不同劑量博萊霉素致小鼠肺纖維化模型的比較_陶章

1、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué) 中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù) 第13卷 第7期 20090212出版 Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research February 12, 2009 Vol.13, No.7不同劑量博萊霉素致小鼠肺纖維化模型的比較*陶 章，李惠萍Comparison of mouse pulmonary fibrosis models induced by bleomycin at different doses Tao Zhang, Li Hui-pingRespiratoryDepartment,Shanghai P

2、ulmonaryHospital, TongjiUniversity, Shanghai200433, ChinaTao Zhang, MasterResident physician,RespiratoryDepartment,Shanghai PulmonaryHospital, TongjiUniversity, Shanghai200433, ChinaCorrespondence to:Li Hui-ping, Chiefphysician, Professor,Doctoral supervisor,RespiratoryDepartment,Affiliated Shanghai

3、Pulmonary Hospital,Tongji University,Shanghai 200433,ChinaLihuiping1958Supported by: TheNational NaturalScience Foundationof China,No.30671996*;InternationalCooperation Projectof ShanghaiMunicipal Scienceand TechnologyCommission, No.044107050*;Scientific ResearchFund Project ofShanghai MunicipalScie

4、nce andTechnologyCommission, No.064107050*; Projectof ShanghaiExcellent DeciplineLeader in 2008, No.08XD1403400*Received: 2008-06-25Accepted: 2008-10-01Abstract Tao Z, Li HP. Comparison of mouse pulmonary fibrosis models induced by bleomycin at different doses.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linc

5、huang Kangfu. 2009;13(7): 1214-1218(China) 摘要陶章，李惠萍. 不同劑量博萊霉素致小鼠肺纖維化模型的比較J.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2009，13(7):1214-1218 P.O. Box 1200, Shenyang 110004 1214陶章，等. 不同劑量博萊霉素致小鼠肺纖維化模型的比較www.CRTER.org0 引言特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化(Idiopathic pulmo-nary fibrosis，IPF)發(fā)病機(jī)制尚不清，病死率高，目前缺乏有效藥物1。建立穩(wěn)定而可靠的肺間質(zhì)纖維化動(dòng)物模型是探索其發(fā)病機(jī)

6、制和開(kāi)發(fā)有效治療藥物的重要保障。目前用于肺纖維化動(dòng)物模型所采用的動(dòng)物主要是嚙齒類動(dòng)物，如小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、兔等2-5，也有選用較大體形的犬、貓、羊、豬等；肺纖維化誘導(dǎo)劑主要包括博萊霉素(Bleomycin，BLM)、胺碘酮、百草枯、石棉、二氧化硅、放射線、高濃度氧、野百合堿、呼吸道腸道病毒等，其中尤以博萊霉素使用最為廣泛。目前常用的肺纖維化動(dòng)物模型是用博萊霉素經(jīng)氣管內(nèi)給藥來(lái)制作。博萊霉素是從輪生鏈霉菌中提取的一種抗腫瘤藥物，國(guó)產(chǎn)平陽(yáng)霉素是其單體，毒性小于博萊霉素。它們的毒副作用之一是引起肺纖維化，用博萊霉素制作的肺纖維化模型，其病理組織學(xué)和生理學(xué)改變與人類肺纖維化近似，因此成為肺纖維化造模的常

7、用藥物。不同的動(dòng)物種屬對(duì)博萊霉素的反應(yīng)不同，例如，大鼠常用劑量多為5 mg/kg6-7，兔的常用劑量為8 mg/kg8，而用小鼠制作動(dòng)物模型則博萊霉素劑量差距很大10 mg/kg13-149-12格證號(hào)SCXK滬2007-0005)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部2006年頒布的關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)21。主要試劑及儀器 注射用鹽酸博萊霉素，15 mg 規(guī)格：速眠新注射液，規(guī)格：101.5 mL 羥脯氨酸檢測(cè)試劑盒細(xì)胞培養(yǎng)箱超凈工作臺(tái) 臺(tái)式高速離心機(jī)倒置相差顯微鏡石蠟切片機(jī)(Leitz 1512) 光學(xué)顯微鏡及成像系統(tǒng)(BX51型)來(lái)源日本化藥株式會(huì)社解放軍軍事醫(yī)

