表面活性劑對(duì)黃芩苷與人血清白蛋白相互作用的影響

1、表面活性劑對(duì)黃芩苷與人血清白蛋白相互作用的影響         11-04-23 16:03:00     編輯：studa20                   作者：劉彩紅，李玉琴，齊永秀【摘要】  目的以光譜技術(shù)研究表面活性劑十二烷基硫酸鈉(SDS)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB

2、)和吐溫-80(TW-80)對(duì)中藥有效成分黃芩苷與人血清白蛋白(HSA)的相互作用機(jī)制的影響。方法用熒光光譜及紫外光譜技術(shù)。結(jié)果表面活性劑存在時(shí)靜態(tài)猝滅和非輻射能量轉(zhuǎn)移仍是黃芩苷猝滅HSA內(nèi)源性熒光的主要原因;CTAB和TW-80存在時(shí)，結(jié)合常數(shù)明顯降低，SDS存在時(shí)結(jié)合常數(shù)增加。結(jié)論表面活性劑的存在沒有改變黃芩苷對(duì)HSA內(nèi)源性熒光猝滅的機(jī)理，但使黃芩苷與HSA間的主要作用力由靜電作用轉(zhuǎn)化為疏水作用。 【關(guān)鍵詞】  黃芩苷; 人血清白蛋白; 表面活性劑血液是一多組分復(fù)雜系統(tǒng)，來源于藥物制劑中的其它成分必然對(duì)藥物與血清白蛋白的結(jié)合產(chǎn)生某種擾動(dòng)作用，進(jìn)而影響藥物的分布、轉(zhuǎn)運(yùn)和貯存形態(tài)甚至

3、藥物的藥效。一些表面活性劑如十二烷基硫酸鈉(sodium dodecylsulfate，SDS)、吐溫-80(TW-80)等常被用作乳化劑、潤濕劑、增溶劑或分散劑等加入藥物制劑。因此，研究表面活性劑對(duì)藥物與蛋白質(zhì)分子相互作用的影響很有意義。中藥有效成分黃芩苷分子結(jié)構(gòu)如圖1 所示，屬于黃酮類化合物，存在于多種植物中，具有抗氧化1、預(yù)防缺血性腦中風(fēng)2、解熱3等藥理作用。本文運(yùn)用熒光光譜、紫外光譜等技術(shù)，研究了表面活性劑的存在對(duì)黃芩苷與HSA相互作用的影響。這對(duì)闡明黃芩苷制品在體內(nèi)的輸送和代謝過程具有重要的意義。圖1 黃芩苷的分子結(jié)構(gòu)1 儀器和試劑RF-5301PC型熒光光度計(jì)(日本島津公司);UV

4、-2450PC紫外可見分光光度計(jì)(日本島津公司);人血清白蛋白(HSA，德國Merck公司)，用pH7.40的Tris-HCl緩沖溶液(含0.1 mol·L-1NaCl)配制，其儲(chǔ)備液濃度為1.5×10-5mol·L-1，4保存;黃芩苷(中國藥品生物制品檢定所)，儲(chǔ)備液(1.0×10-3 mol·L-1)用無水甲醇配制;其他試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為二次去離子水。2 方法在3ml含有1.0×10-5mol·L-1HSA溶液的比色皿中，以微量注射器逐次加入不同體積的黃芩苷儲(chǔ)備液(累加體積<100 l)，為了使反應(yīng)更加完

5、全設(shè)定反應(yīng)時(shí)間為5 min。激發(fā)和發(fā)射光柵狹縫均為5 nm，以280 nm為激發(fā)波長，在不同溫度下掃描300500 nm范圍內(nèi)HSA與黃芩苷作用的熒光光譜。以Tris-HCl緩沖溶液為溶劑，配制1.0×10-5mol·L-1的黃芩苷溶液，實(shí)驗(yàn)溫度下恒溫測定其300500 nm的紫外可見吸收光譜。2 結(jié)果2.1 無表面活性劑時(shí)黃芩苷與HSA的相互作用2.1.1 熒光猝滅機(jī)理用黃芩苷滴定HSA溶液的過程中，HSA的熒光被猝滅(如圖2)，說明二者發(fā)生了相互作用。由圖2可見HSA在337 nm處熒光強(qiáng)度隨藥物濃度增加而逐漸減小，若將此猝滅歸因于分子碰撞引起的動(dòng)態(tài)猝滅，則依照Ster

