小鼠肺腺癌動物模型的建立_趙振國_圖文

1、文章編號 : 1007-6611(2009 05-0408-03小鼠肺腺癌動物模型的建立趙振國 , 羅?？?, 輦偉奇 , 趙偉鵬 , 錢 莘 , 孫建國 , 段玉忠 , 朱 波 , 陳正堂 * (第三 軍醫(yī)大 學新橋醫(yī)院全軍腫瘤 研究所 , 重慶 400037; *通訊作者 , T e l E -m a i l :z h e n g t a n g c h e n ya h o o . c o m . c n 摘要 : 目的 通過建立小鼠肺腺癌動物模型 , 為下一步篩選肺腺 癌形成過 程中重要 m i R N A s 提供實 驗平臺 。 方法 采用 L o x

2、-s t o p -l o x K -r a s G 12D 小鼠鼻腔吸入 A d C r e 重組腺病毒的方法建立 小鼠肺 腺癌模 型 , 以 分散酶 和 型 膠原酶 酶解消 化模型 小鼠肺組織為單細胞懸液并以 免疫熒光染色的 方法檢 測其 C D 34、S c a -1的表達 情況 。 結果 通過 L o x -s t o p -l o xK -r a s G 12D 小鼠鼻腔滴入 A d C r e 成功建立 了小鼠肺腺癌模型 , 模型小鼠中 有 C D 34、S c a -1的表達 。 結論 成 功建立小鼠 肺腺癌 動物模 型 , 為后續(xù)篩選小鼠肺腺癌發(fā)展過程中重要 m i R N A

3、 提供了實驗基礎 。關鍵詞 :A d C r e ; L o x -s t o p -l o x K -r a s G 12D 小鼠 ; 肺腺癌 ; 動物模型中圖分類號 :R 734. 2 文獻標識碼 :AE s t a b l i s h m e n t o f am o u s e m o d e l o f p u l m o n a r y a d e n o c a r c i n o m aZ H A OZ h e n -g u o , L U OF u -k a n g , N I A NWe i -q i , Z H A OW e i -p e n g , Q I A NS h

4、 e n , S U NJ i a n -g u o , D U A NY u -z h o n g , Z H UB o , C H E NZ h e n g -t a n g *(C a n c e r C e n t e r o f P L A , X i n q i a oH o s p i t a l , T h i r dM i l i t a r yM e d i c a l U n i v e r s i t y , C h o n g q i n g 400037, C h i n a ; *C o r r e s p o n d i n g a u t h o r , T

5、e l E -m a i l :z h e n g t a n g c h e n ya h o o . c o m . c n A b s t r a c t :O b j e c t i v e T o e s t a b l i s h a m o d e l o f p u l m o n a r y a d e n o c a r c i n o m a i nm i c e , a n dt o s u p p l y a ne x p e r i m e n t p l a t f o r m f o r s c r e e no f i m p o

6、 r t a n t m i R N A s i n t h e p r o c e s s o f p u l m o n a r y a d e n o c a r c i n o m a . M e t h o d s T h e p u l m o n a r y a d e n o c a r c i n o m a m o d e l w a s e s t a b l i s h e db y i n t r a n a s a l a d m i n i s t r a t i o n o f a d e n o v i r u s C r e t o L o x -s t o

7、 p -l o x K -r a s G 12Dm i c e . T h e l u n g t i s s u e s o f m o d e l m i c e w e r e d i g e s t e d w i t h d i s p a s e a n d c o l l a g e n a s e i n c o m b i n a t i o n , a n dt h e nt h e e x p r e s s i o no f S c a -1a n d C D 34w a s d e t e c t e d b y t h e d u a l -c o l o r i

8、m m u n o f l u o r e s c e n c e . R e s u l t s T h e m o d e l o f p u l m o n a r y a d e n o c a r c i n o m a w a s e s t a b l i s h e d s u c c e s s f u l l y , a n d S c a -1a n dC D 34w e r e e x p r e s s e d i n t h e l u n g o f m o d e l m i c e . C o n c l u s i o n T h e m o d e l o

9、 f p u l m o n a r y a d e n o c a r c i n o m a c a nb ee s t a b l i s h e ds u c c e s s f u l l y f o r f u r t h e r s t u d yo n s c r e e no f i m p o r t a n t m i R N A s i n t h e p r o c e s s o f p u l m o n a r y a d e n o c a r c i n o m a .K e yw o r d s :A d C r e ; L o x -s t o p -l