8、學(xué)科學(xué)院軍事 獸醫(yī)研究所，長(zhǎng)春 南京建成生物工程研究所 HERA cellAIR TECH，蘇凈集團(tuán) Centrifuge 5810R Olympus CK 40 德國(guó)Leitz公司 日本Olympus公司實(shí)驗(yàn)過(guò)程：實(shí)驗(yàn)造模及分組干預(yù)：同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院呼吸科，上海市200433陶 章，男，1978年生，安徽省宿州市人，漢族，碩士，醫(yī)師，主要從事間質(zhì)性肺病的研究。 taozhang1978通訊作者：李惠萍，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院呼吸科，上海市200433lihuiping1958國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30671996)*；上海市科委國(guó)際合作項(xiàng)目(04

9、41070 50)*；上海市科委科研基金資助項(xiàng)目(064107050)*；2008優(yōu)秀學(xué)科帶頭人計(jì)劃(08XD 1403400) *中圖分類號(hào):R322 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:B文章編號(hào):1673-8225(2009)07-01214-05收稿日期：2008-06-25 修回日期：2008-10-01 (54200806240021/ WLS)，最大劑量為15，最小劑量為0.01 mg/kg，使16-18用最多的劑量為5 mg/kg8 mg/kg19-20。本科在既往研究中使用的博萊霉素劑量是，發(fā)現(xiàn)模型小鼠死亡率較高，嚴(yán)重影響動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。分析原因之一可能與博萊霉素劑量過(guò)大有關(guān)。為了保證動(dòng)物模型的

10、穩(wěn)定性和可靠性，實(shí)驗(yàn)嘗試了幾種不同劑量的博萊霉素制作小鼠肺纖維化模型，以期篩選出既能成功地制作小鼠肺纖維化模型，又不至于導(dǎo)致過(guò)高死亡率的一種最佳的博萊霉素造模劑量。1 材料和方法設(shè)計(jì)：隨機(jī)對(duì)照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。時(shí)間及地點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)于2007-09/2008-04在上海市發(fā)育生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。材料：SPF級(jí)健康雌性C57BL/6J小鼠60只，體質(zhì)量1822 g，平均20 g，8周齡，購(gòu)自上海市中國(guó)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(動(dòng)物合ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH在小鼠氣管內(nèi)注射博萊小鼠28 d 內(nèi)死亡情況：霉素或生理鹽水后，每日上午9點(diǎn)、下午5點(diǎn)觀察小鼠的死亡情

11、況，記錄小鼠的死亡時(shí)間，觀察到第28天，計(jì)算死亡率和中位生存時(shí)間。小鼠肺組織病理學(xué)檢查：造模后第28天，隨機(jī)分3批麻醉，腹主動(dòng)脈放血處死動(dòng)物，分離左側(cè)肺臟，注入體積分?jǐn)?shù)為0.1的甲醛1.0 mL，固定24 h，常規(guī)脫水、石蠟包埋后，切片(6 m)， 行蘇木精-伊紅染色，光鏡下觀察肺組織炎癥及纖維化情況。1215www.CRTER.org陶章，等. 不同劑量博萊霉素致小鼠肺纖維化模型的比較實(shí)驗(yàn)第28天肺組織羥脯氨酸含量測(cè)定：肺組織羥脯氨14，28 d 死亡率和實(shí)驗(yàn)28 d 時(shí)的中位生存時(shí)間，見(jiàn)表1。酸含量的測(cè)定按照試劑盒要求進(jìn)行，具體步驟如下：稱取濕質(zhì)量為50100 mg 的肺組織；剪碎后放入帶

