù)分辨方法進(jìn)行解析后與標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)進(jìn)行匹配，也不能將所有物質(zhì)定性。在組分不完全清楚的情況下，本實(shí)驗(yàn)充分利用聯(lián)用色譜的色譜、質(zhì)譜信息，結(jié)合光譜相關(guān)色譜法8，對(duì)相同條件下所得的清肝注射液和茵陳藥材揮發(fā)性成分的數(shù)據(jù)進(jìn)行了詳細(xì)的對(duì)比。報(bào)道如下。    1  儀器與試藥    GC-2010A型氣相色譜儀，GCMS-QP2010型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用

4、儀（日本島津公司）；揮發(fā)油提取器。    清肝注射液（批號(hào)：040607）和茵陳藥材均由江西省天施康中藥股份有限公司提供；正己烷為分析純，水為蒸餾水。    2  方法    2.1  方法原理相同條件下所得的兩個(gè)色譜曲線，雖然同一流出組分的保留時(shí)間可能存在漂移，但其光譜（或質(zhì)譜）應(yīng)該相同或相似。因此，通過(guò)對(duì)不同流出時(shí)間點(diǎn)的光譜（或質(zhì)譜）進(jìn)行相關(guān)計(jì)算，可得一個(gè)類似色譜的光譜相關(guān)系數(shù)曲線，稱之為光譜相關(guān)色譜8。    一般說(shuō)來(lái)，兩個(gè)組分的光譜相關(guān)系數(shù)可由下式

5、計(jì)算：    r(i,j)=(si-i)T(sj-j)ll(sj-j)ll(sj-j)ll          (1)    式中- 1   1 ， r越大表示組分i的光譜（或質(zhì)譜）si 與組分j 的光譜（或質(zhì)譜）Sj 越相似。當(dāng)r = 1 且保留時(shí)間相近時(shí)，色譜曲線中的兩個(gè)組分應(yīng)為同一化學(xué)物質(zhì)。實(shí)際上，由于噪聲和量測(cè)誤差等因素的存在， r 最大值不可能等于1，只能接近于1。?表示Frobenius 范數(shù)， T為向量的轉(zhuǎn)置，變量上的一橫表

6、示相應(yīng)變量的均值。    設(shè)某一樣本化學(xué)色譜指紋圖譜的某一組分純物質(zhì)質(zhì)譜為s,另一樣本色譜指紋圖譜所包含的所有質(zhì)譜,即每一保留時(shí)間點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜，記為xj ( j = 1 , . . . , m , m 為最大色譜保留時(shí)間點(diǎn)) ，計(jì)算s與xj 的相關(guān)系數(shù)即可得相對(duì)于該純物質(zhì)的光譜相關(guān)色譜，根據(jù)式(1) 計(jì)算如下：    r(s,xj)=(s-)T(xj-j)ll(s-)ll ll(xj-j)ll        (2)    將r ( s

7、 , Xj) 對(duì)色譜保留時(shí)間作圖即得到該目標(biāo)物質(zhì)與這一樣本色譜指紋圖譜的光譜相關(guān)色譜曲線。如果色譜流出時(shí)間方向上所對(duì)應(yīng)的一段光譜相關(guān)色譜曲線的值很接近1，則說(shuō)明目標(biāo)物質(zhì)存在于該樣本，再結(jié)合色譜保留時(shí)間信息即可實(shí)現(xiàn)相同條件下樣本的相關(guān)性分析。    2.2   供試品溶液的制備量取注射液50 ml（或稱取藥材12.5 g），置于圓底燒瓶中，加玻璃珠數(shù)粒，連接揮發(fā)油提取器。揮發(fā)油提取器的收集管中上端加水，使充滿刻度部分，再加正己烷1 ml，連接回流冷凝管，適當(dāng)溫控提取。從回流開(kāi)始計(jì)時(shí)，控制溫度使每分鐘約20滴。60 min后停止加熱，冷卻，收集含有

8、揮發(fā)油組分的正己烷溶液。用正己烷定容至2 ml，即得。所用藥材的量與注射液的濃度一致。    2.3   色譜條件    2.3.1  GC條件OV-1彈性石英毛細(xì)管柱30 m×0.25 mm×0.25 m，進(jìn)樣口溫度250，載氣為N2，流速0.70 ml?min-1，分流比51，程序升溫起始溫度為60 (保持5 min)，然后以4?min-1的速度升溫至240 （保持5 min），進(jìn)樣量1l。    2.3.2  MS條件電離方式為EI源；電子

9、能量0.75 kv；離子源溫度200；質(zhì)量范圍（m/z）30400 amu；掃描間隔0.2 s/scan。    3  結(jié)果    3.1  茵陳藥材與注射液中揮發(fā)性成分定性、定量分析采用GC/MS聯(lián)用技術(shù)，對(duì)茵陳藥材和清肝注射液中的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，分別分離出28個(gè)和23個(gè)主要成分。將所得各成分的質(zhì)譜圖，直接用該機(jī)的數(shù)據(jù)系統(tǒng)進(jìn)行檢索（譜庫(kù)NIST107），并用標(biāo)準(zhǔn)圖譜比較，確定其成分。用島津公司GC/MS工作站中的峰面積歸一化法，測(cè)定各成分的相對(duì)百分含量。定性、定量結(jié)果見(jiàn)表1。表1  清肝注射液和茵陳

