生物化學(xué)10DNA的復(fù)制和修復(fù)

1、dnA勺復(fù)制和修復(fù)現(xiàn)代生物學(xué)充分證明 DN端生物遺傳的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。生物機體的遺傳信息以密碼的形 式編碼在DNA子上，表現(xiàn)為特定的核甘酸序列，并通過DNA勺復(fù)制由秦代傳遞給子代。在后代的生長發(fā)育過程中，遺傳信息自DNA專錄給RNA然后翻譯成特異地蛋白質(zhì)，以執(zhí)行各種生命功能，使后代表現(xiàn)出與親代相似的遺傳性狀。所謂復(fù)制，就是指原來 DN冊子為模板合成出相同分子的過程，所謂轉(zhuǎn)錄，就是在 DNA分子上合成出與其核甘酸順序相對應(yīng)的RNA勺過程所謂翻譯，就是在RNA勺控制下，根據(jù)核酸鏈上的每三個核酸決定一個氨基酸的三聯(lián)體 密碼規(guī)則，合成出具有特定氨基酸順序的蛋白質(zhì)肽鏈過程。在某些，f#況下 RNAfe可以

2、是遺傳信息的基本攜帶者，例如，RNAW毒能以自身核酸分子為模板進(jìn)行復(fù)制，致癌 RNAW毒還能通過逆轉(zhuǎn)錄的方式將遺傳信息傳遞給DNADNA勺復(fù)制原核生物每個細(xì)胞只含有一個染色體，真核生物每個下?lián)艹：卸鄠€染色體。在細(xì)胞增殖周期的一定階段整個染色體組都將發(fā)生精確的復(fù)制，隨后以染色體為單位把復(fù)制的基因組分配到兩個子代細(xì)胞中。染色體DNA勺復(fù)制和細(xì)胞分裂之間存在密切的相互聯(lián)系。一旦復(fù)制完成，就可發(fā)動細(xì)胞分裂，細(xì)胞分裂結(jié)束后，又可開始新一輪DNAM制。線粒體和葉綠體的 DNA可用以編碼自身的rRNA和t RNA以及一小部分蛋白質(zhì)，其他的 蛋白質(zhì)則由核基因編碼，并在液泡合成后再運進(jìn)細(xì)胞器。細(xì)胞器DNA的復(fù)

3、制并不限于核 DNA的合成器，而可在整個細(xì)胞周期進(jìn)行。對于某個DNA分子來說，進(jìn)入或不進(jìn)入復(fù)制是隨機的，因為有些DN所子在細(xì)胞周期中復(fù)制不止一次，有些則不發(fā)生復(fù)制，然而就總體來說，每一細(xì)胞周期中細(xì)胞器 DNA勺總量將增加一倍，從而保 持了每個細(xì)胞的細(xì)胞器 DNA數(shù)量恒定。由于DNA遺傳信息的載體，在合成DNAM,決定其結(jié)構(gòu)特異性的遺傳信息只能來自其 本身，因此必須由原來存在的分子為模板來合成新的分子，即進(jìn)行自我復(fù)制。DNA的雙鏈結(jié)構(gòu)對于維持這類遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性和復(fù)制的準(zhǔn)確性都是極為重要的。DNA勺半保留復(fù)制DNA由兩條螺旋的多核甘酸鏈組成，兩條鏈的堿基通過氫鍵連接在一起。一條鏈上的核 甘酸序列

4、排列順序決定了另一條鏈上的排列順序。由此可見，DNA分子的每一條鏈都含有合成它互補鏈所必需的全部遺傳信息。DNAM制時，母鏈的兩股DNA軍開成兩股單鏈，各自作為模板指導(dǎo)子代合成新的互補鏈。 子代細(xì)胞的DNA雙鏈，其中一股單鏈從親代完整的接受過來，另一股單鏈則完成重新合成。 兩個子代細(xì)胞的 DNAZ鏈，都和親代母鏈的 DNA堿基序列一致。此即 DNA的半保留復(fù)制。1958年Meselson和stahl利用氮的同位素15N標(biāo)記大腸桿菌 DNA首先證明了 DNA的 半保留復(fù)制。他們讓大腸桿菌在以15NH 4cl作為唯一氮源的培養(yǎng)基中生長，連續(xù)生長1 2代，從而使所有DNA分子標(biāo)記上15N。15N-D

5、NA的密度比普通14N-DNA的密度大，在氯化葩密度 梯度離心時，這兩種 DNAt歸形成不同的區(qū)帶。如果將 15N標(biāo)記的大腸桿菌轉(zhuǎn)移到普通培養(yǎng)基 中培養(yǎng)（含14N的），經(jīng)過一代后，所有的 DNA密度都介于15N-DNA和14N DNA之間，即形 成DNA分子一半含14N , 一半含15N。兩代后，14N和14N - 15N雜合分子等量出現(xiàn)，若再培養(yǎng)， 可以看到14N -DNA分子增多。當(dāng)把14N-15N雜合分子加熱時，它們分開成 15N鏈和14N鏈。這 就充分證明了，在DNA復(fù)制時原來的DNA分子可被分成兩個亞單位，分別構(gòu)成子代分子的一 半，這些亞單位經(jīng)過許多代復(fù)制后仍然保持著完整性。在這以后

6、，用許多種原核生物和真核生物復(fù)制中的DNA做了類似的實驗，都證實了 DNA復(fù)制的半保留方式，然而這類實驗所研究的復(fù)制中的DNAS提取過程中已被斷成了許多片段，得到的信息只涉及 DNAM制前和復(fù)制后的狀態(tài)。1 9 6 3年 Cairn用放射自顯影的方法第一次觀察到完整的正在復(fù)制的大腸桿菌染色 體DNA他將3H脫氧胸背標(biāo)記大腸桿菌 DNA然后用溶菌酶把細(xì)胞壁消化掉，使完整的染色體DNA釋放出來，鋪在一張透析膜上，在暗處用感光乳膠覆蓋于干燥了的表面上放至若干星期。在這期間3H由于放射性衰變釋放出離子，使乳膠曝光生成銀粒。顯影后銀粒黑點軌跡勾畫出DNA分子的形狀，黑點數(shù)目代表了 3H在DN6子中的密度

