染料木素影響MRSA蛋白表達(dá)的差異性分析及相關(guān)耐藥蛋白介導(dǎo)細(xì)菌耐藥的機(jī)制

1、染料木素影響MRS糜白表達(dá)的差異性分析及相關(guān)耐藥蛋白介導(dǎo)細(xì)菌耐藥的機(jī)制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA足醫(yī)院感染中最常見(jiàn)的致病菌之一,由于廣泛且不合理的使用抗生素，MRSA勺耐藥性問(wèn)題日益嚴(yán)重。已有的研究表明,MRSA勺主動(dòng)外排系統(tǒng)和生物被膜的形成是導(dǎo)致其產(chǎn)生多重耐藥的主要原因。其中,主動(dòng)外排系統(tǒng)和生物被膜的形成均與耐藥蛋白有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果也證明,染料木素中藥單體化合物能顯著抑制MRSAS白的表達(dá)量,由此推測(cè)其對(duì)MRS的抑制作用與蛋白有關(guān)，但關(guān)于染料木素作用MRS府，菌體蛋白的變化尚不清楚。因此，本文通過(guò)iTRAQ技術(shù)檢測(cè)了染料木素作用MRS質(zhì)菌體蛋白表達(dá)量的變化;并通過(guò)生物信息學(xué)

2、分析方法,對(duì)差異顯著的蛋白在分子功能、生物學(xué)進(jìn)程、所處細(xì)胞位置以及所參與的通路等方面的差異進(jìn)行系統(tǒng)的分析,進(jìn)而探討了耐藥相關(guān)蛋白在介導(dǎo)細(xì)菌耐藥方面的作用機(jī)制。具體的研究結(jié)果如下:(1)通過(guò)iTRAQ技術(shù)，檢測(cè)染料木素作用MRSAI菌體蛋白的表達(dá)差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,樣品共檢測(cè)到1312個(gè)蛋白,與對(duì)照組相比,差異顯著蛋白共有129個(gè),包括60個(gè)表達(dá)上調(diào)的蛋白和69個(gè)表達(dá)下調(diào)的蛋白;(2)通過(guò)qRT-PCR法，檢測(cè)了差異顯著的上調(diào)蛋白和下調(diào)蛋白的基因表達(dá)水平,以驗(yàn)證iTRAQ檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,下調(diào)蛋白PstB和PstC中的mRNA表達(dá)水平明顯降低,其基因表達(dá)量分別下降了5

3、1.6%和52.1%(P<0.01);上調(diào)蛋白SecYMip和RecT的mRNA勺表達(dá)量顯著性增加，與對(duì)照組相比，分別增加了77.2%、87.5%和90.1%(P<0.01)。基因表達(dá)水平與蛋白表達(dá)水平的變化趨勢(shì)完全一致，表明本研究的iTRAQ檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確, 可用于后續(xù)的生物信息學(xué)分析。通過(guò)GO KEG住口 String 方法,對(duì)染料木素作用MRSA1差異顯著蛋白表達(dá)的差異性進(jìn)行生物信息學(xué)分析。1)GO分析結(jié)果顯示,所檢測(cè)到的129個(gè)顯著性差異蛋白，主要參與10種生物學(xué)過(guò)程,按照基因所占比例的高低,這些差異顯著蛋白分別參與代謝(80%),細(xì)胞(65%)和單有機(jī)體(5

4、8%)等過(guò)程;主要分布在細(xì)胞(46%),細(xì)胞組分(44%),細(xì)胞膜(22%)等位置；分別執(zhí)行催化(63%),結(jié)合(44%)和轉(zhuǎn)運(yùn)(10%)等功能。2)KEGGffi路數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示,所檢測(cè)的129個(gè)差異顯著蛋白,參與的通路主要包括四大類,分別是代謝通路、遺傳信息處理通路、環(huán)境信息處理通路和一些未知的通路。其中,代謝通路所包含的差異蛋白數(shù)量有50個(gè);遺傳信息處理通路有17個(gè);環(huán)境信息處理通路所包含的差異蛋白有17個(gè);其他19個(gè)差異蛋白參與的通路尚不清楚。3)String分析結(jié)果顯示,129個(gè)差異顯著蛋白之間存在直接和間接的相互作用。有的差異蛋白連接密集,有的連接松散。其中,secY、rpsE

5、、isaB和PstB等蛋白與其它蛋白的相互作用關(guān)系5,它們是蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的中心節(jié)點(diǎn)，在蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、核糖體合成、細(xì)胞免疫以及細(xì)菌耐藥方面發(fā)揮重要作用。(4)對(duì)檢測(cè)出的129個(gè)差異顯著蛋白,通過(guò)分析其分子功能,得到與耐藥相關(guān)的蛋白,并對(duì)其介導(dǎo)細(xì)菌耐藥的機(jī)制進(jìn)行了探討。結(jié)果顯示,與細(xì)菌耐藥相關(guān)的蛋白約有14個(gè)，其中,PstB、PstC和PhoU等蛋白主要是通過(guò)主動(dòng)外排系統(tǒng)介導(dǎo)細(xì)菌耐藥;PstS、altA和sarR等蛋白主要通過(guò)促進(jìn)細(xì)菌生物被膜的形成介導(dǎo)細(xì)菌耐藥。(5)利用蓄積動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)、結(jié)晶紫半定量法和qRT-PCRfe對(duì)PstB和PstS蛋白介導(dǎo)細(xì)菌耐藥的機(jī)制進(jìn)行了驗(yàn)證。1)蓄積動(dòng)力學(xué)結(jié)果顯示

6、,Pst系統(tǒng)抑制劑維拉帕米作用MRSA4157菌體后，與對(duì)照組相比，菌體內(nèi)環(huán)內(nèi)沙星的蓄積量明顯升高。其中,100?g/ml的維拉帕米作用菌體12min后,環(huán)丙沙星的蓄積量比空白對(duì)照組增加了32%(P<0.01)。由于PstB是外排泵的組成蛋白,表明維拉帕米逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥可能與抑制PstB蛋白的表達(dá)有關(guān)。qRT-PCR吉果顯示，維拉帕米能抑制pstB基因的表達(dá)量。與對(duì)照組相比，100Ng/ml維拉帕米作用MRSA41577體16h后,pstB基因的表達(dá)量降低了89%(P<0.01)。表明維拉帕米可通過(guò)抑制pstB的mRNAfe達(dá)量來(lái)逆轉(zhuǎn)MRSA4157耐藥。2)結(jié)晶紫半定量結(jié)果顯示，維拉帕米對(duì)MRSA4157生物被膜的形成和成熟的生物被膜均有一定的抑制作用。與對(duì)照組相比，100Ng/ml的維拉帕米可使游離細(xì)菌和成熟生物被膜內(nèi)細(xì)菌的數(shù)量均減少約25%(P<0.05)。qRT-PCR吉果顯示，維拉帕米能抑制pstSmRNA的表達(dá)量。與對(duì)照組相比，100仙