細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室操作準(zhǔn)則2021.10版

1、細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室操作準(zhǔn)那么任何首次準(zhǔn)備開展細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的人員必須首先認(rèn)真閱讀以下準(zhǔn)那么，然后在已經(jīng)熟 練掌握細(xì)胞培養(yǎng)操作技術(shù)人員的指導(dǎo)下開始進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，并在以后的實(shí)驗(yàn)過 程中嚴(yán)格遵守各項(xiàng)準(zhǔn)那么。一、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備1. 進(jìn)入細(xì)胞房前要換鞋，穿無菌服干凈實(shí)驗(yàn)工作服，戴手套，接觸細(xì)胞前噴 75%酉精消毒手套。2. 將所需實(shí)驗(yàn)用品：培養(yǎng)基完全培 養(yǎng)基、 空白培 養(yǎng)基 、胰酶含ETTA、槍 頭1ml、200ul、10ul、離心管，預(yù)先放置到超凈工作臺(tái)，翻開紫外照射 30min 后開始細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。3. 觀察細(xì)胞前，用75%酒精紗布擦拭顯微鏡鏡頭與臺(tái)面，進(jìn)行消毒前方可開始觀 察細(xì)胞。4. 觀察細(xì)胞主要包括：細(xì)胞數(shù)量

2、集合度、形態(tài)、分布情況是否均勻、有無 漂浮的死細(xì)胞和污染等，觀察完與時(shí)放回培養(yǎng)箱。 如圖，集合度約90%分布 均勻5. 每次開始細(xì)胞實(shí)驗(yàn)前，需關(guān)閉紫外照射，翻開超凈臺(tái)風(fēng)機(jī)與燈。用含75%酒精的紗布擦拭超凈工作臺(tái)。超凈臺(tái)物品放置情況：左側(cè)各式槍頭，與可常溫放置的試劑如PBS等，右側(cè)5ml槍頭與鑷子，廢棄瓶位于右上角，盡可能遠(yuǎn)離操 作區(qū)域，正前方為槍和酒精燈，培養(yǎng)基與胰酶放置左側(cè)便于取用。6. 超凈臺(tái)在使用前后，都需用含75%酒精的紗布擦拭臺(tái)面至紗布上看不到明顯臟 物為止，每天操作后廢液缸需清洗用紫外照射， 此外，從外面拿進(jìn)超凈臺(tái)的東西 都要噴75%酒精消毒。7. 每周四需更換培養(yǎng)箱中高壓過的超純

3、水，每周五對(duì)超凈臺(tái)包括風(fēng)機(jī)、細(xì)胞 培養(yǎng)房衛(wèi)生進(jìn)行清掃，每月對(duì)培養(yǎng)箱進(jìn)行消毒清洗，確保細(xì)胞不受污染。8、檢查培養(yǎng)箱的CO2含量是否正常，如出現(xiàn)異常與時(shí)聯(lián)系細(xì)胞平臺(tái)相關(guān)負(fù)責(zé)人。9、5mL槍頭清洗高壓的流程：1用洗潔精將槍頭超聲一遍2更換干凈的自來 水超聲清洗 3 遍3用超純水超聲清洗 1 遍4將槍頭撈出后再用超純水蕩洗3 遍 5放入烘干箱烘干 6裝在鐵盒中，注意槍頭放置順序一致，放入高壓 鍋，選擇橡膠類 7高壓后放入烘干箱烘干前方可拿入細(xì)胞房使用1ml、 200ul 、 10ul 裝入槍盒后放入高壓鍋高壓烘干前方可拿入細(xì)胞房使用二、細(xì)胞傳代1. 細(xì)胞傳代前要觀察細(xì)胞，細(xì)胞集合度到達(dá) 80%-90%

4、時(shí)可以進(jìn)行傳代。 圖片2. 以25cm2培養(yǎng)瓶為例：翻開培養(yǎng)瓶瓶蓋，將蓋子地面朝下放在超凈臺(tái)臺(tái)面上， 然后將培養(yǎng)瓶?jī)A斜，用量程5ml的槍將舊培養(yǎng)基吸走，然后用量程1ml槍加1ml 空白培養(yǎng)基輕輕搖勻清洗，用5ml槍將清洗的培養(yǎng)基吸走。注：75cm2加3ml空 白培養(yǎng)基清洗3. 參加胰酶含 EDTA 500ul ；然后輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，注意讓所有細(xì)胞都要接觸 到胰酶，放入37度培養(yǎng)箱消化。注：75川大瓶加i500ul胰酶、6孔板加300ul 胰酶、 12 孔板加 200ul 胰酶4. 消化時(shí)間長(zhǎng)短根據(jù)不同細(xì)胞有不同選擇， 鏡下觀察大局部細(xì)胞變圓， 見大局部 細(xì)胞脫落即可終止消化。5.25cm2培養(yǎng)

