T載體與目的基因連接

1、 一.重組質(zhì)粒的構(gòu)建T質(zhì)粒載體 重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下，有Mg2、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將分別經(jīng)酶切的載體分子與外源DNA分子進(jìn)行連接。 DNA連接酶有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。兩種DNA連接 酶都有將兩個(gè)帶有相同粘性末端的DNA分子連在一起的功能，而且T4噬菌體DNA連 接酶還有一種大腸桿菌DNA連接酶沒(méi)有的特性，即能使兩個(gè)平末端的雙鏈DNA分子連 接起來(lái)。但這種連接的效率比粘性末端的連接率低，一般可通過(guò)提高T4噬菌體DNA 連接酶濃度或增加DNA濃度來(lái)提高平末端的連接效率。T4噬菌體DNA連接酶催化 DNA連接反應(yīng)分為3步：首先，T4DNA

2、連接酶與輔因子ATP形成酶-ATP復(fù)合物；然后，酶-ATP復(fù)合物再結(jié)合到具有5磷酸基和3羥基切口的DNA上，使DNA腺昔化； 最后產(chǎn)生一個(gè)新的磷酸二酯鍵，把切口封起來(lái)。連接反應(yīng)通常將兩個(gè)不同大小的片斷相連。 很多DNA聚合酶在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)會(huì)在PCR產(chǎn)物雙鏈DNA每條鏈的3端加上一個(gè)突出的堿基AopUCm-T載體是一種已經(jīng)線性化的載體，載體每條鏈的3端帶有一 個(gè)突出的To這樣，pUCm-T載體的兩端就可以和PCR產(chǎn)物的兩端進(jìn)行正確的AT配對(duì)， 在連接酶的催化下，就可以把PCR產(chǎn)物連接到pUCm-T載體中，形成含有目的片斷的 重組載體。 連接反應(yīng)的溫度在37C時(shí)有利于連接酶的活性。但是在這個(gè)溫

3、度下粘末端的氫鍵 結(jié)合是不穩(wěn)定的。因此采取折中的溫度，即12-16C,連接12-16h（過(guò)夜），這樣既可最大限度地發(fā)揮連接酶的活性，又兼顧到短暫配對(duì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。 二.感受態(tài)制備原理 細(xì)菌在0 CCaCl2低滲溶液中脹成球形，丟失部分膜蛋白，成為容易吸收外源DNA的感受態(tài)。 三.B-半乳糖甘酶顯色反應(yīng)選擇法 LacZ基因是大腸桿菌乳糖操縱子中的一個(gè)基因，可以編碼3半乳糖核甘酶。 3一半乳糖核甘酶是由4個(gè)亞基組成的四聚體，可催化乳糖的水解.用X-Gal為底物 進(jìn)行染色時(shí)，呈藍(lán)色。 現(xiàn)在一些特定的質(zhì)粒（比如pUC/pBS等），常帶有3半乳糖核甘酶的調(diào)控序列和3半乳糖核甘酶N端146個(gè)氨基酸（“肽段）

4、的編碼序列，在這個(gè)編碼序列里還 插入一個(gè)多克隆位點(diǎn)（MCS，它并不影響lacZ的表達(dá)。另外，常用的大腸桿菌帶有 3一半乳糖核甘酶C端部分序列（3肽段），的編碼序列。在各自獨(dú)立的情況下，這 些質(zhì)粒與大腸桿菌各自編碼的3半乳糖核甘酶片段都沒(méi)有酶的活性。 只有當(dāng)攜帶“ 肽編碼信息的克隆載體成功進(jìn)入宿主細(xì)胞，在培養(yǎng)基誘導(dǎo)物IPTG的誘導(dǎo)下，載體質(zhì) 粒能夠合成3一半乳糖核甘酶N端（“肽段），這樣就與宿主細(xì)胞合成的3一半乳糖 核音酶C端部分序列（3肽段）互補(bǔ)，形成完整的3一半乳糖核甘酶活性蛋白。 而當(dāng)外源基因插入到此種載體質(zhì)粒lacZ的多克隆位點(diǎn)后，會(huì)造成lacZ基因不能 表達(dá)，從而不能合成3一半乳糖核甘