6、n-Volmer方程和Ksv=kqT0(kq是雙分子動(dòng)態(tài)猝滅速率常數(shù);T0是生物大分子內(nèi)源性熒光壽命，本文取T0=10-8s4)得Kq值為1013量級(jí)，遠(yuǎn)大于猝滅劑對(duì)生物大分子的最大動(dòng)態(tài)猝滅速率常數(shù)(2.0×1010L·mol-1·s-1)，故黃芩苷對(duì)HSA熒光的猝滅過程主要為靜態(tài)猝滅過程5。圖3中黃芩苷的紫外吸收光譜與HSA的熒光發(fā)射光譜有相當(dāng)程度的重疊現(xiàn)象，據(jù)Frster無輻射能量轉(zhuǎn)移理論6，黃芩苷與HSA之間存在著非輻射能量轉(zhuǎn)移，因此可以判斷非輻射能量轉(zhuǎn)移與靜態(tài)猝滅一樣也是導(dǎo)致黃芩苷對(duì)HSA熒光猝滅的原因之一。CHSA:1.0×10-6mol

7、83;L-1;Cbaicalin /10-6mol·L-1,從上至下: 0, 0.5, 1.0, , 2.0, 3.0, 4.0, 5.0，6.0，7.0圖2 黃芩苷與HSA相互作用的熒光猝滅圖圖3 黃芩苷紫外吸收光譜與HSA熒光發(fā)射光譜重疊圖2.1.2 黃芩苷與HSA的結(jié)合常數(shù)及結(jié)合力類型藥物與血漿蛋白的結(jié)合是決定藥物分布和作用的一個(gè)重要因素。根據(jù)公式：lg(F0-F)/F =lgKA+nlgQ以lg(F0-F)/F 對(duì)lgQ作圖，可得結(jié)合常數(shù)KA的值(見表1)，反應(yīng)的結(jié)合常數(shù)可達(dá)105，說明黃芩苷與HAS有較強(qiáng)的結(jié)合，可生成黃芩苷-HSA復(fù)合物;人血清白蛋白在體內(nèi)能起到儲(chǔ)存和運(yùn)輸

8、藥物的作用，使藥物通過血液循環(huán)達(dá)到作用部位,起到治療的效果。為進(jìn)一步確定黃芩苷與HSA結(jié)合的作用力類型，根據(jù)vant Hoff方程求得了熱力學(xué)參數(shù)(見表1)。由G<0，S>0，可知這是一個(gè)熵增加、Gibbs自由能降低的自發(fā)過程。Ross等7認(rèn)為，S>0是疏水作用的重要特征，而在水溶液中，靜電作用過程也表現(xiàn)為S>0，H<0。從作用過程熱力學(xué)參數(shù)來看，H對(duì)G總體貢獻(xiàn)較大，表明黃芩苷與HSA間疏水作用不是主要的，靜電作用為主要作用力。這可能是由于黃芩苷分子中的5-OH與HSA偶極-偶極相互作用的結(jié)果。表1 黃芩苷與HSA相互作用的結(jié)合參數(shù)2.2 表面活性劑存在時(shí)黃芩苷與

9、HSA的相互作用分別配制含有一定濃度陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉(SDS)、陽離子表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)和非離子表面活性劑吐溫-80(TW-80)的HSA標(biāo)準(zhǔn)溶液，其他條件同上，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。3種表面活性劑參與時(shí)黃芩苷對(duì)HSA的熒光猝滅結(jié)果見圖4。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)按照Stern-Volmer方程處理的結(jié)果，由Frster無輻射能量轉(zhuǎn)移理論計(jì)算得到的r，結(jié)合常數(shù)KA，有關(guān)作用過程的熱力學(xué)參數(shù)計(jì)算值一并列于表2。CHSA:1.0×10-6mol·L-1; Cbaicalin/CHSA=111.HSA 2.HSA+SDS 3.HSA+TW-80 4.HSA+CTAB圖4

