不同劑量博萊霉素致小鼠肺纖維化模型的比較_陶章

1、基礎醫(yī)學 中國組織工程研究與臨床康復 第13卷 第7期 20090212出版 Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research February 12, 2009 Vol.13, No.7不同劑量博萊霉素致小鼠肺纖維化模型的比較*陶 章，李惠萍Comparison of mouse pulmonary fibrosis models induced by bleomycin at different doses Tao Zhang, Li Hui-pingRespiratoryDepartment,Shanghai P

2、ulmonaryHospital, TongjiUniversity, Shanghai200433, ChinaTao Zhang, MasterResident physician,RespiratoryDepartment,Shanghai PulmonaryHospital, TongjiUniversity, Shanghai200433, ChinaCorrespondence to:Li Hui-ping, Chiefphysician, Professor,Doctoral supervisor,RespiratoryDepartment,Affiliated Shanghai

3、Pulmonary Hospital,Tongji University,Shanghai 200433,ChinaLihuiping1958Supported by: TheNational NaturalScience Foundationof China,No.30671996*;InternationalCooperation Projectof ShanghaiMunicipal Scienceand TechnologyCommission, No.044107050*;Scientific ResearchFund Project ofShanghai MunicipalScie

4、nce andTechnologyCommission, No.064107050*; Projectof ShanghaiExcellent DeciplineLeader in 2008, No.08XD1403400*Received: 2008-06-25Accepted: 2008-10-01Abstract Tao Z, Li HP. Comparison of mouse pulmonary fibrosis models induced by bleomycin at different doses.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linc

5、huang Kangfu. 2009;13(7): 1214-1218(China) 摘要陶章，李惠萍. 不同劑量博萊霉素致小鼠肺纖維化模型的比較J.中國組織工程研究與臨床康復，2009，13(7):1214-1218 P.O. Box 1200, Shenyang 110004 1214陶章，等. 不同劑量博萊霉素致小鼠肺纖維化模型的比較www.CRTER.org0 引言特發(fā)性肺間質纖維化(Idiopathic pulmo-nary fibrosis，IPF)發(fā)病機制尚不清，病死率高，目前缺乏有效藥物1。建立穩(wěn)定而可靠的肺間質纖維化動物模型是探索其發(fā)病機

6、制和開發(fā)有效治療藥物的重要保障。目前用于肺纖維化動物模型所采用的動物主要是嚙齒類動物，如小鼠、大鼠、倉鼠、兔等2-5，也有選用較大體形的犬、貓、羊、豬等；肺纖維化誘導劑主要包括博萊霉素(Bleomycin，BLM)、胺碘酮、百草枯、石棉、二氧化硅、放射線、高濃度氧、野百合堿、呼吸道腸道病毒等，其中尤以博萊霉素使用最為廣泛。目前常用的肺纖維化動物模型是用博萊霉素經氣管內給藥來制作。博萊霉素是從輪生鏈霉菌中提取的一種抗腫瘤藥物，國產平陽霉素是其單體，毒性小于博萊霉素。它們的毒副作用之一是引起肺纖維化，用博萊霉素制作的肺纖維化模型，其病理組織學和生理學改變與人類肺纖維化近似，因此成為肺纖維化造模的常

7、用藥物。不同的動物種屬對博萊霉素的反應不同，例如，大鼠常用劑量多為5 mg/kg6-7，兔的常用劑量為8 mg/kg8，而用小鼠制作動物模型則博萊霉素劑量差距很大10 mg/kg13-149-12格證號SCXK滬2007-0005)。實驗過程中對動物的處置符合中華人民共和國科學技術部2006年頒布的關于善待實驗動物的指導性意見標準21。主要試劑及儀器 注射用鹽酸博萊霉素，15 mg 規(guī)格：速眠新注射液，規(guī)格：101.5 mL 羥脯氨酸檢測試劑盒細胞培養(yǎng)箱超凈工作臺 臺式高速離心機倒置相差顯微鏡石蠟切片機(Leitz 1512) 光學顯微鏡及成像系統(tǒng)(BX51型)來源日本化藥株式會社解放軍軍事醫(yī)

8、學科學院軍事 獸醫(yī)研究所，長春 南京建成生物工程研究所 HERA cellAIR TECH，蘇凈集團 Centrifuge 5810R Olympus CK 40 德國Leitz公司 日本Olympus公司實驗過程：實驗造模及分組干預：同濟大學附屬上海市肺科醫(yī)院呼吸科，上海市200433陶 章，男，1978年生，安徽省宿州市人，漢族，碩士，醫(yī)師，主要從事間質性肺病的研究。 taozhang1978通訊作者：李惠萍，主任醫(yī)師，教授，博士生導師，同濟大學附屬上海市肺科醫(yī)院呼吸科，上海市200433lihuiping1958國家自然科學基金資助項目(30671996)*；上海市科委國際合作項目(04

9、41070 50)*；上海市科委科研基金資助項目(064107050)*；2008優(yōu)秀學科帶頭人計劃(08XD 1403400) *中圖分類號:R322 文獻標識碼:B文章編號:1673-8225(2009)07-01214-05收稿日期：2008-06-25 修回日期：2008-10-01 (54200806240021/ WLS)，最大劑量為15，最小劑量為0.01 mg/kg，使16-18用最多的劑量為5 mg/kg8 mg/kg19-20。本科在既往研究中使用的博萊霉素劑量是，發(fā)現(xiàn)模型小鼠死亡率較高，嚴重影響動物實驗的順利進行。分析原因之一可能與博萊霉素劑量過大有關。為了保證動物模型的