10、 o x K -r a s G 12Dm i c e ; p u l m o n a r ya d e n o c a r c i n o m a ; a n i m a l m o d e l 肺腺癌是最常見的肺部惡性腫瘤 , 但是這種類型腫瘤細胞的細胞起源和進展還不完全清楚 , 近年來癌癥干細胞學說是癌癥生物學非常重要的進展 ,此理論不但提供了癌癥生成的可能原因 , 更解釋了癌癥產生抗藥性導致難以治愈的可能原因 , 成為了當前的研究 熱點 1-4。 J a c k s o n 等 利用 重組 A d C r e 誘導小鼠肺組織 K -r a s G 12D 的表達來控制肺腺癌 的起始時限及

11、復雜性 , 為肺腺癌研究提供了良好的 動物模型 5。 K i m 等 3使用細胞表面標志從大鼠支氣管肺泡 導管連接處分離出一群 S c a +C D 45-P e c a m -C D 34+細胞 , 命名 為 支氣 管 肺泡 干 細胞 (b r o n c h i o a l v e o l a r s t e mc e l l s , B A S C s , 并發(fā)現(xiàn) L o x -s t o p -l o x K -r a s G 12D m i c e D 轉化的肺癌和這種雙陽性細胞的增殖有關 ; 另外 , B A S C s 在不典型性增 生及肺腺癌 K -r a s 基因 突變活化的

12、終末支氣管和肺泡上皮細胞中的數(shù)量明顯增加 , 認為 B A S C s 可能是肺腺癌的起源細胞 。 目 前 , 我們也就肺腺癌干細胞展開了相關研究 , 首先利 用 A d C r e 重組腺病毒誘導 L o x -s t o p -l o xK -r a s G 12D 小鼠建立肺腺癌動物模型 , 并以直接免疫熒光的方 法檢測了其 C D 34、S c a -1的表達情況 , 從而為后續(xù)干 細胞分選提供實驗依據(jù)及實驗平臺 。1 材料與方法1. 1 材料 所用小鼠由人類癌癥協(xié)會小鼠模型庫(M o u s e M o d e l s o f H u m a nC a n c e r C o n s

13、 o r t i u m , M M H -C C 饋贈 , H E K 293(A m e r i c a nT y p eC u l t u r eC o l l e c -t i o n , c a t #C R L -1573 腺病毒的包裝細胞由第三軍醫(yī)大學生物化學與分子生物學教研室饋贈 , A D C r e 重組腺病毒由 M i c r o b i x 公司提供 。1. 2 試劑 胎牛血清 (F B S 由上海微科生化試劑有限公司提供 , D M E M 由 G I B C O 公司提供 , 胰酶由上?；瘜W試劑有限公司提供 , 分散酶 (美國 S i g m a 公 基金項目 :

14、國家高技術發(fā)展研究計劃 (“ 863” 項目 (2008a a 02Z 104·408· 山西醫(yī)科大學學報 (J S h a n x i M e d U n i v 2009年 5月 , 40(5 司 , 膠原酶 (瑞 士羅氏公司 , 組 織基因組 D N A 提取試劑盒 (B i o s p i n , T a q 酶 (2×P f u P C R M a s t e r -M i x , T I A N G E N 公司 , 硫氫酸熒光黃 (f l u o r e s c e i n i s o -t h i o c y a n a t e , F I T C

15、 標記大鼠抗小鼠 C D 34抗體 、 對照 抗體大鼠 I g G 1; 藻紅蛋白 (p h y c o e r y t h r i n , P E 標記大 鼠抗小鼠 S c a -1抗體 (加拿大 S t e m C e l l 公司 , 對照 抗體 大鼠 I g G 2-P E (美 國 E b i o s c i e n c e 公 司 , D A P I (羅氏 公司 , A d e n o -X T M V i r u s P u r i f i c a t i o nK i t (B D B i o s c i e n c e s , C l o n t e c h 。1. 3 小

16、 鼠的鑒定 合成上游 引物 :5 -C C TT T A C A AG C GC A CG C AG A CT G TA G A-3 , 下游引物 : 5 -A G CT A GC C AC C AT G GC T TG A GT A A G T C T G CA-3 (引物由上海生工公司合成 ; 取小鼠腳 趾以研缽研碎后按照 B i o s p i n 組織基因組提取試劑 盒操作說明進行小鼠基因組的提取 ; 以小鼠的基因 組 D N A 為模板做 P C R , 其擴增參數(shù)為 :25l 總反應 體積 , 2l 抽提的小鼠基因組 D N A 為模板 , 94 變性 2m i n ; 然后以 9