10、 表面活性劑CTAB、SDS和TW-80存在時(shí)黃芩苷與HSA相互作用的熒光光譜1.baicalin;2.(1)+TW-80; 3.(1)+SDS; 4.(1)+CTAB圖5 表面活性劑與與黃芩苷作用的紫外吸收光譜圖表2 表面活性劑參與時(shí)黃芩苷-HSA結(jié)合的實(shí)驗(yàn)結(jié)果     11-04-23 16:03:00     編輯：studa20由圖4可見，表面活性劑存在時(shí)黃芩苷對(duì)HSA仍具有猝滅作用，表明黃芩苷與HSA之間仍存在相互作用。綜合表2中結(jié)果可以推斷：表面活性劑存在時(shí)，黃芩苷對(duì)HSA熒光的猝滅機(jī)理沒有發(fā)生改變，靜

11、態(tài)猝滅和非輻射能量轉(zhuǎn)移仍是兩大成因。但表面活性劑的存在影響了黃芩苷與HSA的結(jié)合：當(dāng)CTAB和TW-80存在時(shí)，結(jié)合常數(shù)明顯降低，說明陽離子表面活性劑和非離子表面活性劑的參與增加了藥物分子的游離濃度，有利于藥物快速釋放，發(fā)揮藥效;而當(dāng)SDS存在時(shí)結(jié)合常數(shù)增加，表明陰離子表面活性劑的參與降低了藥物分子的游離濃度，有助于藥物持久緩釋發(fā)揮藥效。由熱力學(xué)函數(shù)計(jì)算知表面活性劑存在時(shí)，黃芩苷與HSA的作用過程仍是一個(gè)熵增加、Gibbs自由能降低的自發(fā)作用過程，但S>0、H>0表明黃芩苷與HSA間作用力由靜電作用為主轉(zhuǎn)變?yōu)橐允杷饔昧橹?。?dǎo)致這種結(jié)果可能存在以下原因：表面活性劑對(duì)蛋白質(zhì)分子構(gòu)象

12、的改變和表面活性劑對(duì)藥物分子的影響。一方面表面活性劑與HSA之間能夠相互結(jié)合，會(huì)導(dǎo)致HSA分子構(gòu)象發(fā)生轉(zhuǎn)變，必然會(huì)影響藥物-HSA的結(jié)合。表面活性劑CTAB和TW-80存在時(shí)，改變了蛋白質(zhì)構(gòu)象，使蛋白質(zhì)親水區(qū)色氨酸殘基的微環(huán)境發(fā)生改變，從而色氨酸殘基微環(huán)境的極性降低，蛋白質(zhì)擴(kuò)展，疏水性增強(qiáng)，破壞了靜電作用力，使黃芩苷與HSA的相互作用以疏水作用力為主，導(dǎo)致二者的結(jié)合減弱，即結(jié)合常數(shù)減小;當(dāng)SDS存在時(shí)，同樣可使色氨酸殘基微環(huán)境的極性降低，然而結(jié)合增強(qiáng)，可能是疏水作用力和靜電作用力正協(xié)同效應(yīng)作用的結(jié)果8。另一方面表面活性劑與藥物分子存在一定的相互作用，如圖5所示CTAB、SDS和TW-80存在時(shí)

13、，黃芩苷的紫外最大吸收峰位置沒有明顯變化，但最大吸光度有所降低，表明CTAB、SDS和TW-80與黃芩苷也存在一定程度的結(jié)合，可能形成了復(fù)合物。這種結(jié)合勢必也會(huì)影響黃芩苷與HSA的結(jié)合。因此，表面活性劑與黃芩苷的結(jié)合及表面活性劑對(duì)蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的破壞影響了黃芩苷與HSA的相互作用。此外表面活性劑與藥物對(duì)HSA同一結(jié)合位點(diǎn)可能存在的競爭性結(jié)合及表面活性劑對(duì)藥物在蛋白上結(jié)合部位的破壞也可能是影響藥物與HSA結(jié)合的原因8。3 結(jié)論本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，表面活性劑CTAB、SDS和TW-80的存在沒有改變黃芩苷對(duì)HSA內(nèi)源性熒光的猝滅作用，靜態(tài)猝滅和非輻射能量轉(zhuǎn)移仍然是猝滅形成的兩大原因;但表面活性劑的