7、。把顯影后的片子放在 光學(xué)顯微鏡下，姐可以觀察到大綱桿菌染色體的全貌。用這種方法，Cairns闡明了大腸桿菌染色體DNA一個環(huán)狀分子，并以半保留的方式進(jìn)行復(fù)制。半保留復(fù)制，即子代 DNA分子中僅保留一條親代鏈，另一條鏈?zhǔn)切潞铣傻?，這是雙鏈 DNA1遍的復(fù)制機制。即是單鏈 DNA子，在其復(fù)制過程中也通?？偸且€形成雙鏈的復(fù)制 型式(RF)。半保留復(fù)制要求親代 DNA勺兩條鏈解開，各自作為模板，通過堿基配對的法則， 合成出另一條互補鏈。所謂模板即是能提供合成一條互補鏈所需精確信息的核酸鏈。在這里，堿基配對是核酸分子間傳遞信息的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。無論是復(fù)制、轉(zhuǎn)錄或逆轉(zhuǎn)錄，在 形成雙鏈螺旋分子時都是通過堿基配

8、對來完成的，需要指出的是，堿基、核昔或核甘酸單體之間并不形成堿基對，但是在形成雙鏈螺旋時由于空間結(jié)構(gòu)的關(guān)系而構(gòu)成特殊的堿基對。DNA的半保留復(fù)制機制可以說明DNA在代謝上的穩(wěn)定性，經(jīng)過許多代的復(fù)制，DNA勺多核甘酸鏈仍可保持完整， 并存在于后代而不被分解掉。DNA與細(xì)胞其他成分相比要穩(wěn)定得多，這和它的遺傳功能是相符的。但是這種穩(wěn)定是相對的，DNA在代謝上并不是完全惰性的物質(zhì)。在細(xì)胞內(nèi)外各種物理、 化學(xué)和生物因子的作用下，DN心發(fā)生損傷，需要修復(fù)；在復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程中DNA也會有損耗，而必須進(jìn)行更新。在發(fā)育和分化過程中，DNA勺特定序列還可能進(jìn)行修飾、刪除、擴增和重排。DNA復(fù)制的起點和終點基因組

9、能獨立進(jìn)行復(fù)制的單位叫做復(fù)制子。每個復(fù)制子都含有控制復(fù)制起始地起點(ori ),可能還有終止復(fù)制的終點。復(fù)制是在起始階段進(jìn)行控制的，一旦復(fù)制開始，它將 繼續(xù)下，直到整個復(fù)制子完成復(fù)制。原核生物的染色體和質(zhì)粒，真核生物的細(xì)胞器 DNATB是環(huán)狀雙鏈分子。 實驗表明，它們都在一個固定的起點開始復(fù)制，復(fù)制方向大多是雙向的，即形成兩個復(fù)制叉或生長點，分別向兩側(cè)進(jìn)行復(fù)制；也有一些單向的，只形成一個復(fù)制叉或生長點。通常復(fù)制是對稱的， 兩條鏈同時進(jìn)行復(fù)制。DNAS復(fù)制叉處兩條鏈解開，各自合成其互補鏈，在電子顯微鏡下可以看 到形如眼的結(jié)構(gòu)，環(huán)狀 DNA的復(fù)制眼形成希臘字母形結(jié)構(gòu)。真核生物染色體DNA線性雙鏈分

10、子，含有許多復(fù)制起點，因此是多復(fù)制子。通過放射自顯影的實驗可判斷 DNA復(fù)制是雙向進(jìn)行的，還是單項進(jìn)行的。在復(fù)制開始時， 先用低放射性的3H -脫氧胸背標(biāo)記大腸桿菌， 經(jīng)數(shù)分鐘中后，再轉(zhuǎn)移到含有高放射性的 3H - 脫氧胸背培養(yǎng)基中繼續(xù)進(jìn)行標(biāo)記。這樣在放射自顯圖像上，復(fù)制器起始區(qū)的放射性標(biāo)記密度較低，感光還原的銀顆粒密度就較低；繼續(xù)合成區(qū)標(biāo)記大腸桿菌放射性標(biāo)記密度較高，感光還原的銀顆粒密度就較高。若是單向復(fù)制，銀顆分布密度應(yīng)是一端低，一端高。若是雙向復(fù)制，則應(yīng)是中間密度低， 兩端密度高。由大腸桿菌所獲得的放射自顯圖像都是兩端密，中間疏，這就清楚證明了大腸桿菌染色體DNA雙向修復(fù)的。大多數(shù)生物染

11、色體 DNA的復(fù)制是雙向的，并且是對稱的，然而也有例外?？莶輻U菌染色 體DNA的復(fù)制雖是雙向，但是兩個復(fù)制叉移動的距離不同。一個復(fù)制叉僅在染色體上移動五分之一距離，然后停下等待另一復(fù)制叉完成五分之四距離。質(zhì)粒R6K的兩個復(fù)制叉的移動也是不對稱的。有一種單向的特殊復(fù)制方式，稱為滾動環(huán)。噬菌體 X174DNA是環(huán)狀單分子，它在復(fù)制過程中首先形成共價閉環(huán)的雙聯(lián)分子（復(fù)制型）,然后其正鏈由A蛋白在特定位置切開，游離出一個3末端，A蛋白連在5末端。隨后在 DNA聚合酶催化下，以環(huán)狀負(fù)鏈為模板， 從正鏈的3 - OH末端加入脫氧核甘酸，使鏈不斷延長，通過滾動合成出新的正鏈。合成 一圈后，露出切口順序， A