5、酶；而對(duì)于空載體，lacZ基因正常表達(dá)，通過(guò)“ 互補(bǔ)合成3一半乳糖核甘酶，分解培養(yǎng)基里的色素底物X-gal,最終形成藍(lán)色的化合 物，出現(xiàn)藍(lán)色菌斑。實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：清洗，5個(gè)100ml錐形瓶（外加1個(gè)小的），6副培養(yǎng)皿，3個(gè)小試劑瓶， 接種環(huán)，涂布棒。準(zhǔn)備100ml超純水。溶液:LB300ml（液體50ml+50ml,固體100ml）,LCaCl210ml,100mg/mlAmp1ml,20mg/mlX-gal1ml,200mg/mlIPTG1ml。大腸桿菌菌液 1ml。 感受態(tài)細(xì)胞 連接產(chǎn)物 4管 4x5=20ul 做4份 目的基因 T載體 T4連接酶 10 x沖液 4x4uL 4x1uL 4x1u

6、L 滅菌：5個(gè)100ml錐形瓶（外加1個(gè)小的），6副培養(yǎng)皿，3個(gè)小試劑瓶，接種 環(huán)，涂布棒，10ml超純水，LB培養(yǎng)基，管，大小槍頭，過(guò)濾用具2副，LCaCl2 實(shí)際配置20mg/mlX-galX-gal為5-澳-4-氯-3-口引喋-3-D半乳糖甘。用二基甲酰 胺（DMF溶解X-gal配制成的20mg/ml（取，用DMF定容為1ml）的貯存液。保存于 一玻璃管或聚丙烯管中，裝有X-gal溶液的試管須用鋁箔封裹以防因受光照而被破壞， 并應(yīng)貯存于-20C。X-gal溶液無(wú)須過(guò)濾除菌。（DMF二甲基甲酰胺;Dimethylformamide; N,N-Dimethylformamide;DMF;CA

7、S:68-12-2理化性質(zhì)：無(wú)色、淡的胺味的液體。 分子式C3-H7-N-O。分子量。相對(duì)密度（25C）。熔點(diǎn)-61Co沸點(diǎn)C。）溶于DMSQ 溶解度可達(dá)20mg/ml。也溶于DMF溶于DMSQ溶解度可達(dá)20mg/ml。也溶于DMF 200mg/mlIPTG在蒸儲(chǔ)水中溶解IPTG后，用蒸儲(chǔ)水定容至1ml,用科m濾器過(guò) 濾除菌，貯存于-20C。 LB培養(yǎng)基： 配制每升培養(yǎng)基 5gNaCl10g搖動(dòng)容器直至溶質(zhì)溶解.用5mol/LNaOH調(diào)pH至.用去離子水定容至1L. 在15Psi高壓下蒸汽滅菌20min.（100mlLB培養(yǎng)基加入瓊脂粉為固體培養(yǎng)基） LCaCl2:取氯化鈣固體定容至10ml

8、Amp100mg/ml）:溶解氨葦青霉素鈉鹽于足量的水中，最后定容至1ml, 用mm濾膜過(guò)濾除菌. 實(shí)驗(yàn)過(guò)程 （一） .目的基因片段與載體連接 器材 旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，管架，臺(tái)式離心機(jī)，干式恒溫氣浴。 試齊I T載體，T4DNA連接酶，連接酶緩沖液，無(wú)菌 操作步驟 PCR產(chǎn)物與T載體直接連接： （1） 事先將干式恒溫儀（或冰盒里的水）溫度設(shè)定在1416 C （2） 取4個(gè)滅菌的200ul微量離心管，加入：（需要調(diào)整）4ml目的基因； 1mlT載體；T4DNA連接酶（TAKARA,350U/ul）;1ml連接酶緩沖液10 xbuffer;mlddWater，總量10ml體系

