丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)區(qū)抗原制備及其相應(yīng)抗體的檢測

1、    丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)區(qū)抗原制備及其相應(yīng)抗體的檢測        【摘要】目的研究丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)區(qū)3(Hepatitis C virus nonstructurd region 3, HCV-NS3)與丙型肝炎發(fā)病的關(guān)系，尋求一種可用于判斷臨床干擾素(Interferon,IFN)治療療效的檢測方法。方法采用基因重組，經(jīng)大腸埃希菌表達(dá)，提取HCV-NS3不同末端蛋白作為抗原，并回顧性的對IFN治療的63例HCV-RNA陽性的丙型肝炎患者血清用免疫印跡(Western

2、blot)方法，進(jìn)行了相應(yīng)抗體檢測。結(jié)果證實HCV-NS3不同末端抗體在丙型肝炎患者，特別是慢性丙型肝炎患者，與IFN治療療效關(guān)系密切。結(jié)論通過測定HCV-NS3不同末端抗體的方法有可能對丙型肝炎，特別是慢性丙型肝炎患者的IFN治療效果進(jìn)行評價，為預(yù)測療效提供了一個新的手段和依據(jù)?！局黝}詞】肝炎，丙型； 肝炎病毒，丙型； 基因，免疫球蛋白； 基因，結(jié)構(gòu)，病毒； 序列分析 Preparation of hepatitis C virus nonstructural region antigens and detection of their relative antibodiesPENG Xia

3、ngxin（Department of General Internal Medicine, China-Japan Friendship Hospital, Beijing, 100029, China）WANG Qinhuan【Abstract】ObjectiveTo investigate the relationship between HCV NS3 and the pathogenesis of HCV and research a method to assess the therapeutic effect of interferon (IEN) in clinicl.Meth

4、odsIn a retrospective research,we used HCV-NS3 antigens of different terminals expressed in E. coli. in which contained the recombinant plasmids involving amino terminal region (N) or carboxyl terminal region(C) of HCV-NS3, to detect the antibodies by Western blot in sera of 63 hepatitis C patients

5、who were treated with IFN.ResultsIt proved that antibodies against HCV-NS3 N and/or HCV NS3 C terminals in hepatitis C patients may predict the treatment result of IFN, especially in the patients with chronic hepatitis C.ConclusionThe detection of antibodies against HCV-NS3 N and/or C terminals may

6、be used for evaluation of IFN treatment, especially in chronic hepatitis C ones.【Key words】Hepatitis C; Hepatitis C virus (HCV); Gene, immunoglobulin; Genes, structural, viral; Sequence analysis丙型病毒性肝炎(以下簡稱丙型肝炎)與乙型肝炎相比，由于在臨床上常具有無明顯癥狀和體征，易于形成慢性感染，肝硬化、肝癌發(fā)生率高等特點，而受到廣泛重視。為了提供更好的指導(dǎo)診斷治療和評價預(yù)后的方法，檢測手段不斷問世，如

7、：測定抗-HCV的酶聯(lián)免疫法(EILSA)，反映病毒復(fù)制狀態(tài)的HCV-RNA多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)和基因分型、病理等各種方法，在臨床早期診斷和獻(xiàn)血員篩選方面有一定的應(yīng)用價值。但在用于藥物療效和疾病預(yù)后判斷方面仍不盡人意。丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)區(qū)(HCV-NS3)是HCV基因組中較特殊的一個部分，它可編碼不同功能的蛋白質(zhì)，具有多種酶活性。在HCV復(fù)制中起重要作用。與丙型肝炎發(fā)病與復(fù)發(fā)密切相關(guān)。由于HCV-NS3不同末端的抗體，目前尚無檢測的試劑盒，故應(yīng)用分子生物學(xué)方法，分別將HCV-NS3氨基末端(N)和羧基末端(C)片段進(jìn)行重組。利用在大腸埃希菌中所表達(dá)的相應(yīng)蛋白作為抗原，檢測血清中相應(yīng)抗體，來探

8、討其與干擾素(Interferon,IFN)治療療效及預(yù)后關(guān)系。1材料和方法12O2 28 l,H2O 36 ml。0.05 M HCl終止反應(yīng)，10 s。1.3病例選擇根據(jù)1995年5月北京第五次全國傳染病和寄生蟲學(xué)術(shù)會議制定的病毒性肝炎防治方案(試行)診斷標(biāo)準(zhǔn)。選擇丙型肝炎患者63例(男性54例，女性9例)。全部病例RT-PCR方法測定為HCV-RNA陽性。急性肝炎16例，慢性肝炎47例。63例患者中有輸血制品史占87%，急性肝炎患者全部有輸血制品史，慢性肝炎占60%。全部用IFN-2治療，300萬單位肌注連續(xù)3天后，隔日一次，總療程3個月。1.4丙型肝炎患者血清抗HCV-NS3 N和C檢