10、藥材中揮發(fā)性成分定性、定量結(jié)果%表1中第1列左邊數(shù)字表示在茵陳中的峰號(hào)，右邊數(shù)字表示在清肝注射液中的峰號(hào)；“-”表示未被檢出百事通    3.2  茵陳藥材與清肝注射液中揮發(fā)性成分的相關(guān)性分析      a?慘鴣亂鬧謝臃猿煞值?TLC  b?睬甯巫湟褐謝臃猿煞值?TLC    圖1  茵陳藥材和清肝注射液中揮發(fā)性成分的總離子流圖（圖中峰號(hào)一致）    圖1為茵陳藥材和清肝注射液中揮發(fā)性成分的總離子流圖（TLC），它們均是很復(fù)雜

11、的分析體系, 大部分色譜峰都達(dá)到基線分離，但也有些色譜峰出現(xiàn)重疊現(xiàn)象。對(duì)于已得到定性結(jié)果的譜峰，根據(jù)二者的色譜保留時(shí)間以及定性分析結(jié)果可以確定其相關(guān)關(guān)系及歸屬問(wèn)題。對(duì)于匹配率較低的譜峰，如清肝注射液中的15號(hào)、17號(hào)和18號(hào)峰，采用光譜相關(guān)色譜的方法來(lái)確定它們的對(duì)應(yīng)關(guān)系。    在相關(guān)色譜分析前，首先要得到各譜峰的純質(zhì)譜。17號(hào)和18號(hào)峰均為純峰，各色譜流出點(diǎn)對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜圖均相同。因此，任取其中的一點(diǎn)對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜即可得到其純質(zhì)譜。由于15號(hào)峰不純，首先要確定純物質(zhì)區(qū)域，這可以通過(guò)二維數(shù)據(jù)解析6，7獲得。其純物質(zhì)區(qū)域各點(diǎn)對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜為純質(zhì)譜。在實(shí)際計(jì)算中，為了避免噪聲和計(jì)

12、算誤差的影響，我們一般選取色譜響應(yīng)值最高的點(diǎn)附近的一段區(qū)域，進(jìn)行重復(fù)計(jì)算得到光譜相關(guān)色譜。    如清肝注射液中18號(hào)峰與藥材中對(duì)應(yīng)譜峰的確定。清肝注射液中18號(hào)峰的純質(zhì)譜，記為S1。根據(jù)公式（2）對(duì)茵陳藥材數(shù)據(jù)中保留時(shí)間為35.540 min的部分作相關(guān)色譜分析，可得注射液中18號(hào)峰與茵陳藥材圖譜的光譜相關(guān)色譜（見(jiàn)圖2）。在光譜相關(guān)色譜中，35.540 min的相關(guān)系數(shù)值最大為0. 998 8，很接近1 ，其對(duì)應(yīng)的色譜流出時(shí)間與茵陳藥材的24號(hào)峰的一致，這說(shuō)明清肝注射液中的組分18與茵陳藥材圖譜中組分24的質(zhì)譜十分相似,應(yīng)為同一物質(zhì)（見(jiàn)圖34）。用相同方法對(duì)清肝

13、注射液中的15號(hào)和17號(hào)峰與茵陳藥材圖譜中組分的對(duì)應(yīng)關(guān)系進(jìn)行分析，確定其分別與茵陳藥材譜圖中的21號(hào)和23號(hào)譜峰相對(duì)應(yīng)。    清肝注射液中的23個(gè)主要成分中除4號(hào)和21號(hào)峰外，其余均來(lái)源于茵陳藥材。4號(hào)峰和21號(hào)峰對(duì)應(yīng)的物質(zhì)可能來(lái)源于助溶劑吐溫-80，但進(jìn)一步的確認(rèn)還需要實(shí)驗(yàn)的證明。茵陳藥材中揮發(fā)性成分的最高響應(yīng)值約為清肝注射液中物質(zhì)最高響應(yīng)值的7倍。可見(jiàn)，廠家完全可以改進(jìn)工藝提高藥材中揮發(fā)性成分的提取率。     4  結(jié)論    本文用GC/MS法對(duì)水蒸氣蒸餾法提取的清肝注射液和

14、茵陳藥材中的揮發(fā)性成分進(jìn)行了定性、定量分析。充分利用了GC/MS提供的各化學(xué)組分的色譜和質(zhì)譜信息，結(jié)合二維分辨和光譜相關(guān)色譜的方法對(duì)中藥注射液及其對(duì)應(yīng)藥材的相關(guān)性進(jìn)行了快速比較分析，為清肝注射液的質(zhì)量控制奠定了基礎(chǔ)。    致謝：感謝天施康中藥股份有限公司對(duì)我們工作的支持和幫助!【參考文獻(xiàn)】  1 中國(guó)藥科大學(xué).中藥辭海，第2卷M.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,1996：1262.2 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典,部S.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2000:192.3 ?明艷,胡一橋,譚仁祥.茵陳蒿的化學(xué)及藥理學(xué)研究進(jìn)展J.中草藥,1998,29（8）:564.4 S

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