12、蛋白再次將其切開，并連在切出的 5磷酸基末端，游離出單位 噬菌體環(huán)狀單分子 DAN實驗證明某些雙鏈的 DNA合成也可以通過滾動環(huán)的方式進(jìn)行。例 如噬菌體復(fù)制的后期。另一種單向復(fù)制的特殊方式稱為取代環(huán)或D-環(huán)式。線粒體的DNAM制方式采取這種方式（纖毛蟲的線粒體 DNA為線型分子，復(fù)制方式與此不同）。雙鏈環(huán)在固定點解開進(jìn)行復(fù)制， 但兩條鏈的合成是高度不對稱的，一條鏈先復(fù)制，另一條鏈保持單鏈而被取代。真核生物染色體 DNA的復(fù)制要比原核生物慢得多，這是由于真核生物的染色體具有復(fù) 雜的高級結(jié)構(gòu)，復(fù)制時需要解開核小體，復(fù)制后又需重新合成核小體。綜上染色體的復(fù)制方式有：1 .直線雙向復(fù)制：單點雙向（T7

13、）2 .多起點雙向：真核染色體 DNA3 .滾環(huán)復(fù)制：環(huán)狀單鏈 DNA X174DNA4 . D型復(fù)制：線粒體、葉綠體 DNA5 .多復(fù)制叉復(fù)制：第一輪復(fù)制尚未完成， 復(fù)制起點就開始第二輪的復(fù)制。在大腸桿菌營養(yǎng)豐富時，可采取多復(fù)制叉復(fù)制方式。DNAK應(yīng)聚合有關(guān)的酶DNA由脫氧核糖核甘酸聚合而成。與DNA普核反應(yīng)有關(guān)的酶包括多種DNA聚合酶和DNA連接酶。DNA5合酶1 9 5 6年Kornberg首先從大腸桿菌提取液中發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶。其后從廣泛不同的生物中都找到這種酶。 有適量DN用口鎂離子存在時，該酶能催化四種脫氧核糖核酸三磷酸合 成DNA所合成的DNAM有與天然DNAt目同的化學(xué)結(jié)構(gòu)和

14、物理性質(zhì)。d ATP dGTR dCTP和 dTTP四種脫氧核糖核甘酸三磷酸缺一不可；它們不能被相應(yīng)的二磷酸或一磷酸化合物所取 代，也不能被核糖核甘酸所取代。在DNAm合酶催化下，脫氧核糖核甘酸被加到DNA鏈的末端，同時釋放出無極磷酸。DNA聚合酶催化的鏈延長反應(yīng)中，鏈的3羥基對進(jìn)入的脫氧核糖核甘三磷酸的磷原子發(fā)生親核供給，從而形成3 5 磷酸二酯鍵并脫下焦磷酸。形成磷酸二酯鍵所需要的能量來自 -與 -磷酸基之間高能磷酸鍵的裂合，聚合反應(yīng)是可逆的，但隨后的焦磷酸水 解可推動反應(yīng)的完成。DNA由5 段向3 端方向延長。DNA聚合酶只能催化脫氧核糖核酸自身發(fā)生聚合，它需要引物鏈的存在，加入的核甘酸

15、則由模板鏈所決定。與生物小分子的合成不同，信息大分子的合成除了需要有底物、能量和酶外，還需要模板。DN臊合酶催化的反應(yīng)是按模板的指令進(jìn)行的，只有當(dāng)進(jìn)入的堿基能與模板鏈的堿基形 成WatsonCrick類型的堿基對時，才能在該酶催化下形成磷酸二脂鍵。因此，DNA聚合酶是一種模板指導(dǎo)的酶。加入各種不同生物來源的 DNA做模板，可以同樣引起和促進(jìn)新的 DNA勺酶促合成，而產(chǎn)物DNA的性質(zhì)完全不取決于聚合酶的來源，也與四種核甘酸前體的相對比例無關(guān)，而僅僅取決于所加入的模板 DNA產(chǎn)物DNA乍為模板的雙螺旋 DNAM有相同的堿基組成，這說明在DNA聚合酶的作用下，模板DN解口兩條鏈都能進(jìn)行復(fù)制。偎極的喇

16、物根梅的合成的引物錘押.樞*DNA聚合酶的反應(yīng)可以利用雙鏈 DNA乍為模板和引物，可以了利用單鏈DNA乍為模板和 引物。在單鏈DNA勺復(fù)制中，3 羥基末端通過鏈的自身回折成為引物鏈，其余未配對的鏈則為模板鏈，由此形成發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)。雙鏈DNA勺復(fù)制發(fā)生在切口、缺口或末端單鏈區(qū)。圉34-N 由DNA *介嵇漳化的仆感反應(yīng)人.由線性單性O(shè)N A地打的反中*配由岫解宣或他疑的 孫成pna選打的拉龍* c-在n。卯U的值班UNA的俄應(yīng)HJ rift 對5 3身卜切觸水* 5幅展成出成分生訥UNA； 2做進(jìn)行的成鹿*金怔-小蝴山細(xì)！Elt&冢；粘作出的川相綜上所述，DNA聚合酶的反應(yīng)特點為：1。以四種脫氧核

17、糖核甘三磷酸作為底物2.反應(yīng)需要接受模板的指導(dǎo)3 .反應(yīng)需要有引物3 羥基的存在4 .DNA鏈的生長方向為5-3 5.產(chǎn)物DNAI1生質(zhì)與模板相同，這就表明了DNA聚合酶合成的產(chǎn)物是模板的復(fù)制物。各種不同類型的DN臊合酶大腸桿菌中共含有五種不同的DNA聚合酶，分別成為l、ll、lll 、IV、VDN咪合酶l反應(yīng)時需要有引物鏈（DNAB1或RNAB1）是一個多功能酶，可以催化以下反應(yīng)。1 .通過核甘酸聚合反應(yīng)，使 DN頌沿著5方向到3方向延長（DN咪合酶活性）2 .由3 水解DNA鏈（3 一 5 核酸外切酶活性）3 .由5 水解DNA鏈（5 一 3 核酸外切酶活性）4 .由3 端發(fā)生焦磷酸解5