17、4 30s , 60 1m i n , 68 2m i n 的程序循環(huán) 35次 , 68 延伸 10m i n 。 在 P C R 儀上 進行擴增 , 產物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定 , 擴增基因片 段預期為 550b p 含 L o x P 的序列 。1. 4A d C r e 重組病毒的 擴增與純化 將 1個 T 25細胞培養(yǎng)瓶中生長狀態(tài)良好的 H E K 293細胞 4倍稀 釋后傳入另一個 T 25細胞培養(yǎng)瓶中 , 以含 10%F B S 的 D M E M 培養(yǎng)液在 37, 5%CO 2下培養(yǎng) (以下擴增 中均使用此條件培養(yǎng)細胞 。 待細胞達到 60%匯合 時 , 向培養(yǎng)瓶中加入腺病毒毒種

18、, 將培養(yǎng)瓶置于細胞 培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 。 待大部分細胞出現(xiàn)典型的細胞 病變效應 (C P E , 且有 50%的細胞 脫壁時 , 低速離 心收集細胞并重懸于 2m l P B S 中 , -70 /37 反 復凍融 、 振蕩 3次 , 于 4, 7000×g 離心 5m i n , 收 集病毒 上清 于 -70 保 存 。 按 A d e n o -X T M V i r u s P u r i f i c a t i o n K i t 的步驟 6純化重組腺病毒 。1. 5 小鼠肺腺癌動物模型的建立 先以戊巴比妥 鈉 45m g /kg 腹腔注射麻醉 3周齡小鼠 , 再以 A d

19、 C r e : C a P i (A d C r e :C a P i :滴度為 2. 5×107p f u 的 A d C r e 50l 加入到 69l 的 M E M 中 , 再加入 6l 的 2. 5m o l /L的氯化鈣 的共沉淀物滴入小鼠的 鼻腔 , 共滴入約 125l , 分 2次滴入 , 隔 5d 后重復滴入 , 重復 2次 , 共 30d ; 分別在誘導后 7d , 20d , 30d 處死小鼠取其 肺組織進行石蠟包埋 、 切片 、H E 染色 。1. 6 直接免疫熒光檢測小鼠肺腺癌模型中 C D 34、 1, 成 1m m 3大小的碎塊 , P B S 反復漂

20、洗去除紅細胞 , 加 入 0. 25%Di s p a s e 1. 5m l 、 0. 4%膠原酶 0. 5m l 、 50l 新生牛血清 (F C S 消化 , 4 過夜 12-16h , 再置于 37 孵箱中消化 50-60m i n ; 400目尼龍篩網(wǎng)過濾 , 5%F C S 的 P B S 懸浮細胞 ; 1000r /mi n 離心 5m i n , 調整細胞數(shù)為 106/100l , 入分別為 1 16的熒光抗 體 F I T C -C D 34、 P E -S c a -1抗 體 37 共 同 孵 育 15 m i n , p H 7. 2P B S 中洗 2次 , 攪拌 ,

21、每次 5m i n , 再用蒸 餾水洗 1m i n , 除去鹽結晶 ; 然后加入 D A P I 工作液 37 孵育 15m i n , 漂洗后在激光共聚焦顯微鏡下觀察 。 1. 7 統(tǒng)計學分析 采用 S P S S 11. 0統(tǒng)計軟件包對數(shù) 據(jù)進行分析 , 兩組間比較采用 t -t e s t 檢驗 , 結果均以 雙側 P<0. 05為差異有統(tǒng)計學意義 。2 結果2. 1 小鼠的鑒定 以小鼠的基因組 D N A 為模板進 行 P C R 可擴增得到 550b p 含 L o x P 的序列 , 證明小 鼠為 L o x -s t o p -l o x K -r a s G 12D 小

22、鼠 , 見圖 1, 2。1. D N AM a r k e r ; 2. L o x -s t o p -l o xK -r a s G 12D 小鼠基因組 D N A 圖 1 小鼠基因組 D N A 提取F i g 1T h e g e n o m e D N Ao f L o x -s t o p -l o x K -r a s G 12Dm o u s e1. M a r k e r ; 2, 3. L o x -s t o p -l o x K -r a s G 12D 小鼠圖 2 基因組 D N AP C R 結果F Rr e s u l t o f o u s e e n o e

23、D N A·409· 山西醫(yī)科大學學報 (J S h a n x i M e d U n i v 2009年 5月 , 40(5 2. 2A d C r e 重組腺病毒擴增及純化結果 A d C r e 重 組腺病毒感染 293細胞 3d , 293細胞開始出現(xiàn)病變 效應 (C P E , 感染 7d , 293細胞出現(xiàn)明顯病變效應 , 感染 9d 后 293細胞開始脫落 , 釋放病毒顆粒 , 見圖 3(見第 478頁 。 A d C r e 重組腺病毒感染 293細胞 96h 后即可觀察出現(xiàn) C P E , 并隨 C P E 逐漸增強 , 同 時細胞逐漸由貼壁狀態(tài)轉為懸浮

