蛋白質(zhì)的純化方法

1、l在外加電場(chǎng)作用下，帶電的蛋白質(zhì)顆在外加電場(chǎng)作用下，帶電的蛋白質(zhì)顆粒在電場(chǎng)中移動(dòng)的速度（粒在電場(chǎng)中移動(dòng)的速度（v v）取決于）取決于電場(chǎng)強(qiáng)度電場(chǎng)強(qiáng)度(E)(E)，所帶的凈電荷，所帶的凈電荷(q)(q)，蛋，蛋白質(zhì)的分子量、分子形狀以及與介質(zhì)白質(zhì)的分子量、分子形狀以及與介質(zhì)的摩擦系數(shù)的摩擦系數(shù)( (f)f)。l紙電泳紙電泳l醋酸纖維薄膜電泳醋酸纖維薄膜電泳l聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE) (可分為圓盤電泳和垂直平板電泳）可分為圓盤電泳和垂直平板電泳）l瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳lSDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳l等電聚焦等電聚焦(IEF)l雙向電泳雙向電泳l聚丙烯

2、酰胺凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE)PAGE)是利用是利用聚丙烯酰胺凝膠作為支持物的電泳法，聚丙烯酰胺凝膠作為支持物的電泳法，聚丙烯酰胺凝膠是由單體聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙稀酰胺丙稀酰胺和和交聯(lián)劑交聯(lián)劑甲叉雙丙稀酰胺甲叉雙丙稀酰胺交聯(lián)而成的多交聯(lián)而成的多孔網(wǎng)狀凝膠?？拙W(wǎng)狀凝膠。l不連續(xù)不連續(xù)PAGEPAGE有分離膠、濃縮膠和樣品有分離膠、濃縮膠和樣品膠。膠。lPAGEPAGE分辨率很高。分辨率很高。電影電影l(fā)SDSSDS（十二烷基磺酸鈉十二烷基磺酸鈉）是一種陰離子）是一種陰離子型表面活性劑，它能夠與蛋白質(zhì)多肽型表面活性劑，它能夠與蛋白質(zhì)多肽鏈中的氨基酸殘基按大約鏈中的氨基酸殘基按大約1

3、 1 1.4 1.4比例比例結(jié)合。結(jié)合。l每一個(gè)蛋白質(zhì)分子都因?yàn)榻Y(jié)合了許多每一個(gè)蛋白質(zhì)分子都因?yàn)榻Y(jié)合了許多的的SDSSDS而帶有大量的負(fù)電荷，而蛋白質(zhì)而帶有大量的負(fù)電荷，而蛋白質(zhì)分子原有的電荷則可以忽略。該法主分子原有的電荷則可以忽略。該法主要利用了蛋白質(zhì)分子量大小不同而分要利用了蛋白質(zhì)分子量大小不同而分離蛋白質(zhì)。離蛋白質(zhì)。l用已知分子量的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)，則用已知分子量的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)，則可以估算出不同蛋白質(zhì)的分子量?？梢怨浪愠霾煌鞍踪|(zhì)的分子量。蛋白質(zhì)的純化方法蛋白質(zhì)的純化方法l將兩性電解質(zhì)將兩性電解質(zhì)( (egeg:pH3-9:pH3-9，pH5-7)pH5-7)同同蛋白質(zhì)樣品一起加入到已

4、經(jīng)灌好的蛋白質(zhì)樣品一起加入到已經(jīng)灌好的凝膠中，在電場(chǎng)下，兩性電解質(zhì)首凝膠中，在電場(chǎng)下，兩性電解質(zhì)首先達(dá)到它的等電點(diǎn)而平衡，蛋白質(zhì)先達(dá)到它的等電點(diǎn)而平衡，蛋白質(zhì)樣品根據(jù)它自身的等電點(diǎn)分別向兩樣品根據(jù)它自身的等電點(diǎn)分別向兩極移動(dòng)，最后也達(dá)到平衡。極移動(dòng)，最后也達(dá)到平衡。l等電聚焦：這種按等電點(diǎn)的大小，生物等電聚焦：這種按等電點(diǎn)的大小，生物分子在分子在pH梯度的某一相應(yīng)位置上進(jìn)行聚梯度的某一相應(yīng)位置上進(jìn)行聚焦的行為稱焦的行為稱等電聚焦等電聚焦。l等電聚焦的特點(diǎn)就在于它利用了一種稱為兩性電解質(zhì)載體的物質(zhì)在電場(chǎng)中構(gòu)成連續(xù)的pH梯度，使蛋白質(zhì)或其他具有兩性電解質(zhì)性質(zhì)的樣品進(jìn)行聚焦，從而達(dá)到分離、測(cè)定和鑒定