9、。 （3） 述混合液輕輕震蕩后再短暫離心，然后置于14。C干式恒溫儀（或14。C水中）中保溫過(guò)夜（12-16h）。 （4） 連接后的產(chǎn)物可以立即用來(lái)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞或置4。C冰箱備用。 （二） .大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備細(xì)菌轉(zhuǎn)化 儀器：旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭,微量離心管，臺(tái)式冷凍離心機(jī)，制冰機(jī)，恒溫?fù)u床，分光光度計(jì)，超凈工 作臺(tái)，恒溫培養(yǎng)箱，搖菌試管，三角燒瓶，接種環(huán)，恒溫?fù)u床，培養(yǎng)皿（已 鋪好固體LB-Amp）,酒精燈，玻璃涂棒，恒溫培養(yǎng)箱，濾膜和過(guò)濾器 試劑：E.coli菌種，LB培養(yǎng)基，mol/LCaCl2溶液，無(wú)菌ddWater, LB培養(yǎng)基（不加抗菌素），LB培養(yǎng)基（加

10、抗菌素），無(wú)菌ddwater,IPTG, X-gal。 步驟（1）在超凈工作臺(tái)中，將1ml大腸桿菌菌液加入100mlLB液態(tài)培養(yǎng)基（不含 ，應(yīng)該在950ml去離子水中加入：胰化蛋白月東10g酵母提取物 微量離心管，雙面離心 ddWater。 50ml微量離心管, 抗菌素），37c搖床培養(yǎng)過(guò)夜。 (2) 取上述菌液轉(zhuǎn)接到含有50mLLB培養(yǎng)基的三角燒瓶中，37c下250r/min 搖床培養(yǎng)23h,測(cè)定0口590為左右(,細(xì)胞數(shù)108/mL,此為關(guān)鍵參數(shù)！)。(注意：此步搖菌的時(shí)候，要有一管不加菌的LB培養(yǎng)液同時(shí)搖菌) (3) 將1ml菌液加入到4支預(yù)冷無(wú)菌的聚丙烯離心管中，于冰上放置10min,

11、 然后于4C,5000rpm離心5min。 (4) 將離心管倒置以倒盡上清液，加入1ml冰冷的mol/LCaCl2溶液，立即在渦旋混合器上混勻，插入冰中放置30mino (5) 4C,5000rpm離心5min,棄上清液后，用100dL冰冷的mol/LCaCl2溶液垂懸，插入冰中放置2h,可以直接用作轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，或立即放入-4攝氏度冰柜中保藏。 (6) 事先將恒溫水浴的溫度調(diào)到42o (7)從-70C超低溫冰柜中取出一管(100LL)感受態(tài)菌，立即用手指加溫融 化后插入冰上，冰浴510min。 (8)加入5dL連接好的質(zhì)粒混合液(DNA含量不超過(guò)100ng),輕輕震蕩后放 置冰上20min。 (

12、9) 輕輕搖勻后插入42c水浴中90s進(jìn)行熱休克，然后迅速放回冰中，靜置3min。 (10) 在超凈工作臺(tái)中向上述各管中分別加入300科LLB培養(yǎng)基(不含抗菌素) 輕輕混勻，然后固定到搖床的彈簧架上37c震蕩1h。 (11)在超凈工作臺(tái)中取上述轉(zhuǎn)化混合液200dL,分別滴到含合適抗菌素(Amp 100ug/L)的固體LB平板培養(yǎng)皿中，再在平板上滴加40dL20mg/mlX-gal,7L 200mg/mlIPTG,用酒精燈燒過(guò)的玻璃涂布棒涂布均勻(注意： 一個(gè)不含抗生素作為對(duì)照組， 玻璃涂布棒上的酒精熄滅后稍等片刻，待其冷卻后再涂，菌液涂皿操作時(shí)，應(yīng)避免反復(fù)來(lái)回涂布，因?yàn)楦惺軕B(tài)細(xì)菌的細(xì)胞壁有了變