5、瓶參加2ml完全培養(yǎng)基終止消化。注：75cm2培養(yǎng)瓶加5ml完全培 養(yǎng)基終止消化、 6 孔板加 1.5ml 完全培養(yǎng)基終止消化、 12 孔板加 1ml 完全培養(yǎng)基 終止消化。6. 用 5ml 槍頭輕輕吹打細(xì)胞后，觀察底部大局部細(xì)胞已脫落，然后傾斜培養(yǎng)瓶， 將細(xì)胞混懸液轉(zhuǎn)移到15ml離心管，800r/min條件下離心3min。7. 離心時(shí)，準(zhǔn)備新的培養(yǎng)瓶，標(biāo)記好細(xì)胞的名稱、日期、代數(shù)。8. 離心完畢后，棄上清液。緩緩沿壁參加 5ml 新鮮的完全培養(yǎng)基，計(jì)數(shù)方法參 見后面。9. 重懸細(xì)胞， 用量程 5ml 槍，槍打到第一檔，深入管底部，輕輕吸取離心管底部 的整個(gè)沉淀的細(xì)胞團(tuán)和培養(yǎng)基， 然后沿管壁緩

6、慢勻速打下， 槍頭隨著液面的的上 升而逐漸上提，這樣可防止產(chǎn)生氣泡。 按此方法反復(fù)幾次，待細(xì)胞混勻后，吸取 細(xì)胞混懸液，參加新培養(yǎng)瓶，按所需比例進(jìn)行傳代即可。細(xì)胞傳代的比例是根據(jù)所需細(xì)胞的數(shù)量以與時(shí)間來決定。 如需急用可用低的比例 1:2,1:3 傳代，并每天換液，如時(shí)間充裕，不用時(shí)可適量加大傳代比例 1:4,1:5 ，并 3 天換液，減少細(xì)胞的代數(shù)， 暫時(shí)不用細(xì)胞只需留一小瓶培養(yǎng)即 可。10. 進(jìn)行十字型搖勻，有序放入培養(yǎng)箱中。須知：1、需要進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)前，合理擴(kuò)大培養(yǎng)，盡量安排在同一代數(shù)情況下做實(shí)驗(yàn)。2、在進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)時(shí)，不可同時(shí)處理兩種與以上細(xì)胞，防止交叉污染。三、細(xì)胞計(jì)數(shù)： 計(jì)數(shù)前操作

7、與傳代相同 1、消化后的細(xì)胞充分混勻后，用 10ul 槍吸取 l0ul 細(xì)胞混懸液，再吸取 10ul 臺(tái)盼藍(lán)，在 1.5ml 離心管中將兩者混和均勻后，將 20ul 混合液注入計(jì)數(shù)板。2、翻開計(jì)數(shù)器，確認(rèn)紅色指示燈亮起，藍(lán)色指示燈在第幾格，一般為第一格， 旋轉(zhuǎn)選擇正確區(qū)域。3、翻開計(jì)數(shù)軟件“ count star , 標(biāo)明日期與細(xì)胞名稱，選擇比例 1:1 ，細(xì)胞類 型為， 注意觀察細(xì)胞分布，如果不均勻，應(yīng)重新混勻后計(jì)數(shù) 。4、記錄容：細(xì)胞總數(shù)，死細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞活力一般活力在95%以上與 活細(xì)胞數(shù)。活細(xì)胞數(shù)用于計(jì)算接板所需的細(xì)胞量5、將計(jì)數(shù)板與時(shí)從 count star 取出，關(guān)閉軟件，計(jì)數(shù)完成。