5、的目的。 銀染結(jié)果銀染結(jié)果考馬斯亮染色為藍(lán)色考馬斯亮染色為藍(lán)色柱層析柱層析蛋白質(zhì)的純化方法蛋白質(zhì)的純化方法l此法是利用離子交換樹脂作為柱層析支持物，此法是利用離子交換樹脂作為柱層析支持物，將帶有不同電荷的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離的方法。將帶有不同電荷的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離的方法。l離子交換樹脂可以分為陽(yáng)離子交換纖維素離子交換樹脂可以分為陽(yáng)離子交換纖維素, ,如羧甲基纖維素如羧甲基纖維素( (CMCM纖維素纖維素）等，陰離子交）等，陰離子交換纖維素?fù)Q纖維素, ,如二乙基氨基乙基纖維素（如二乙基氨基乙基纖維素（DEAEDEAE纖維素纖維素）等。）等。l帶正電荷多的蛋白質(zhì)與纖維素結(jié)合較強(qiáng)，而帶正電荷多的蛋白質(zhì)與纖維

6、素結(jié)合較強(qiáng)，而帶正電荷少的蛋白質(zhì)與纖維素結(jié)合則較弱。帶正電荷少的蛋白質(zhì)與纖維素結(jié)合則較弱。用不同濃度的陽(yáng)離子洗脫液，如用不同濃度的陽(yáng)離子洗脫液，如NaClNaCl溶液進(jìn)溶液進(jìn)行梯度洗脫，通過(guò)行梯度洗脫，通過(guò)NaNa+ +的離子交換作用，可的離子交換作用，可以將帶有不同正電荷的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。以將帶有不同正電荷的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。離子交換層析法離子交換層析法離子交換層析法離子交換層析法l此法又稱為此法又稱為分子篩層析分子篩層析。凝膠過(guò)濾所。凝膠過(guò)濾所用的介質(zhì)是由交聯(lián)用的介質(zhì)是由交聯(lián)葡萄糖葡萄糖、瓊脂糖瓊脂糖或或聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺形成的凝膠珠。凝膠珠的形成的凝膠珠。凝膠珠的內(nèi)部是多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。內(nèi)

7、部是多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。lSephadexSephadex G10-G200( G10-G200(葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠) )lSepharoseSepharose2B,4B,6B(2B,4B,6B(瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠) )lSephacrylSephacryl S100,S200,S300,S400 S100,S200,S300,S400 ( (聚丙烯酰胺葡聚糖凝膠聚丙烯酰胺葡聚糖凝膠) )蛋白質(zhì)的純化方法蛋白質(zhì)的純化方法l這是一種這是一種高效分離純化高效分離純化蛋白的方法。其原理蛋白的方法。其原理是不同的蛋白質(zhì)分子對(duì)于固定化在載體上的是不同的蛋白質(zhì)分子對(duì)于固定化在載體上的特殊配基具有不同的識(shí)別

8、和結(jié)合能力。特殊配基具有不同的識(shí)別和結(jié)合能力。l選擇與待純化蛋白質(zhì)具有特殊識(shí)別和結(jié)合作選擇與待純化蛋白質(zhì)具有特殊識(shí)別和結(jié)合作用的配基，然后應(yīng)用化學(xué)方法將該配基與載用的配基，然后應(yīng)用化學(xué)方法將該配基與載體共價(jià)連接。將這種連接有配基的載體裝入體共價(jià)連接。將這種連接有配基的載體裝入層析柱中，當(dāng)含有待純化的蛋白質(zhì)溶液通過(guò)層析柱中，當(dāng)含有待純化的蛋白質(zhì)溶液通過(guò)層析柱時(shí)，該蛋白質(zhì)即與配基發(fā)生特異性結(jié)層析柱時(shí)，該蛋白質(zhì)即與配基發(fā)生特異性結(jié)合而被吸附在層析柱上，而其它蛋白質(zhì)則流合而被吸附在層析柱上，而其它蛋白質(zhì)則流出柱外。被特異性結(jié)合在層析柱上的蛋白質(zhì)，出柱外。被特異性結(jié)合在層析柱上的蛋白質(zhì)，可以用適當(dāng)?shù)呐潴w洗脫液洗脫。可以用適當(dāng)?shù)呐潴w洗脫液洗脫。l 常用的配基有抗體、抗原、激素或受體蛋常用的配基有抗體、抗原、激素或受體蛋白、酶的底物和抑制劑等。層析柱載體為瓊白、酶的底物和抑制劑等。層析柱載體為瓊脂糖凝膠等。脂糖凝膠等。l純度和分子量的測(cè)定純度和分子量的測(cè)定：采用電泳采用電泳（如聚丙烯酰胺凝膠電泳）、分子（如聚丙烯酰胺凝膠電泳）、分子篩層析、高速離心、高效液相色譜篩層