13、化，過(guò)多的機(jī)械擠壓涂布會(huì)使細(xì)胞破裂，影響轉(zhuǎn)化率。)。 (12) 在涂好的培養(yǎng)皿上做上標(biāo)記，先放置在37c恒溫培養(yǎng)箱中30min直到表 面的液體都滲透到培養(yǎng)基里后，再倒置過(guò)來(lái)放入37C恒溫培養(yǎng)箱過(guò)夜。 (13) 在被細(xì)菌污染的桌面上噴灑70叱醇，擦干桌面。 (14) 觀察平板上長(zhǎng)出的菌落克隆，以菌落之間能互相分開(kāi)為好。注意白色菌斑。 (三).轉(zhuǎn)化克隆的篩選和鑒定 器材旋渦混合器，小鐐子，微量移液取樣器，移液器吸頭，微量離心管，雙 面離心管架，干式恒溫氣浴(或恒溫水浴鍋)，制冰機(jī)，恒溫?fù)u床，超凈工作臺(tái)，酒精燈，無(wú)菌牙簽，搖菌管。 試齊ILB培養(yǎng)基(加抗菌素)，PCR用試劑，引物，質(zhì)粒提取用試劑，酶

14、切需要 的限制性?xún)?nèi)且酶及其緩沖液，65%甘油(65%甘油，LMgSO4,LTrisCl)。 操作步驟方法一：快速PCR篩選法 (1) 在轉(zhuǎn)化的平板培養(yǎng)基上隨機(jī)選取4個(gè)邊緣清晰的白色菌落，并用記號(hào)筆 在其所在的培養(yǎng)皿底部玻璃背面畫(huà)圈做標(biāo)記編號(hào)。 (2)在PCR微量離心管中配制25科l反應(yīng)體系。 ddwater16科l 10 xPCRbuffer(不含MgCl2)科l 25mMMgCl2科l LdNTP2pl(每種dNTP終濃度) 10mol/LPrimer11科l(25pmoles) 10mol/Lprimer21科l(-25pmoles) 模板質(zhì)粒用小tip頭輕輕粘一下選中的白色菌落，再伸入P

15、CR混合液中洗一洗 Taq酶(1l() 總體積25科l (2)根據(jù)廠商的操作手冊(cè)設(shè)置PCR儀的循環(huán)程序(本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)設(shè)置為WZ: 94c5min94C1min60C1min72C1min50sgoto29times72c10min (2) PCR結(jié)束后， 取10l產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(與原始插入片斷同時(shí)比對(duì))。 觀察膠上是否有預(yù)計(jì)的主要產(chǎn)物帶。 (3)按照編號(hào)找到培養(yǎng)皿中的原菌斑。根據(jù)需要進(jìn)行放大培養(yǎng)提取其質(zhì)粒 (4)提取到的質(zhì)粒與原先的空載體(或已知分子量的質(zhì)粒)再對(duì)比電泳，以進(jìn)一步確認(rèn)。 方法二：提質(zhì)粒再PCR或酶切鑒定 (1)在超凈工作臺(tái)中取3支無(wú)菌搖菌管，各加入3mLLB(含50mg/mL氨茉青霉 素)，用記號(hào)筆寫(xiě)好編號(hào)。 (2)在超凈工作臺(tái)中將70%乙醇浸泡的小鐐子頭用酒精燈烤過(guò)，鐐?cè)∫恢o(wú)菌牙 簽。用牙簽的尖部接觸轉(zhuǎn)化的平板培養(yǎng)基上的一個(gè)白色菌落，然后將牙簽放入盛有 3mLLB(含50mg/mL氨茉青霉素)的搖