14、存在影響了黃芩苷-HSA復(fù)合物的穩(wěn)定性，改變了主要結(jié)合力的類型，使靜電作用力為主轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷饔昧橹?。這些結(jié)果為了解黃芩苷制劑在體內(nèi)的運(yùn)輸和分布，闡明其作用機(jī)制等提供理論依據(jù)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 Akao T, Hanada M, Sakashita Y, et al. Efflux of baicalin, a flavone glucuronide of Scutellariae Radix, on Caco-2 cells through multidrug resistance-associated protein 2J.J.Pharm.Pharmacol，2007，59：8

15、7.2 Zhang Z J, Li P, Wang Z, et al. A comparative study on the individual and combined effects of baicalin and jasminoidin on focal cerebral ischemia-reperfusion injuryJ. Brain Res，2006，1123：188.3 尹華熙,白筱璐,鄧文龍.黃芩的解熱作用研究J.中藥藥理與臨床，2007，23(6)：51.4 楊 頻，高 飛. 生物無機(jī)化學(xué)原理M. 北京：科學(xué)出版社, 2002.5 Wang C, Wu Q H, Li

16、C R, et al. Interaction of tetrandrine with human serum albumin: a fluorescence quenching studyJ.Anal.Sci,2007,23(4): 429.6 Frster T, Sinanog lu O. Modern Quantum Chemistry M.New York: Academic Press, 1966.7 Ross P D, Subramanian S. Thermodynamic of protein association reaction: forces contributing

17、to stabilityJ.Bio-chemistry,1981,20(11):3096.8 Gelamo E L, Tabak M，Spectroscopic studies on the interaction of bovine(BSA) and human(HSA) serum albumins with ionic surfactantsJ.Spectrochimica Acta Part A,2000,56:2255.     11-04-23 16:03:00     編輯：studa20由圖4可見，

18、表面活性劑存在時(shí)黃芩苷對(duì)HSA仍具有猝滅作用，表明黃芩苷與HSA之間仍存在相互作用。綜合表2中結(jié)果可以推斷：表面活性劑存在時(shí)，黃芩苷對(duì)HSA熒光的猝滅機(jī)理沒有發(fā)生改變，靜態(tài)猝滅和非輻射能量轉(zhuǎn)移仍是兩大成因。但表面活性劑的存在影響了黃芩苷與HSA的結(jié)合：當(dāng)CTAB和TW-80存在時(shí)，結(jié)合常數(shù)明顯降低，說明陽離子表面活性劑和非離子表面活性劑的參與增加了藥物分子的游離濃度，有利于藥物快速釋放，發(fā)揮藥效;而當(dāng)SDS存在時(shí)結(jié)合常數(shù)增加，表明陰離子表面活性劑的參與降低了藥物分子的游離濃度，有助于藥物持久緩釋發(fā)揮藥效。由熱力學(xué)函數(shù)計(jì)算知表面活性劑存在時(shí)，黃芩苷與HSA的作用過程仍是一個(gè)熵增加、Gibbs自由

