同時(shí)檢測(cè)恩諾沙星和環(huán)丙沙星單克隆抗體的制備

1、205生物工程食品科學(xué)2010, Vol. 31, No. 13同時(shí)檢測(cè)恩諾沙星和環(huán)丙沙星單克隆抗體的制備郭杰標(biāo)，許 楊*，劉師文(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047摘要：為了產(chǎn)生同時(shí)檢測(cè)恩諾沙星和環(huán)丙沙星的抗體，本研究采用戊二醛法制備突出恩諾沙星和環(huán)丙沙星共同結(jié)構(gòu)的人工抗原。免疫Balb/c小鼠的結(jié)果顯示：使用糖基化載體所制備的免疫抗原，能夠大幅提高所產(chǎn)生特異性抗體的滴度。通過(guò)細(xì)胞融合，篩選出一株對(duì)恩諾沙星和環(huán)丙沙星IC 50值分別為9.6ng/mL和10.2ng/mL的單克隆抗體。關(guān)鍵詞：恩諾沙星；環(huán)丙沙星；糖基化載體；獸藥殘留；人工抗原；免疫

2、效果Preparation of Monoclonal Antibody for Simultaneous Detection of Enrofloxacin and CiprofloxacinGUO Jie-biao，XU Yang*，LIU Shi-wen(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Sino-German Joint Research Institute,Nanchang University, Nanchang 330047, ChinaAbstract ：In order to generate a mon

3、oclonal antibody with specificity to simultaneously detect enrofloxacin and ciprofloxacin,glutaraldehyde was used to prepare the artificial antigens with common structures of enrofloxacin and ciprofloxacinexposed as the major epitopes. Balb/c mice were immunized with the prepared immunogens. Results

4、 indicated thatglycosylated BSA used for immunogen synthesis resulted in a higher antiserum titer when compared to unglycosylatedBSA. A monoclonal antibody with respective IC50 values of 9.6 ng/mL and 10.2 ng/mL to enrofloxacin and ciprofloxacinwas successfully prepared through cell fusion.Key words

5、：enrofloxacin ；ciprofloxacin ；glycosylated carrier；veterinary drug residues；artificial antigen；immunological effect中圖分類號(hào)：R392.11；R446.61 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1002-6630(201013-0205-04收稿日期：2009-12-14基金項(xiàng)目：江西省社會(huì)發(fā)展科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(2007BS12501作者簡(jiǎn)介：郭杰標(biāo)(1971 ，男，博士研究生，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。E-mail ：sgyuanyuan*通信作者：許楊(1951 ，女，教授，博士，研究

6、方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。E-mail ：xuyang1951氟喹諾酮是一類強(qiáng)效、廣譜的合成抗菌素，通過(guò)抑制細(xì)菌DNA 解旋酶發(fā)揮抗菌效力1。這類藥物在畜牧、水產(chǎn)業(yè)被廣泛應(yīng)用治療和預(yù)防細(xì)菌感染，并作為飼料添加劑促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)2。恩諾沙星是獸藥領(lǐng)域最常用的氟喹諾酮藥物，我國(guó)制定了在食品中恩諾沙星及其代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星的總殘留限量標(biāo)準(zhǔn)(MRLs，以避免這兩種藥物在食品中的殘留所造成的細(xì)菌耐藥性和過(guò)敏反應(yīng)等健康危害。目前，檢測(cè)食品中恩諾沙星及環(huán)丙沙星總殘留量的主要微生物法1和儀器學(xué)方法，包括液相色譜和液相色譜-質(zhì)譜3-6，毛細(xì)管電泳7等。微生物法檢測(cè)周期長(zhǎng)，而儀器學(xué)方法需要昂貴的設(shè)備且運(yùn)行費(fèi)用高，難以在基

7、層檢測(cè)部門廣泛推廣。檢測(cè)一種氟喹諾酮藥物8-10和檢測(cè)氟喹諾酮藥物總量11-13的免疫學(xué)方法已有報(bào)道，但是同時(shí)檢測(cè)食品中恩諾沙星及環(huán)丙沙星總殘留量的免疫學(xué)法還有待開(kāi)發(fā)。恩諾沙星和環(huán)丙沙星的分子結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1，本研究采用環(huán)丙沙星作為代表半抗原制備人工抗原，并將其免疫動(dòng)物，獲得針對(duì)恩諾沙星和環(huán)丙沙星的抗體，為建立同時(shí)檢測(cè)這兩種藥品總殘留量的免疫學(xué)快速檢測(cè)方法提供條件。圖1恩諾沙星和環(huán)丙沙星的分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 Molecular structures of enrofloxacin and ciprofloxacinF OCOOHC 2H 5F OCOOHH 恩諾沙星環(huán)丙沙星2010, Vol.