8、四、細(xì)胞接種：1、細(xì)胞計(jì)數(shù)完后，正確計(jì)算所需的細(xì)胞量和培養(yǎng)基的量，取一潔凈的皿，將細(xì) 胞混懸液和完全培養(yǎng)基分別參加皿。2、混勻：先用 5ml 槍混勻，然后取排槍混勻后， 先加一孔到 96 孔板中，去鏡下 觀察分布是否均勻， 如假設(shè)不均勻需再次混勻， 確保均勻后再參加。 防止產(chǎn)生氣泡， 如有少許氣泡可用 10ul 槍頭戳破。每次吸取液體后需觀察高度是否一致和準(zhǔn)確。3、對(duì)于接板的細(xì)胞， 96 孔板可先靜置一會(huì)再放入培養(yǎng)箱，防止搖動(dòng)，以免細(xì)胞集中在中央。例如：需接一塊96孔板，細(xì)胞密度為0.5*10 5,細(xì)胞計(jì)數(shù)-活細(xì)胞數(shù)為5*105個(gè)/ml需稀釋的倍數(shù)為5*105除以0.5*10 5等于10倍，一

9、塊96孔板需要12ml，故需細(xì)胞懸液的體積為12ml除以稀釋位數(shù)10等于1.2ml，其余的量用完全培養(yǎng)基補(bǔ)足。須知：無論是接種在6孔板、12孔板、24孔板和96孔，培養(yǎng)皿或者培養(yǎng)瓶中，都需要 先參加一孔、一個(gè)培養(yǎng)皿或一個(gè)培養(yǎng)瓶在鏡下觀察細(xì)胞懸液分布是否均勻，假設(shè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞有抱團(tuán)、成束現(xiàn)象需重新混勻前方可接種。附不同板底面積i wL ?35 rnm睛霽工p .21.E.2百口100 nm 杯JI5.0151C.01蛀丸體購(gòu) rrL甜垃*gQP盤鉗細(xì)舟EiiffiL i_JT-?S和陽(yáng)2S-71/7575202咋/站5沁| j|幾fl申站*訓(xùn)咻毗5L16幾韋ifr根EQ3皿JOT123.S03.31

10、1呦24 4繪陣梅1.9G1 $5tooqg打布C：320.MEGO五、細(xì)胞凍存：1、訂購(gòu)新細(xì)胞之前需查閱相關(guān)的文獻(xiàn)， 選擇適宜的細(xì)胞，并仔細(xì)閱讀說明書培 養(yǎng)的條件包括培養(yǎng)基等，準(zhǔn)備好細(xì)胞培養(yǎng)所需的相關(guān)試劑與耗材。1、買來后傳一個(gè)25cm2小瓶，記為第一代-P0，假設(shè)細(xì)胞狀態(tài)不好可每天換液， 長(zhǎng)滿后1:3傳3個(gè)小瓶，記為第一代P1,然后根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)速度長(zhǎng)滿后按 1:6 傳6個(gè)大瓶，記為P2,保種5大瓶，另一大瓶可開始用于實(shí)驗(yàn)，以此類推，詳 細(xì)記錄細(xì)胞的代數(shù)。凍存時(shí)寫上細(xì)胞名稱、凍存日期與細(xì)胞的代數(shù)。2、細(xì)胞消化離心后，去掉上清液，快速參加凍存液，充分混勻后裝入凍存管。3、一般一瓶75cm2的

11、瓶子可凍存3-4小管，標(biāo)號(hào)細(xì)胞名稱，凍存日期和細(xì)胞代 數(shù)，用封口膜封口，放入程序性降溫盒置于-80 C冰箱過夜，第二天置于液氮中 保存。4、放入液氮時(shí)，注意放入正確的位置，記錄好凍存細(xì)胞的位置，順序按時(shí)間先 后排，時(shí)間前的放外面。六、細(xì)胞復(fù)1、復(fù)前準(zhǔn)備：將所需物品放入超凈臺(tái)，翻開紫外照射約半小時(shí)， 75%酒精擦拭臺(tái) 面。2、準(zhǔn)備15ml離心管，參加5ml培養(yǎng)基。3、提前翻開37C水浴鍋預(yù)熱，從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37C溫水中, 并不時(shí)搖動(dòng)令其全部融化，更 換新手套。4、用 75%酒精噴灑凍存管后，擦拭臺(tái)面 ，翻開蓋子， 1ml 槍頭吸出細(xì)胞懸液，加 到含培養(yǎng)基的離心管，充分混勻；5、