19、能降低的自發(fā)作用過程，但S>0、H>0表明黃芩苷與HSA間作用力由靜電作用為主轉(zhuǎn)變?yōu)橐允杷饔昧橹鳌?dǎo)致這種結(jié)果可能存在以下原因：表面活性劑對(duì)蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的改變和表面活性劑對(duì)藥物分子的影響。一方面表面活性劑與HSA之間能夠相互結(jié)合，會(huì)導(dǎo)致HSA分子構(gòu)象發(fā)生轉(zhuǎn)變，必然會(huì)影響藥物-HSA的結(jié)合。表面活性劑CTAB和TW-80存在時(shí)，改變了蛋白質(zhì)構(gòu)象，使蛋白質(zhì)親水區(qū)色氨酸殘基的微環(huán)境發(fā)生改變，從而色氨酸殘基微環(huán)境的極性降低，蛋白質(zhì)擴(kuò)展，疏水性增強(qiáng)，破壞了靜電作用力，使黃芩苷與HSA的相互作用以疏水作用力為主，導(dǎo)致二者的結(jié)合減弱，即結(jié)合常數(shù)減小;當(dāng)SDS存在時(shí)，同樣可使色氨酸殘基微環(huán)境

20、的極性降低，然而結(jié)合增強(qiáng)，可能是疏水作用力和靜電作用力正協(xié)同效應(yīng)作用的結(jié)果8。另一方面表面活性劑與藥物分子存在一定的相互作用，如圖5所示CTAB、SDS和TW-80存在時(shí)，黃芩苷的紫外最大吸收峰位置沒有明顯變化，但最大吸光度有所降低，表明CTAB、SDS和TW-80與黃芩苷也存在一定程度的結(jié)合，可能形成了復(fù)合物。這種結(jié)合勢必也會(huì)影響黃芩苷與HSA的結(jié)合。因此，表面活性劑與黃芩苷的結(jié)合及表面活性劑對(duì)蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的破壞影響了黃芩苷與HSA的相互作用。此外表面活性劑與藥物對(duì)HSA同一結(jié)合位點(diǎn)可能存在的競爭性結(jié)合及表面活性劑對(duì)藥物在蛋白上結(jié)合部位的破壞也可能是影響藥物與HSA結(jié)合的原因8。3 結(jié)論本

21、實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，表面活性劑CTAB、SDS和TW-80的存在沒有改變黃芩苷對(duì)HSA內(nèi)源性熒光的猝滅作用，靜態(tài)猝滅和非輻射能量轉(zhuǎn)移仍然是猝滅形成的兩大原因;但表面活性劑的存在影響了黃芩苷-HSA復(fù)合物的穩(wěn)定性，改變了主要結(jié)合力的類型，使靜電作用力為主轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷饔昧橹?。這些結(jié)果為了解黃芩苷制劑在體內(nèi)的運(yùn)輸和分布，闡明其作用機(jī)制等提供理論依據(jù)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 Akao T, Hanada M, Sakashita Y, et al. Efflux of baicalin, a flavone glucuronide of Scutellariae Radix, on Caco-2

22、 cells through multidrug resistance-associated protein 2J.J.Pharm.Pharmacol，2007，59：87.2 Zhang Z J, Li P, Wang Z, et al. A comparative study on the individual and combined effects of baicalin and jasminoidin on focal cerebral ischemia-reperfusion injuryJ. Brain Res，2006，1123：188.3 尹華熙,白筱璐,鄧文龍.黃芩的解熱作

23、用研究J.中藥藥理與臨床，2007，23(6)：51.4 楊 頻，高 飛. 生物無機(jī)化學(xué)原理M. 北京：科學(xué)出版社, 2002.5 Wang C, Wu Q H, Li C R, et al. Interaction of tetrandrine with human serum albumin: a fluorescence quenching studyJ.Anal.Sci,2007,23(4): 429.6 Frster T, Sinanog lu O. Modern Quantum Chemistry M.New York: Academic Press, 1966.7 Ross P

24、D, Subramanian S. Thermodynamic of protein association reaction: forces contributing to stabilityJ.Bio-chemistry,1981,20(11):3096.8 Gelamo E L, Tabak M，Spectroscopic studies on the interaction of bovine(BSA) and human(HSA) serum albumins with ionic surfactantsJ.Spectrochimica Acta Part A,2000,56:225