8、31, No. 13食品科學(xué)生物工程2061材料與方法1.1材料、試劑與儀器恩諾沙星和環(huán)丙沙星 中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；弗氏完全(不完全 佐劑、戊二醛、葡萄糖、乳糖、牛血清白蛋白(BSA、卵清白蛋白(OVA 上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；山羊抗鼠IgG-HRP 酶標(biāo)二抗 GeneTex 公司；96孔酶標(biāo)板 Costar公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。Ultrospec 紫外-可見(jiàn)光掃描儀 美國(guó)安瑪西亞公司；Multiskan MCC/340酶標(biāo)儀 Labsystems公司。1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Balb/c小鼠(雌性，4周齡 購(gòu)自南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(批準(zhǔn)號(hào)為：贛(動(dòng)96-021 。1.3方法1.

9、3.1 糖基化牛血清白蛋白的制備14 葡萄糖、乳糖和載體蛋白按照20:20:1的物質(zhì)的量比混合，調(diào)節(jié)至pH9.5，在4042振蕩2h ，使還原糖上的醛基與蛋白質(zhì)的氨基發(fā)生偶聯(lián)，完成對(duì)載體蛋白的牛血清白蛋白糖基化修飾。1.3.2環(huán)丙沙星免疫抗原的制備把糖基化BSA 的質(zhì)量濃度固定為2mg/mL，戊二醛投料質(zhì)量濃度固定為60.6g/mL，環(huán)丙沙星投料質(zhì)量濃度分別為0.85、1.06、1.27mg/mL。調(diào)節(jié)pH9.5在25振蕩12h ，合成3種不同偶聯(lián)比的環(huán)丙沙星免疫抗原。用0.05mol/L PBS(pH7.4透析3d ，備用。1.3.3環(huán)丙沙星檢測(cè)抗原的制備OVA 的質(zhì)量濃度為2mg/mL，戊

10、二醛的投料質(zhì)量濃度為44.4g/mL，環(huán)丙沙星的投料質(zhì)量濃度0.62mg/mL。調(diào)節(jié)pH9.5在25振蕩12h ，合成環(huán)丙沙星檢測(cè)抗原。用0.05mol/L PBS (pH7.4透析3d ，備用。1.3.4環(huán)丙沙星人工抗原偶聯(lián)比例的計(jì)算環(huán)丙沙星區(qū)別于載體蛋白的特征吸收波長(zhǎng)為340nm ，在該波長(zhǎng)下的摩爾消光系數(shù)K =4.5mL/mg，人工抗原蛋白濃度的測(cè)定使用雙縮脲法15。(OD340nm /K /環(huán)丙沙星摩爾質(zhì)量環(huán)丙沙星人工抗原偶聯(lián)比= 載體蛋白質(zhì)量濃度/蛋白質(zhì)摩爾質(zhì)量1.3.5小鼠免疫取4周齡的雌性Balb/c小鼠，以100g/只的抗原劑量，加完全佐劑充分乳化后，皮下多點(diǎn)初次免疫。28d