18、.無極焦磷酸鹽與脫氧核糖核甘酸之間的焦磷酸基交換焦磷酸解釋聚合反應(yīng)的逆反應(yīng)， 焦磷酸交換反應(yīng)則是由前兩個反應(yīng)連續(xù)重復(fù)多次引起的。實際上DNA聚合酶l兼具3 一 5 核酸外切酶活性以及5 一 3 核酸外切酶活性DNA聚合酶被酶蛋白切開的大片段稱為Klenow片段，呈右手結(jié)構(gòu)，右手結(jié)構(gòu)是核酸聚合酶的共同特征。模板核酸落入核酸聚合酶拇指結(jié)構(gòu)和指形結(jié)的凹槽時，引起構(gòu)象改變，從而使聚合酶能夠握住核酸分子。聚合酶之所以能夠辨認(rèn)進(jìn)入的底物核甘酸，因為凹槽空間只允許底物與模板之間形成符合配對原則的堿基配對。 非配對堿基因空間位置不合適而不能進(jìn)行聚合反應(yīng)，這就保證了新合成的鏈嚴(yán)格按照模板的互補堿基順序進(jìn)行聚合，

19、在這里，酶對底物進(jìn)行了專一的核對，然而錯配的堿基仍然不可避免的會出現(xiàn)。DNA聚合酶的3 -5核酸外切酶活性能切除單鏈DNA的3末端核甘酸，而對雙鏈DNA不起作用，故不能形成堿基對的錯配核甘酸可被酶水解下來。然而在正常聚合條件下，3-5核酸外切酶活性不能作用于生長鏈；若一旦出現(xiàn)錯配堿基對， 聚合反應(yīng)即停止，生長鏈的3 末端核甘酸落入3 - 5 外切酶位點，錯配核甘酸迅速被除去，然后聚合反應(yīng)才得 以繼續(xù)進(jìn)行下去。3 -5核酸外切酶活性被認(rèn)為起著校對的功能，它能糾正聚合過程中的堿基錯配。由此可見，DNA復(fù)制過程中堿基配對要受到雙重核對：一是聚合酶的選擇作用， 二是3-5核酸外切酶的校對作用。有了3

20、-5核酸外切酶校對，大大降低了錯誤率。3 -5 核酸外切酶的校對作用對 DNA復(fù)制的忠實性極為重要。如果沒有這種活性，DNA復(fù)制的錯誤將大大增加，例如T4噬菌體突變率很高，從這種變異株得到的T4DNAm合酶中3 -5外切酶活性很弱，在DNAM制中非常容易出錯誤， 起著促突變因子的作用。（相對的， 就起到抗突變因子的作用）所以3 -5核酸外切酶活性對聚合酶的比值與DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性有關(guān)，進(jìn)而影響到自然突變率?？雇蛔兙甑腄NAm合酶雖然是高度保真的， 但在進(jìn)化中未必優(yōu)越，因為一定的自然突變率隊生物的進(jìn)化是必要的，若外切酶活性較強，甚至在聚合條件下失去對外切酶的抑制作 用，造成正常聚合的核甘酸不斷

21、被切除，這是個耗能大，效率低的系統(tǒng)。DNA聚合酶1尚有5 3 外切酶活性，它只作用于雙鏈 DNA勺堿基配對部分，從5 末端水解下核甘酸或寡核甘酸。因而該酶被認(rèn)為在切除由紫外線照射而形成的喀咤二聚體中起重要作用。DNA半不連續(xù)合成中岡崎片段5端RNA引物的切除也有賴于這個外切酶。DN咪合酶1 1聚合酶1合成 DNA勺速度太慢，只及細(xì)胞DNAM制速度的百分之一。 其次，其持續(xù)合成 能力較低，細(xì)胞內(nèi)DNA合成的復(fù)制不會頻繁中斷，另外遺傳學(xué)分析表明許多基因突變都會影響DNA的復(fù)制，但和聚合酶l無關(guān)。通過對缺乏聚合酶 l的變異菌株發(fā)現(xiàn)其 DNA復(fù)制正常， 但是損傷的修復(fù)機制有明顯的缺陷。由此直接表明，D

22、NA聚合酶l不是復(fù)制酶，而是修復(fù)酶。后來證明，在DNA復(fù)制過程中起著取代 RNMI物的作用，只是參與局部修復(fù)。聚合酶11為多亞基酶，酶活力比聚合酶1高，也是由四種脫氧核糖核甘三磷酸為底物， 從5 3方向合成 DNA并需要有缺口的雙鏈 DNA乍為模板一引物，但缺口不能太大否 則酶活力將降低。反應(yīng)需要鎂離子和氨根離子激活。聚合酶1 1具有3 - 5 核酸外切酶 活性，但是無5 - 3 核酸外切酶活性。聚合酶1 1也不是復(fù)制酶，而是一種修復(fù)酶。聚合酶111聚合酶111也是由多個亞基組成的蛋白質(zhì)，現(xiàn)在認(rèn)為它是大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)真正負(fù)責(zé)從新和成的DNA勺復(fù)制酶。雖然每個大腸桿菌細(xì)胞中只有1 0 2。個聚合酶

23、1 1 1分子， 然 而它催化的合成速度達(dá)到了體內(nèi)D N A合成的速度。聚合酶ll與lll基本性能是相同的：1.都需要模板的指導(dǎo)，以四種脫氧核糖核昔三磷 酸作為底物，并且需要有 3 -OH引物鏈存在，聚合反應(yīng)按 5 -3方向進(jìn)行2.他們都沒有 5 -3外切酶活性，但都有 3 -5 核酸外切酶活性，在聚合過程中起校對作用3.它們都是多亞基酶，DNA聚合酶ll和lll共用了許多輔助亞基。聚合酶ll和聚合酶lll與聚合酶l相比有明顯的區(qū)別：聚合酶ll和聚合酶lll最宜作 用于帶有小段缺口的雙鏈 DNA而DNA聚合酶l最宜作用于具有大段單鏈區(qū)的雙鏈DNA甚至是帶有很短引物的單鏈 DNA它們的聚合速度、