12、離心， 800r ， 3min；6棄去上清液，重懸細(xì)胞，參加完全培養(yǎng)基到 25cm2的小瓶子，在顯微鏡下觀 察細(xì)胞狀態(tài)，然后放入37C培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)；7、注意觀察細(xì)胞狀態(tài)，與時(shí)換液。8、細(xì)胞復(fù)后，根據(jù)細(xì)胞的特性，按適當(dāng)?shù)谋壤齻鞯?75cm的大瓶子，每天換液， 長(zhǎng)滿后立即保種，并記錄細(xì)胞的代數(shù)，細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定前方可開始實(shí)驗(yàn)。8、復(fù)后觀察細(xì)胞如果發(fā)現(xiàn)一小瓶有很多細(xì)胞，立即傳到大瓶子七、細(xì)胞加藥1、細(xì)胞加藥前需在鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量，根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞覆蓋率的要 求不同。一般藥物作用24h是在細(xì)胞長(zhǎng)到50%-60%時(shí)寸加藥1配置最高濃度,2、計(jì)算好所需配置的量，準(zhǔn)備離心管，配藥可采用兩種方法:再進(jìn)行

13、倍比稀釋配成所需各濃度。2分別配置所需的各種濃度。配完藥后注意 要上下混勻!3、加藥時(shí)沿孔板壁加，防止產(chǎn)生氣泡，加完后注意檢查有無氣泡，小氣泡需用 小槍頭捅破，以免影響藥物的均勻分布。4、加藥后，立即放入培養(yǎng)箱。例如：1、一塊96孔板加藥，復(fù)方熊膽粉FF儲(chǔ)存液濃度為500mg/mlPBS配置， 我們需要配置成0、1.25、2.5、5mg/ml的工作液各1ml，采用倍比稀釋法，準(zhǔn)Omg/ml1.25mg/ml2.5mg/ml5mg/ml混勻后加1ml混勻后加1ml1mlDMEM1mlDMEM2ml(5mg/ml)備4個(gè)5ml的離心管，在0、1.25和2.5mg/ml的離心管中分別參加 1mlDM

14、E完 全培養(yǎng)基，然后將500mg/ml的工作液稀釋成最高濃度5mg/ml，然后過濾，參加 2ml到5mg/ml的離心管中。1mlDMEM八、細(xì)胞污染處理1. 我們實(shí)驗(yàn)室一般較少細(xì)胞污染，細(xì)胞污染時(shí)多出現(xiàn)不明游動(dòng)物體、底部有連片 黃色斑點(diǎn)、出現(xiàn)絮狀或毛線狀的菌落等，常伴有明顯不適氣味。2、 一經(jīng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞污染，立刻上報(bào)不得隱瞞。 馬上將被污染細(xì)胞移出培養(yǎng)箱不 要開蓋，防止細(xì)胞交叉污染，在細(xì)胞房外向瓶注入新潔爾滅，蓋緊瓶口，扔進(jìn) 醫(yī)療垃圾桶。3、將培養(yǎng)箱中的細(xì)胞，逐一在鏡下觀察是否已交叉污染，如發(fā)現(xiàn)已交叉污染做 污染細(xì)胞處理，排除隱患后，將正常細(xì)胞移到另一培養(yǎng)箱中。4、關(guān)閉污染培養(yǎng)箱的電源開關(guān)，將隔

15、板取出，用新潔爾滅1:1000-1:2000擦拭, 確保每個(gè)角落都擦到，后進(jìn)行紫外照射2小時(shí)。箱除用潔爾滅擦拭外，還需用 75%酉精擦拭，確保每個(gè)角落都不能遺漏。5、將水槽清洗干凈后用75%酒精擦拭，用新高壓的超純水換掉原先的水。6細(xì)胞移回的一周，要細(xì)心觀察是否污染的現(xiàn)象再次出現(xiàn)，一般污染為偶然事件，如再次出現(xiàn)就不是培養(yǎng)箱的問題，而是培養(yǎng)箱外部的問題如培養(yǎng)基、操作、外部帶環(huán)境等。十、常用試劑的配制與保存1、完全培養(yǎng)基的配置：空白培養(yǎng)基+1液抗Hyclone+10%胎牛血清目前使用 的是Gibco滅菌過濾過的，配置時(shí)無需過濾例如：500ml的DME空白培養(yǎng)基+55mlFBS+5.5ml雙抗空白培養(yǎng)基：4C保存。雙抗：-20 C保存，100ml/