11、后，以不完全佐劑乳化抗原以加強(qiáng)免疫。之后每21d ，以同樣的方法進(jìn)行加強(qiáng)免疫。對(duì)照組采用非糖基化載體制備的免疫抗原進(jìn)行免疫。1.3.6抗體效價(jià)檢測(cè)參照Guo 等16的方法，分別采用間接ELISA 和間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA ，測(cè)定免疫后小鼠血清的抗體效價(jià)和抗體對(duì)環(huán)丙沙星的特異性。1.3.7單克隆抗體篩選與鑒定參照Guo 等16的方法，篩選得到分泌抗環(huán)丙沙星單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。并用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA 對(duì)所獲得抗體的特性進(jìn)行鑒定。2結(jié)果與分析2.1人工抗原的合成環(huán)丙沙星人工抗原的制備原理見(jiàn)圖2。戊二醛是雙功能試劑，通過(guò)和蛋白質(zhì)上的氨基和環(huán)丙沙星哌嗪環(huán)上的亞氨基反應(yīng)，可以實(shí)現(xiàn)環(huán)丙沙星和載體蛋白之間連接

12、，使恩諾沙星和環(huán)丙沙星的共同結(jié)構(gòu)暴露在人工抗原的外部，成為主要的抗原位點(diǎn)。環(huán)丙沙星人工抗原的連接效果，用紫外掃描圖譜進(jìn)行評(píng)價(jià)(圖3 。按照1.3.2節(jié)制備的3種環(huán)丙沙星免疫抗原，經(jīng)檢測(cè)偶聯(lián)比分別為6.3:1、7.2:1和8.3:1。按照1.3.3節(jié)制備的環(huán)丙沙星檢測(cè)抗原，經(jīng)檢測(cè)偶聯(lián)比為2.4:1。圖3載體蛋白、環(huán)丙沙星和環(huán)丙沙星免疫抗原溶液的紫外掃描圖譜Fig.3 UV absorption spectra of glycosylated BSA, ciprofloxacin andciprofloxacin immunogen2.52.01.51.00.50載體蛋白O D 340n m波長(zhǎng)/

13、nm200240280320360環(huán)丙沙星環(huán)丙沙星免疫抗原圖2人工抗原的合成Fig.2 Synthesis route of artificial antigenHOH HFOCOOH207生物工程食品科學(xué)2010, Vol. 31, No. 13戊二醛是很活潑的連接劑，很容易與蛋白質(zhì)的氨基反應(yīng)造成蛋白質(zhì)聚集。圖4是分別以糖基化載體和天然載體制備的環(huán)丙沙星抗原免疫的SDS PAGE圖譜。泳道3顯示，使用天然B SA 制備的免疫抗原，在戊二醛作用下造成了載體蛋白蛋白的聚集。 葡萄糖、乳糖是還原糖，分子結(jié)構(gòu)中含有醛基，在偏堿性條件葡萄糖和乳糖會(huì)與BSA 上的氨基縮合，把蛋白上的氨基封閉。泳道4顯示

14、，經(jīng)過(guò)糖基化BSA 分子質(zhì)量比天然BSA(泳道2 增大。泳道5顯示，以糖基化BSA 為載體制備的環(huán)丙沙星免疫抗原，由戊二醛導(dǎo)致的蛋白質(zhì)聚集現(xiàn)象得到了避免。由此可見(jiàn)，使用糖基化載體制備環(huán)丙沙星免疫抗原，由于載體蛋白上的氨基數(shù)量減少，能夠避免載體蛋白的聚集，同時(shí)增加環(huán)丙沙星免疫抗原的分子質(zhì)量。2.2免疫小鼠效果本研究使用糖基化BSA 為載體，如1.3.2節(jié)合成的3種偶聯(lián)比的糖基化環(huán)丙沙星免疫抗原。前期合成的以天然BSA 為載體制備環(huán)丙沙星免疫抗原中，免疫動(dòng)物效果最好的是偶聯(lián)比為9.1:1的抗原。本實(shí)驗(yàn)以天然BSA為載體制備的環(huán)丙沙星免疫抗原作對(duì)照，評(píng)價(jià)3種糖基化環(huán)丙沙星抗原免疫小鼠的效果。4種抗原