24、 , 此過程約 9d 。 2. 3 小 鼠動 物 模 型 的 建 立 L o x -s t o p -l o xK -r a s G 12D 小鼠在鼻腔吸入 A d C r e 1周后細支氣管出現(xiàn) 肺支氣管上皮增生 ; 20d 后細支氣管出現(xiàn)肺支氣管 上皮非典型性增生 ; 30d 后不僅出現(xiàn)肺支氣管非典 型性上皮增生 , 而且旁邊出現(xiàn)癌巢 (見圖 4, 見第 478頁 。 2. 4 直接免疫熒光檢測小鼠肺腺癌模型中 C D 34、 S c a -1的表達 L o x -s t o p -l o x K -r a s G 12D 小鼠經(jīng)過鼻 腔吸入 A d C r e 后 , 肺組織細胞中有 C

25、 D 34、S c a -1雙陽 性細胞 (見圖 5, 見第 478頁 。 3 討論 條件性基因敲除鼠肺腺癌模型有利于對肺腺癌 的起始和早期有更清楚的了解 , 并且可以控制癌腫 發(fā)生的時間和大小 , 但是無法控制腫瘤的數(shù)量 。 可 以通過控制給予重組 C R E 病毒的劑量來實現(xiàn)對于 腫瘤發(fā)生的時間和大小的控制 , 而且這樣的模型與 人肺癌的起始發(fā)生非常接近 , 而且使用重組 C R E 病 毒誘導 K -r a s G 12D 的表達與腫瘤的發(fā)生同步進行 , 這樣可以通過組織學改變來跟蹤腫瘤的進展 。 不能 排除腺病毒在腫瘤發(fā)生過程中具有一定的作用 , 但 是根據(jù)報道 , 給予野生型小鼠大劑

26、量的重組病毒后 并沒有產生過度增生的跡象 5。 根據(jù) K i m 等 3報 道 , 小 鼠 肺 細 胞中 S c a -1+C D 34+C D 31-C D 45-細胞為肺內支氣管肺泡干細 胞 (B A S C , 此類細胞的惡性轉化是肺 腺癌發(fā)生的 主要原因 。 腫瘤干細胞 (c a n c e r s t e m c e l l s , C S C s 7是指腫瘤組織中少數(shù)具有無限增殖潛能 、 自我更新 、 分化潛能的細胞 。 此外 , 癌干細胞還具有對化療藥 物的耐藥性和高致瘤性 。 許多學者提出癌癥干細胞 假說 , 指出癌癥干細胞起源于正常干細胞遺傳突變 的積累 。 腫瘤起源于組織干

27、細胞 , 或者是組織干細 胞的子代 ; 正常情況下 , 這些細胞的自我更新受嚴格 調控 , 但在發(fā)生惡性轉化后 , 自我更新的調控機制發(fā) 生紊亂 , 發(fā)生惡性轉化形成的癌癥干細胞仍保留有 自我更新 、 驅動腫瘤的形成和維持腫瘤的存在 , 癌癥 干細胞分化后產生的腫瘤細胞不具備成瘤性 , 但這 些分化細胞組成了腫瘤的主體 。 我們成功建立了小 鼠肺腺癌的 動物 模型 , 并 且 檢測 了模 型中 S c a -1, C D 34的表達 , 為進一步比較小鼠誘導前后此標記細 胞的相干生物學特性創(chuàng)造了實驗平臺 。參考文獻 :1Z h a n gM , R o s e nJ M . S t e m c

28、 e l l si nt h ee t i o l o g ya n dt r e a t m e n t o fc a n c e r J . C u r r O p i n G e n e t D e v , 2006, 16(1 :60-64.2G r i f f i t h s M J , B o n n e t D , J a n e s S M. S t e mc e l l s o f t h e a l v e o l a r e p i t h e -l i u m J . L a n c e t , 2005, 366(9481 :249-260.3K i m C F , J a c k s o n E L , W o o l f e n d e nA E , e t a l . I d e n t i f i c a t i o no f b r o n -c h i o a l v e o l a r s t e mc e l l s i nn o r m a l l u n g a n dl u n g c a n c e r J . C e l l , 2005, 121:823-835.4 D o n gJ , K i s l i n g e r T , J u r i s i c aI , e t a l . L