24、持續(xù)合成能力均有很大不同，反映了它們 功能的不同。聚合酶1 V和V這兩種酶涉及DNA勺錯誤傾向修復(fù)。當(dāng)DNAg到較嚴(yán)重?fù)p傷時，即可誘導(dǎo)產(chǎn)生這兩個酶， 但修復(fù)缺乏準(zhǔn)確性，因而出現(xiàn)高突變率。DNAS接酶DNA聚合酶只能催化多核甘酸鏈的延長反應(yīng)，不能使鏈之間連接。環(huán)狀DNA的復(fù)制表明，必定存在一種酶，能催化鏈的兩個末端之間形成共價連接。即 DNAB1接酶，其能催化雙鏈 DN砌口處的5磷酸基和3羥基生成磷酸二脂鍵。連接反應(yīng)需要供給能量，大腸桿菌和其他細(xì)菌的DNA連接酶以煙酰胺腺喋吟二核甘酸（NAD作為能量來源，動物細(xì)胞和噬菌體的連接酶則以腺胺三磷酸（ATP）作為能量來源大腸桿菌DNA鏈接酶要求斷開的兩

25、條鏈由互補鏈將它們聚在一起，形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。它不能將兩條游離的 DN6子連接起來。DNA勺半不連續(xù)復(fù)制在體內(nèi)，DNA勺兩條鏈都能作為模板合成出兩條新的互補鏈。但是由于DN冊子的兩條鏈?zhǔn)欠聪虻?。DN咪合酶的合成方向都是 5 -3,這就很難說明DNA復(fù)制時兩條鏈如何作 為模板合成其互補鏈。所以日本學(xué)者岡崎提出了 DNA的半不連續(xù)復(fù)制模型。認(rèn)為 3 -5走向的DNA實際上是 由許多5 -3方向合成的DNA段連接起來的。岡崎用3H -脫氧胸背標(biāo)記噬菌體 T4感染的大腸桿菌，然后通過堿性密度離心法分離標(biāo) 記的DNA產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)短時間內(nèi)首先合成的是較短的DNM段，接著出現(xiàn)較大的分子， 最初出現(xiàn)的DNA片段長

26、度約為1000個核甘酸左右，一般稱為岡崎片段。用DNA連接酶變異的溫度敏感株進(jìn)行實驗，在連接酶不起作用的溫度下，便有大量DNM段積累。這說明在DN限制過程中首先合成較短的片段，然后由DNA!接酶連成大分子。這也就是不連續(xù)合成。DNA的不連續(xù)合成不只局限于細(xì)菌，真核生物染色體的DNA復(fù)制也是如此。不過岡崎的實驗并不能判斷 DNA鏈的不連續(xù)合成只發(fā)生在一條鏈上，還是兩條鏈都如此，對岡崎片段進(jìn)行測定， 其數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過新合成的 DNA的一般，似乎兩條鏈都是不連續(xù)的。后來發(fā)現(xiàn)這是由于尿喀咤代替胸腺喀咤摻入DNA所造成的。DNA中的尿喀咤可被尿喀咤一DNA-糖甘酶切除，隨后該處的磷酸二脂鍵斷裂，一些核甘酸

27、被水解，造成一個缺口，最后缺口空 襲被填補和修復(fù)，在此過程中也會產(chǎn)生一些類似岡崎片段的DNM段。用缺乏糖甘酶的變異菌株進(jìn)行實驗，DNA的尿喀咤將不再被切除，此時新合成的DNA大約有一半放射性標(biāo)記出現(xiàn)于岡崎片段中，另一半直接進(jìn)入大的片段。由此可見，DNAM制時，一條鏈?zhǔn)沁B續(xù)的，另一條鏈?zhǔn)遣贿B續(xù)的，此即半不連續(xù)復(fù)制。以復(fù)制叉向前移動的方向為標(biāo)準(zhǔn)，一條模板鏈?zhǔn)? 一 5 走向，在其上 DNA能以5 3 方向連續(xù)合成，成為前導(dǎo)鏈；另一條模板鏈?zhǔn)? 3走向，但是在其DNAh也是從5 -3 合成，但是與復(fù)制叉的移動方向是相反，隨著復(fù)制叉的移動，形成許多不連續(xù)的 片段，最后練成一條完整的 DNA1,該鏈稱為

28、滯后鏈。由于DNAM制酶系不易從 DNA模板上解離下來，因此前導(dǎo)鏈的合成通常是連續(xù)的。 但是 有很多因素會影響前導(dǎo)鏈的連續(xù)性， 例如模板鏈的損傷、復(fù)制因子和底物供應(yīng)不足，都會引 起前導(dǎo)鏈復(fù)制中斷并從另一新起點開始。RNMI 物DNA聚合酶不能發(fā)動新鏈的合成，只能彳t化已有的鏈的延長反應(yīng)。RNAm合酶則不同，它只需要DNA莫板存在，就可以在其上合成出新的RNA鏈。所以DN蛤成需要引物，RNA合成不需要引物。岡崎片段是新合成的鏈，它是如何開始的，引物又是什么？現(xiàn)在知道DNA模板上需要先合成一段 RNA引物，DNAm合酶從RNA引物的3 O廊開 始合成新的DNA鏈。岡崎片段的合成除了需要四種脫氧核糖

29、核甘酸外，還需要四種核糖核甘酸。新合成的DNA段上共價連接著一段小 RNA。專一的水解酶證明，RNA鏈位于DNA片段的5 末端。RNA引物是在DNA莫板鏈的一定部位合成并互補于DNAK,合成方向是5 -3,催化該酶的反應(yīng)是引物合成酶（該酶作用時酶與另外6種蛋白質(zhì)結(jié)合形成引發(fā)體）。引物的長度通常為幾個核甘酸至十多個核甘酸，DNA聚合酶111可在其上聚合脫氧核糖核甘酸，直至岡崎片段的合成。RNA引物的消除和缺口的填補是由 DNA聚合酶1來完成的，最后由 DNA連接 酶將岡崎片段練成長鏈。生物體之所以要用如此復(fù)雜的機制去復(fù)制DNA主要是為了保持DNAM制的高度忠實性，生物體的自發(fā)突變都是由 DNA復(fù)