15、免疫小鼠后抗體效價(jià)的上升曲線見(jiàn)圖5。結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用糖基化BSA 為載體制備的3種免疫抗原，比對(duì)照抗原誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗環(huán)丙沙星特異性抗體的能力要強(qiáng)很多。2.3單克隆抗體的篩選與鑒定本實(shí)驗(yàn)使用免疫效果最好的糖基化免疫抗原，在第4次免疫之后獲得了較高的抗體效價(jià)。通過(guò)細(xì)胞融合，順利獲得了檢測(cè)環(huán)丙沙星及其代謝前體恩諾沙星的單克隆抗體(1G3。經(jīng)用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA 進(jìn)行鑒定，該抗體對(duì)這兩種藥品的IC 50值分別為9.6ng/mL和10.2ng/mL，靈敏度和特異性能夠滿足同時(shí)檢測(cè)這兩種藥品在食品中的殘留的需要。3討論環(huán)丙沙星是小分子物質(zhì)，沒(méi)有免疫原性，必須與載體蛋白偶聯(lián)后才可以免疫動(dòng)物產(chǎn)生抗體。經(jīng)過(guò)分析和比

16、較，發(fā)現(xiàn)把環(huán)丙沙星分子中哌嗪環(huán)上的亞氨基作為連接位點(diǎn)制備的人工抗原，有利于獲得針對(duì)恩諾沙星和環(huán)丙沙星共同結(jié)構(gòu)的抗體。有文獻(xiàn)報(bào)道，制備人工抗原的連接臂的最適長(zhǎng)度在36個(gè)碳原子，連接臂太短不利于半抗原的充分暴露，而連接臂太長(zhǎng)又會(huì)造成折疊導(dǎo)致半抗原分子被載體蛋白掩蓋不利于產(chǎn)生抗體17，戊二醛作為連接手臂正好符合36個(gè)碳原子的條件。戊二醛在堿性條件下可以與氨基或亞氨基縮合，能夠把環(huán)丙沙星上的亞氨基連接到蛋白載體上。戊二醛是很活潑的連接劑，很容易與蛋白質(zhì)的氨基反應(yīng)造成蛋白質(zhì)聚集。使用糖基化載體制備免疫抗原，能夠避免載體蛋白的聚集，同時(shí)增加環(huán)丙沙星免疫抗原的分子質(zhì)量和免疫原性。通過(guò)免疫動(dòng)物和細(xì)胞融合，篩選

17、出了一株對(duì)恩諾沙星和環(huán)丙沙星IC 50值分別為9.6ng/mL和10.2ng/mL的單克隆抗體，為建立同時(shí)檢測(cè)這兩種藥品總殘留量的免疫學(xué)快速檢測(cè)方法提供了條件。參考文獻(xiàn)：1ASHWIN H, STEAD S, CALDOW M, et al. A rapid microbial inhibition-based screening strategy for uoroquinolone and quinoloneresidues in foods of animal originJ. Anal Chim Acta, 2009, 637(1:241-246.2Determination of da

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19、ker ；泳道2.BSA ；泳道3. 環(huán)丙沙星-BSA 免疫抗原；泳道4. 糖基化BSA ；泳道5. 環(huán)丙沙星-糖基化BSA 免疫抗原。圖4天然BSA 和糖基化BSA 制備的環(huán)丙沙星免疫抗原SDS PAGE圖譜Fig.4 SDS-PAGE patterns of ciprofloxacin immunogens prepared withnative BSA and glycosylated BSA97.2kD 1234566.7kD圖5糖基化載體和天然載體制備的抗原免疫小鼠的效果比較Fig.5 Comparison of antiserum titer induced by ciproflo

20、xacinimmunogens prepared with native BSA and glycosylated BSA140120100806040200糖基化載體 偶聯(lián)比6.3:1糖基化載體 偶聯(lián)比7.2:1糖基化載體 偶聯(lián)比8.3:1非糖基化載體 偶聯(lián)比9.1:1抗體效價(jià)(×103二次免疫三次免疫四次免疫2010, Vol. 31, No. 13食品科學(xué)生物工程208performance liquid chromatography with diode-array detection optimiza-tion and validationJ. J Chromatogr A

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23、ence detectionJ. J PharmBiomed Anal, 2004, 35(1: 143-153.7ZHOU Xiaoming, XING Da, ZHU Debin, et al. Development andapplication of a capillary electrophoresis-electrochemiluminescent method for the analysis of enrofoxacin and its metabolite cipro floxacin in milkJ. Talanta, 2008, 75(5: 1300-1306.8LU

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