25、5.     11-04-23 16:03:00     編輯：studa20由圖4可見，表面活性劑存在時(shí)黃芩苷對(duì)HSA仍具有猝滅作用，表明黃芩苷與HSA之間仍存在相互作用。綜合表2中結(jié)果可以推斷：表面活性劑存在時(shí)，黃芩苷對(duì)HSA熒光的猝滅機(jī)理沒有發(fā)生改變，靜態(tài)猝滅和非輻射能量轉(zhuǎn)移仍是兩大成因。但表面活性劑的存在影響了黃芩苷與HSA的結(jié)合：當(dāng)CTAB和TW-80存在時(shí)，結(jié)合常數(shù)明顯降低，說明陽離子表面活性劑和非離子表面活性劑的參與增加了藥物分子的游離濃度，有利于藥物快速釋放，發(fā)揮藥效;而當(dāng)SDS存在時(shí)結(jié)合常數(shù)增加，

26、表明陰離子表面活性劑的參與降低了藥物分子的游離濃度，有助于藥物持久緩釋發(fā)揮藥效。由熱力學(xué)函數(shù)計(jì)算知表面活性劑存在時(shí)，黃芩苷與HSA的作用過程仍是一個(gè)熵增加、Gibbs自由能降低的自發(fā)作用過程，但S>0、H>0表明黃芩苷與HSA間作用力由靜電作用為主轉(zhuǎn)變?yōu)橐允杷饔昧橹鳌?dǎo)致這種結(jié)果可能存在以下原因：表面活性劑對(duì)蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的改變和表面活性劑對(duì)藥物分子的影響。一方面表面活性劑與HSA之間能夠相互結(jié)合，會(huì)導(dǎo)致HSA分子構(gòu)象發(fā)生轉(zhuǎn)變，必然會(huì)影響藥物-HSA的結(jié)合。表面活性劑CTAB和TW-80存在時(shí)，改變了蛋白質(zhì)構(gòu)象，使蛋白質(zhì)親水區(qū)色氨酸殘基的微環(huán)境發(fā)生改變，從而色氨酸殘基微環(huán)境的極

27、性降低，蛋白質(zhì)擴(kuò)展，疏水性增強(qiáng)，破壞了靜電作用力，使黃芩苷與HSA的相互作用以疏水作用力為主，導(dǎo)致二者的結(jié)合減弱，即結(jié)合常數(shù)減小;當(dāng)SDS存在時(shí)，同樣可使色氨酸殘基微環(huán)境的極性降低，然而結(jié)合增強(qiáng)，可能是疏水作用力和靜電作用力正協(xié)同效應(yīng)作用的結(jié)果8。另一方面表面活性劑與藥物分子存在一定的相互作用，如圖5所示CTAB、SDS和TW-80存在時(shí)，黃芩苷的紫外最大吸收峰位置沒有明顯變化，但最大吸光度有所降低，表明CTAB、SDS和TW-80與黃芩苷也存在一定程度的結(jié)合，可能形成了復(fù)合物。這種結(jié)合勢必也會(huì)影響黃芩苷與HSA的結(jié)合。因此，表面活性劑與黃芩苷的結(jié)合及表面活性劑對(duì)蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的破壞影響了黃芩

28、苷與HSA的相互作用。此外表面活性劑與藥物對(duì)HSA同一結(jié)合位點(diǎn)可能存在的競爭性結(jié)合及表面活性劑對(duì)藥物在蛋白上結(jié)合部位的破壞也可能是影響藥物與HSA結(jié)合的原因8。3 結(jié)論本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，表面活性劑CTAB、SDS和TW-80的存在沒有改變黃芩苷對(duì)HSA內(nèi)源性熒光的猝滅作用，靜態(tài)猝滅和非輻射能量轉(zhuǎn)移仍然是猝滅形成的兩大原因;但表面活性劑的存在影響了黃芩苷-HSA復(fù)合物的穩(wěn)定性，改變了主要結(jié)合力的類型，使靜電作用力為主轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷饔昧橹?。這些結(jié)果為了解黃芩苷制劑在體內(nèi)的運(yùn)輸和分布，闡明其作用機(jī)制等提供理論依據(jù)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 Akao T, Hanada M, Sakashita Y, et al. Efflux of baicalin, a flavone glucuron