10、穩(wěn)定性和可靠性，實驗嘗試了幾種不同劑量的博萊霉素制作小鼠肺纖維化模型，以期篩選出既能成功地制作小鼠肺纖維化模型，又不至于導致過高死亡率的一種最佳的博萊霉素造模劑量。1 材料和方法設計：隨機對照動物實驗。時間及地點：實驗于2007-09/2008-04在上海市發(fā)育生物學重點實驗室完成。材料：SPF級健康雌性C57BL/6J小鼠60只，體質量1822 g，平均20 g，8周齡，購自上海市中國科學院實驗動物中心(動物合ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH在小鼠氣管內注射博萊小鼠28 d 內死亡情況：霉素或生理鹽水后，每日上午9點、下午5點觀察小鼠的死亡情

11、況，記錄小鼠的死亡時間，觀察到第28天，計算死亡率和中位生存時間。小鼠肺組織病理學檢查：造模后第28天，隨機分3批麻醉，腹主動脈放血處死動物，分離左側肺臟，注入體積分數(shù)為0.1的甲醛1.0 mL，固定24 h，常規(guī)脫水、石蠟包埋后，切片(6 m)， 行蘇木精-伊紅染色，光鏡下觀察肺組織炎癥及纖維化情況。1215www.CRTER.org陶章，等. 不同劑量博萊霉素致小鼠肺纖維化模型的比較實驗第28天肺組織羥脯氨酸含量測定：肺組織羥脯氨14，28 d 死亡率和實驗28 d 時的中位生存時間，見表1。酸含量的測定按照試劑盒要求進行，具體步驟如下：稱取濕質量為50100 mg 的肺組織；剪碎后放入帶

12、蓋試管，加1 mL水解液，加蓋后混勻，沸水浴水解20 min；試管經流水冷卻后加指示劑1滴，搖勻；加入pH甲液1 mL至溶液變紅，混勻；逐滴加入調pH乙液，直至液體顏色變成黃綠色；加蒸餾水至10 mL，混勻；取4 mL 液體放入離心管，加適量活性炭，混勻，3 500 r/min 離心10 min，取上清1 mL加入另一個離心管(空白管和標準管分別加入蒸餾水或5 mg/L標準液各1 mL)；加試劑一0.5 mL后混勻，靜置10 min；加試劑二0.5 mL后混勻，靜置5 min；加試劑三0.5 mL，混勻后60 水浴15 min；冷卻后3 500 r/min 離心10 min，取上清在550 n

13、m處，1 cm光徑，蒸餾水調零，測吸光度(A)值；記錄各管吸光度后按公式計算各肺組織羥脯氨酸含量。羥脯氨酸(mg/g)=(測定管吸光度空白管吸光度)/(標準管吸光 度空白管吸光度)標準管含量(5 mg/L)水解液總體積 (10 mL)/ 組織濕質量(mg)肺組織纖維化程度的判定：按Szapiel等22的方法評2.3 肺臟大體觀察結果價肺組織病理變化嚴重程度，具體分級標準如下：主要觀察指標：小鼠死亡數(shù)量，28 d 后小鼠肺組織羥脯氨酸含量，肺組織纖維化程度。設計、實施、評估者：實驗設計及評估為第二作者，干預實施為第一作者，經過正規(guī)培訓，采用盲法評估。統(tǒng)計學分析：由第一作者采用SPSS 13.0軟

14、件完成統(tǒng)計處理，計量資料以xs表示，多個樣本率的比較采用2檢驗，對照組和博萊霉素組羥脯氨酸含量比較采用Kruskal-Wallis H檢驗，對照組和博萊霉素不同劑量組羥脯氨酸含量的組間兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗，P 0.05)，但從原始數(shù)據(jù)分析， 5 mg/kg博萊霉素組死亡率超過90%，明顯高于 3.5 mg/kg博萊霉素組和2 mg/kg博萊霉素組，如此之高的死亡率使得實驗將無法進行，因此該劑量不適合小鼠的造模。博萊霉素組間比較死亡率差異亦無顯著性意義(P 0.05)，可能與樣本太少有關，但從數(shù)字上可看出，博萊霉素劑量越高，死亡率越高。從各組肺臟大體標本觀察結果、肺組織病

15、理標本纖維化程度和各組小鼠肺組織中羥脯氨酸含量來看，博萊霉素劑量越高，肺纖維化程度越重，以5 mg/kg 博萊霉素組最明顯。綜上所述，博萊霉素劑量越大，小鼠肺纖維化程度越高，28 d 死亡率也最高；而博萊霉素劑量越低，則小鼠肺纖維化程度越低，存活率越高。平衡造模效果和動物存活率，認為經氣管內注射博萊霉素3.5 mg/kg 是較為理想的博萊霉素制作小鼠肺纖維化模型的劑Figure 1 The pulmonary pathological changes of the mice inthe bleomycin and control groups (Hematoxy-lin-eosin stain

16、ing, 100)圖1 各組小鼠第28天肺組織的變化(蘇木精-伊紅染色，100)5 mg/kg 博萊霉素組因小鼠存活數(shù)量太少不做統(tǒng)計分析，表3可見，各組小鼠肺組織中羥脯氨酸含量從高到低依次為5 mg/kg 博萊霉素組(1只小鼠，肺組織羥脯氨酸含量為0.660 mg/g)、3.5 mg/kg 博萊霉素組、 量。ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH1217www.CRTER.org陶章，等. 不同劑量博萊霉素致小鼠肺纖維化模型的比較4 參考文獻 1Duan BX,Huang RY,Chu YL. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yan

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