30、制時堿基對的錯配引起的。DN咪合酶對底物的選擇作 用以及3 - 5 外切酶的校對作用使錯配概率大大降低，在體內(nèi)結(jié)構(gòu)下，其復(fù)制的復(fù)雜結(jié)構(gòu)進(jìn)一步提高了復(fù)制的準(zhǔn)確性；修復(fù)系統(tǒng)可以檢查出錯配堿基和DNA種損傷并加以修復(fù)。DNA聚合酶之所以要有引物的存在即不能從無到有合成新的鏈?zhǔn)且驗樵谖春藢嵡耙粋€核甘酸處于正確配對狀態(tài)，是不會進(jìn)行聚合反應(yīng)的。RN咪合酶沒有校對功能，因此不需要引物，RNMI物都是從新開始合成的，它的錯配可能性大，在完成引物作用后DNA聚合酶1將其刪除，而代之以高保真的DNAB1。DNA復(fù)制的拓?fù)湫再|(zhì)（未整理，P419）DNA勺復(fù)制過程DNA復(fù)制過程可分為三個階段：起始、延伸和終止。其間的

31、反應(yīng)和參與作用的酶和輔助 因子各有不同。在DNA合成的生長點，即復(fù)制叉上，分布著各種各樣與復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白 因子，它們構(gòu)成的復(fù)合物稱復(fù)制體。DNAM制的階段表現(xiàn)在其復(fù)制體結(jié)構(gòu)的變化。復(fù)制的起始大腸桿菌復(fù)制的起點稱為 oriC ,由245個bp（堿基對）構(gòu)成，其序列和控制元件在細(xì)菌復(fù)制點中十分保守。 關(guān)鍵序列在于兩組段的重復(fù)：三個13bp的序列和四個9bp序列（DnaA蛋白結(jié)合位點）。正如上面所說大腸桿菌起點復(fù)制包括多種酶和輔助因子。Dna蛋白各帶一個 ATP結(jié)合在此位點上，并聚集在一起，DNA繞其上，形成起始復(fù)合物。整一上大題桿超點與*起始有關(guān)的與餐財國于量白旃相時處于質(zhì)邛曜敷目確 能A52

32、 000t機制起點序月.在起京桂異位產(chǎn)書Dm B300 (MX)6解開DN4亞鏈(Jud C29 DOOJ切勘Dm B結(jié)合于起點HU司DUO2美租貓向出:玷合第白道起始弓1婢0成.瞬Ena G）6nom1合成RNA引物彼 DFfA 站合 JitKSSfi)75 004怙含單凝DNAUNA ff 合 Bfc4M 0005盤進(jìn)曲N抬性口號總轉(zhuǎn)IW（拓?fù)洚悩?gòu)的n）400 0004野放1族.“解例加程產(chǎn)中的和曲張力甲基比隨Uuu生虺總G凡代序列的唳噎畛甲基比HU蛋白可與DNA吉合，促使雙鏈 DNAf曲。DanB借助水解ATP產(chǎn)生的能量，沿著 DNA鏈5 3方向移動，解開DNA的雙鏈，此時稱為前引發(fā)復(fù)合

33、物。DNA雙鏈的解開還需要 DN頗轉(zhuǎn)酶（拓?fù)洚悩?gòu)酶ll ）和單鏈結(jié)合蛋白（SSB ,前者可以 消除解螺旋酶產(chǎn)生的拓?fù)鋸埩?，后者保護(hù)單鏈并防止恢復(fù)雙鏈。至此引物合成酶合成 RN阿物，并開始 DNA的復(fù)制。復(fù)制的起始要求 DNA呈負(fù)超螺旋，并且起點附近的基因處于轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，這是因為DnaA只能與負(fù)超螺旋的 DN曲目結(jié)合。RNA聚合酶對復(fù)制起始的作用， 可能是因其在起點鄰近處合成一段RNA形成RNA突環(huán)，影響起點的結(jié)構(gòu)，因而有利于DnaA的作用。DNAM制的調(diào)節(jié)發(fā)生在起始階段，一旦開始復(fù)制，如無意外受阻，就能一直進(jìn)行到完成。DNA復(fù)制的發(fā)動與DNA甲基化以及細(xì)菌質(zhì)膜白相互作用有關(guān)。Dam甲基化酶可以使

34、起始序列中的腺喋吟的第六位N甲基化。DNA完成復(fù)制后，大腸桿菌的親代鏈依然保持著甲基化，而新合成的鏈未甲基化，因此是半甲基化的DNA半甲基化的起點不能發(fā)生復(fù)制的起始，直到Dam甲基化酶使起點完全甲基化。甲基化的延遲可能是因為 oriC與膜結(jié)合而阻礙了 Dam甲基化酶的作用。 復(fù)制的延伸復(fù)制的延伸階段同時進(jìn)行前導(dǎo)鏈和滯后鏈的合成。這兩條鏈合成的基本反映相同，并且 都由DNA聚合酶111催化。但兩條鏈的合成也有明顯差別前者持續(xù)合成，后者分段合成。因此參與的蛋白質(zhì)因子也有不同親代DNAT先必須由DNA軍旋酶將雙鏈解開，其產(chǎn)生的拓?fù)洚悩?gòu)張力由拓?fù)洚悩?gòu)酶釋放， 分開的鏈被單鏈結(jié)合蛋白所穩(wěn)定。自此之后，前

35、導(dǎo)鏈與滯后鏈的合成便有所不同復(fù)制起點解開后形成兩個復(fù)制叉，既可進(jìn)行雙向復(fù)制。前導(dǎo)鏈開始合成后通常都一直繼續(xù)下去。先由引物合成酶（ DnaG蛋白）在起點處合成 一段RNA引物，前導(dǎo)鏈的引物一般比岡崎片段的引物略長一些，大約10-60個核甘酸。隨后DN咪合酶1 1 1在引物上加入脫氧核糖核甘酸，前導(dǎo)鏈的合成與復(fù)制叉的移動保持同步。滯后鏈的合成是分段進(jìn)行的，需要不斷地合成岡崎片段的RNA引物，然后由DNA聚合酶111在引物上加入脫氧核糖核酸。為了使前導(dǎo)鏈與滯后鏈的合成協(xié)調(diào)一致，即被同一個DNA聚合酶lll二聚體所合成，滯后鏈必須繞成一個突環(huán)。合成岡崎片段需要 DNA聚合酶1 1 1不斷與模板脫開，然