12、蓋試管，加1 mL水解液，加蓋后混勻，沸水浴水解20 min；試管經(jīng)流水冷卻后加指示劑1滴，搖勻；加入pH甲液1 mL至溶液變紅，混勻；逐滴加入調(diào)pH乙液，直至液體顏色變成黃綠色；加蒸餾水至10 mL，混勻；取4 mL 液體放入離心管，加適量活性炭，混勻，3 500 r/min 離心10 min，取上清1 mL加入另一個(gè)離心管(空白管和標(biāo)準(zhǔn)管分別加入蒸餾水或5 mg/L標(biāo)準(zhǔn)液各1 mL)；加試劑一0.5 mL后混勻，靜置10 min；加試劑二0.5 mL后混勻，靜置5 min；加試劑三0.5 mL，混勻后60 水浴15 min；冷卻后3 500 r/min 離心10 min，取上清在550 n

13、m處，1 cm光徑，蒸餾水調(diào)零，測(cè)吸光度(A)值；記錄各管吸光度后按公式計(jì)算各肺組織羥脯氨酸含量。羥脯氨酸(mg/g)=(測(cè)定管吸光度空白管吸光度)/(標(biāo)準(zhǔn)管吸光 度空白管吸光度)標(biāo)準(zhǔn)管含量(5 mg/L)水解液總體積 (10 mL)/ 組織濕質(zhì)量(mg)肺組織纖維化程度的判定：按Szapiel等22的方法評(píng)2.3 肺臟大體觀察結(jié)果價(jià)肺組織病理變化嚴(yán)重程度，具體分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下：主要觀察指標(biāo)：小鼠死亡數(shù)量，28 d 后小鼠肺組織羥脯氨酸含量，肺組織纖維化程度。設(shè)計(jì)、實(shí)施、評(píng)估者：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及評(píng)估為第二作者，干預(yù)實(shí)施為第一作者，經(jīng)過(guò)正規(guī)培訓(xùn)，采用盲法評(píng)估。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：由第一作者采用SPSS 13.0軟

14、件完成統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料以xs表示，多個(gè)樣本率的比較采用2檢驗(yàn)，對(duì)照組和博萊霉素組羥脯氨酸含量比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，對(duì)照組和博萊霉素不同劑量組羥脯氨酸含量的組間兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，P 0.05)，但從原始數(shù)據(jù)分析， 5 mg/kg博萊霉素組死亡率超過(guò)90%，明顯高于 3.5 mg/kg博萊霉素組和2 mg/kg博萊霉素組，如此之高的死亡率使得實(shí)驗(yàn)將無(wú)法進(jìn)行，因此該劑量不適合小鼠的造模。博萊霉素組間比較死亡率差異亦無(wú)顯著性意義(P 0.05)，可能與樣本太少有關(guān)，但從數(shù)字上可看出，博萊霉素劑量越高，死亡率越高。從各組肺臟大體標(biāo)本觀察結(jié)果、肺組織病

15、理標(biāo)本纖維化程度和各組小鼠肺組織中羥脯氨酸含量來(lái)看，博萊霉素劑量越高，肺纖維化程度越重，以5 mg/kg 博萊霉素組最明顯。綜上所述，博萊霉素劑量越大，小鼠肺纖維化程度越高，28 d 死亡率也最高；而博萊霉素劑量越低，則小鼠肺纖維化程度越低，存活率越高。平衡造模效果和動(dòng)物存活率，認(rèn)為經(jīng)氣管內(nèi)注射博萊霉素3.5 mg/kg 是較為理想的博萊霉素制作小鼠肺纖維化模型的劑Figure 1 The pulmonary pathological changes of the mice inthe bleomycin and control groups (Hematoxy-lin-eosin stain

16、ing, 100)圖1 各組小鼠第28天肺組織的變化(蘇木精-伊紅染色，100)5 mg/kg 博萊霉素組因小鼠存活數(shù)量太少不做統(tǒng)計(jì)分析，表3可見(jiàn)，各組小鼠肺組織中羥脯氨酸含量從高到低依次為5 mg/kg 博萊霉素組(1只小鼠，肺組織羥脯氨酸含量為0.660 mg/g)、3.5 mg/kg 博萊霉素組、 量。ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH1217www.CRTER.org陶章，等. 不同劑量博萊霉素致小鼠肺纖維化模型的比較4 參考文獻(xiàn) 1Duan BX,Huang RY,Chu YL. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yan

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