36、后在新的位置上又與模板結(jié)合。這一作用是 夾子和 復(fù)合物來完成的。DnaB有兩個功能，其一是解螺旋酶，以解開DNA的雙螺旋；另一活化引物合成酶，促進(jìn)其合成RNA引物。由DnaB解螺旋酶和Dna引物合成酶構(gòu)成了復(fù)制體的一個基本功能單位稱為引發(fā)體。無 論哪一種引發(fā)體，都能依賴ATP沿著復(fù)制叉運動方向在DNA鏈上移動，并合成岡崎片段的RNA引物。引物的合成方向與復(fù)制叉的前進(jìn)方向正好相反。DNA聚合酶1 1 1在模板鏈上合成岡崎片段，遇上一個岡崎片段時即停止合成，亞基隨即脫開DNAB1,可能正是此停頓為合成 RNA引物的信號。復(fù)制的終止細(xì)菌環(huán)狀染色體的兩個復(fù)制叉向前推移，最后在終止區(qū)相遇并停止復(fù)制，該區(qū)

37、含有多個約2 2b P的終止子位點。大腸桿菌有六個終止子位點，分別稱為terA terF，與t e r位點結(jié)合的蛋白值成為T us。Tus - t e r復(fù)合物只能阻止一個方向的復(fù)制叉前移，即不讓對側(cè)復(fù)制叉超過中點后過量復(fù)制。在正常情況下，兩個復(fù)制叉前移的速度是相等的，到達(dá) 終止區(qū)后就停止復(fù)制。DNA聚合酶l通過5 -3外切酶活性切除 RNA引物并完成缺口處 DNA制。DNA1接 酶封閉DNA1上切口。真核生物DNA的復(fù)制（未吸整理）真核生物的DNA常都與組蛋白構(gòu)成核小體，以染色質(zhì)的形式存在于細(xì)胞核中。DNA勺損傷修復(fù)DNA在復(fù)制過程中可能產(chǎn)生錯配。DNAM組、病毒基因的整合，常常會局部破壞D

38、NA的雙螺旋結(jié)構(gòu)。某些物理化學(xué)因子，如紫外線、電離輻射和化學(xué)誘變劑等，都能作用于DNA造成其結(jié)構(gòu)與功能的破壞，從而引起生物突變，甚至導(dǎo)致死亡。然而在一定條件下，生物機 體能使其DNA勺損傷得到修復(fù)。這種修復(fù)是生物在長期進(jìn)化過程中獲得的一種保護(hù)功能。造成DNAg傷的原因可能是生物因素、物理因素或是化學(xué)因素； 可能來自細(xì)胞內(nèi)部， 也可能來自細(xì)胞外部；受到破壞的可能是DNA勺堿基、戊糖或是磷酸二酯鍵?？傊瓺NA勺正常雙螺旋結(jié)構(gòu)遭到破壞，就可能影響其功能。細(xì)胞對DNA員傷的修復(fù)系統(tǒng)有五種錯配修復(fù)（識別并修正錯誤堿基配對的過程）遺傳性非息肉結(jié)腸直腸癌（HNPCC或Lynch綜合征是由于 DNA昔配修復(fù)有

39、缺陷而造成 的。DNA復(fù)制過程中如果發(fā)生錯配，如果新合成鏈被矯正，基因編碼信息可得到恢復(fù)；但是 如果模板鏈被矯正，突變就固定；細(xì)胞錯配修復(fù)系統(tǒng)能區(qū)分“舊”鏈與“新”鏈。Dam甲基化酶可使 DNA的GAT并列中腺喋吟N6甲基化，復(fù)制后的 DNA在短期內(nèi)（數(shù)分鐘）為半甲基化的 GAT5列，一旦發(fā)現(xiàn)錯 配堿基，即將未甲基化的鏈切除，并以未甲基化的鏈為模板進(jìn)行修復(fù)合成。大腸桿菌參與錯配修復(fù)的蛋白質(zhì)至少有12種，其功能或是區(qū)分兩條鏈或是進(jìn)行修復(fù)過程。其中含有幾個特有的蛋白由 mut基因編碼。MutS二聚體識別并結(jié)合到 DNA錯配堿基部 位，MutL二聚體與MutS結(jié)合，二者組成的復(fù)合物可沿 DNA雙鏈向

40、兩方向移動，DNA由此形 成突環(huán)。水解ATP提供的能量驅(qū)使ATP移動，知道遇見GATC列為止。隨后MutH核酸內(nèi)切酶結(jié)合到 MutSL上毛病在未甲基化鏈 GATCB點的5端切開。在 切除的過程中解螺旋酶1 1和SSB幫助鏈的解開。切除的鏈長達(dá)1 0 0。個核甘酸以上，直到將錯配的堿基切除。新的DNAB1由DN咪合酶lll和DNA!接酶合成并連接。為了矯正一個錯配堿基， 不僅 需要找出錯配堿基本身，還需要從遠(yuǎn)在 1kb以外找出GAT5列，找出未甲基化的“新鏈”， 加以切除可能長達(dá)1000個核甘酸的鏈，然后再合成新鏈，這是一個十分耗能的過程由此可看出維持基因信息的完整性對于生物是何等重要。 直接修

41、復(fù)紫外線照射可以使 DNA分子中同一條鏈兩相鄰胸腺喀咤之間形成二聚體（ TT ）。這種 二聚體是由兩個胸腺喀咤堿基以共價鍵聯(lián)結(jié)成環(huán)丁烷的結(jié)構(gòu)而形成的。其他喀咤堿基之間也能形成類似的二聚體，但是數(shù)量較少?？宥垠w的形成，影響了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)，使其復(fù)制和轉(zhuǎn)錄功能均受到阻礙。胸腺喀咤二聚體的形成和修復(fù)有多種機制，常見的有光修復(fù)和暗修復(fù)。最早發(fā)現(xiàn)細(xì)菌在紫外線照射后立即用可見光照射，可以顯著提高細(xì)菌存活率。光復(fù)活的機制是可見光（最有效波長為400nm左右）激活了光復(fù)活酶，它能分解由于紫 外線照射而形成的喀咤二聚體。光復(fù)活作用是一種高度專一的直接修復(fù)方式，它只作用于紫外線引起的 DNA密咤二聚體。光

42、復(fù)活酶在生物界分布很廣，從低等單細(xì)胞生物一直到鳥類都有，而高等的哺乳類卻沒有。 這種修復(fù)在植物中特別重要。高等動物更重要的是暗修復(fù)，即切除含喀咤二聚體的核酸鏈，然后再修復(fù)合成。另一鐘直接修復(fù)的例子是 60 -甲基鳥喋吟的修復(fù)。在烷化劑做喲改下堿基可被烷基化， 并改變了堿基配對的性質(zhì)。甲基化的鳥喋吟在60甲基鳥喋吟一DNA甲基轉(zhuǎn)乙酰基酶作用下，可將甲基轉(zhuǎn)移到酶自身的半胱氨酸殘基上，甲基轉(zhuǎn)移酶因此失活， 但卻成為其自身基因和另一些修復(fù)酶基因轉(zhuǎn)錄的活化物 切除修復(fù)所謂切除修復(fù)，便是在一些系列酶的作用下，將DNA分子中受損傷部分切除掉，并以完 整的那一條鏈為模板，合成出切去的部分，然后使DN徽復(fù)正常結(jié)

43、構(gòu)的過程。這是一種比較 普遍的修復(fù)機制，它對多種損傷均能起修復(fù)作用。切除修復(fù)包括兩個過程： 一是由細(xì)胞內(nèi)特異的酶找到DNA的損傷部位，切除含有損傷結(jié)構(gòu)的核甘酸鏈，二是修復(fù)合成并連接。AP位點以及堿基切除修復(fù)細(xì)胞內(nèi)有多種特異的 DNA昔酶，他彳門能識別 DNA中不正常的堿基，而將其水解下來。例如在DNAM制過程中聚合酶對脫氧胸腺喀咤核甘三磷酸（dTTP）和脫氧尿喀咤核昔三磷酸（dUTB的分辨能力是不高的，因此常有少量脫氧尿甘酸摻入到DNA鏈中去。大腸桿菌中的dUTP酶可以分解d UTP成d UMP但是作用有限，不能完全避免dUTP的混入。而且胞喀咤脫氨基后也會轉(zhuǎn)化成尿喀咤。對于上述可能出現(xiàn)的尿喀

44、咤，細(xì)胞中的尿喀咤-N-糖甘酶可以把它除去。腺喋吟脫氨后形成次黃喋吟，這一不正常的堿基可被次黃喋吟-N-糖甘酶除去。無喋吟或無喀咤位點常稱 AP位點，是核酸內(nèi)切酶識別作用位點。 AP位點可由多途徑產(chǎn) 生，例如一些特異的 DNA-N糖甘酶可以識別異常堿基，水解該糖昔鍵，產(chǎn)生 AP位點。 通常只有單個堿基缺陷才可以堿基切除修復(fù)。AP位點形成后，即有AP核酸內(nèi)切酶在AP位點附近將DNAK切開。不同AP核酸內(nèi)切酶 的作用方式不同，或在 5切開，或在3切開。然后核酸外切酶將包括AP位點在內(nèi)的DNA鏈切除。DN咪合酶1兼具外切酶活性，并使DNA鏈沿3端延伸以填補空缺，DNA1接酶將鏈接上，在AP位點上必須

45、切除若干核甘酸后才能修復(fù)合成，細(xì)胞內(nèi)沒有酶能夠在 AP位置直接將堿基插入，因為 DNA合成的前體物質(zhì)是核甘酸而不是堿基。 核甘酸切除修復(fù)如果DNAg傷造成DNA1旋結(jié)構(gòu)較大變形，則需要以核甘酸切除修復(fù)方式才能修復(fù)。首先識別損傷位點并由核酸內(nèi)切酶切開磷酸二酯鍵。由5 3核酸外切酶將有損傷的DNA片段切除。在 DNAm合酶的催化下，以完整的互補鏈為模板，按5 3 方向 DNA 鏈，填補已切除的空隙。 由DNA!接酶將新合成的 DNA片段與原來的DNA斷鏈連接起來，這 樣完成的修復(fù)能使 DNA恢復(fù)到原來的結(jié)構(gòu)。最常見的是短片段的修復(fù)，只有多處發(fā)生嚴(yán)重?fù)p傷才會誘導(dǎo)長片段修復(fù)。損傷鏈由切除酶切除，該酶也

46、是一種核酸內(nèi)切酶，其可識別多種DN頗傷，包括紫外線 引起的喀咤二聚體和其他光反應(yīng)產(chǎn)物，堿基的加和物。TTirrnt1mH痛內(nèi)勸於 支味林 . a卡.I?1,! r ? in in pi皿二徘HIIMI身1M 、叫si序的刷It，y由此可見，切除修復(fù)作用是一種普遍的生物功能，它不局限于某種特殊原因造成的損傷,而能一般地識別 DNAZ螺旋結(jié)構(gòu)的改變，對遭到破壞而呈現(xiàn)不正常結(jié)構(gòu)的部分加以去除細(xì)胞的這種功能，對于保護(hù)遺傳物質(zhì)DNA使它不被輕易得破壞是有很大重要意義的。細(xì)胞的切除修復(fù)系統(tǒng)和癌癥的發(fā)生也有一定的關(guān)系。有一種稱為著色性干皮病的遺傳病,這種病患者對日光或紫外線特別敏感， 往往容易出現(xiàn)皮膚癌。 經(jīng)分析表明，患者皮膚細(xì)胞中 缺乏核甘酸切除修復(fù)有關(guān)的酶， 因此對紫外線引起的 DNA員傷而不能修復(fù)，這說明修