9、測免疫印跡法。方法同前，僅將標(biāo)準(zhǔn)血清換成待測的患者血清。1.5抗HCV，HCV-RNA及ALT檢測方法略。1.6IFN治療療效判斷標(biāo)準(zhǔn)停藥6個月后追蹤觀察結(jié)果進(jìn)行判斷。完全反應(yīng)：HCV-RNA陰性，ALT正常；部分反應(yīng)：除完全反應(yīng)和無反應(yīng)以外的病例，ALT明顯下降，HCV-RNA陽性；無反應(yīng)：ALT高于治療前或與治療前相同，HCV-RNA陽性；復(fù)發(fā)：治療結(jié)束時，ALT正常，HCV-RNA陰性，在隨訪的6個月內(nèi)又出現(xiàn)ALT升高，伴有或不伴有HCV-RNA陽性。1.7統(tǒng)計學(xué)方法卡方檢驗。2結(jié)果2.1重組前后pGEX DNA限制性內(nèi)切酶BamH和EcoR酶切譜，HCV-NS3見1。HCV-NS3 N

10、為965 bp,HCV-NS3 C為1 031 bp。     pGEX1=pGEX+HCV-NS3NpGEX2=pGEX+HCV-NS3 C1重組質(zhì)粒pGEX BamH和EcoR內(nèi)酶切簽定Fig.1Restriction identification of the recombinant plasmids pGEX(pGEX1/BamHand EcoR,pGEX2/BamHand EcoR)1顯示：BamH 和EcoR 酶切后在瓊脂糖電泳上的DNA條帶。中標(biāo)記Marker1和Marker2分別為標(biāo)準(zhǔn)核苷酸/Hind digest和174/X Hinc

11、digest。2.2蛋白質(zhì)表達(dá)和抗原性鑒定重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸埃希菌BL21后，異丙基硫代-D-半乳糖苷(Isopropylthio-D-galactoside,IPTG)誘導(dǎo)產(chǎn)生相對分子質(zhì)量為49 000和32 000二條增寬蛋白帶。用已知抗HCV-NS3陽性標(biāo)準(zhǔn)血清測定。Western blot測定后的HCV-NS3 N和C蛋白抗原性，見2。經(jīng)二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色在相應(yīng)相對分子質(zhì)量32 000和49 000區(qū)出現(xiàn)的蛋白條帶。證實為HCV-NS3 N和C蛋白。     2表達(dá)蛋白與HCV陽性血清的Western blot鑒定結(jié)果Fig.2Wester

12、n blot analysis of the expressed proteins with hepatitis C positive serum表1丙型肝炎患者抗NS3-N和抗NS3-C狀態(tài)與IFN療效關(guān)系Tab.1Relationship between status of HCV-NS3 N, HCV-NS3 C of the patients and the therapeutic effect of IFN對IFN反應(yīng)Response to IFNA組例數(shù)(%)A group Case(%)B組例數(shù)(%)B group Case(%)C組例數(shù)(%)C group Case(%)D組例

13、數(shù)(%)D group Case(%)完全反應(yīng)Sustained response1(14.29)4(50.00)1(4.00)18(78.26)部分反應(yīng) Partial response2(28.57)2(25.00)5(20.00)3(13.04)無反應(yīng)Non response1(14.29)1(12.50)10(40.00)0(0.00)復(fù)發(fā)Relapse3(42.86)1(12.50)9(36.00)2(8.70)合計Total782523     注：A組：抗NS3-N(+)和抗HCV-NS3 C(+).B組：抗NS3-N(+)和抗HCV-NS

14、3 C(-).C組：抗NS3-N(-)和抗HCV-NS3 C(+).D組：抗NS3-N(-)和抗HCV-NS3 C(-)。Note: A group: Anti-NS3 N(+), anti-NS3 C(+). B group: Anti-NS3 N(+), anti-NS3 C(-). C group: Anti-NS3 N(-), anti-NS3 C(+). D group: Anti-NS3 N(-), anti-NS3 C(-) 表1可見，統(tǒng)計學(xué)處理差異有顯著性。組間兩兩比較，其中AB、AD、BC、CD組間P值分別為<0.05或<0.01。結(jié)果證實：在丙型肝炎患者中，抗H

15、CV-NS3-N和抗HCV-NS3-C均陽性者，完全反應(yīng)率低，而復(fù)發(fā)率高。若患者按抗體檢測情況分為抗NS3-C陽性組：抗HCV-NS3 N陽性、抗HCV-NS3 C陽性和抗HCV-NS3 N陰性、抗HCV-NS3 C陽性的患者；抗NS3-C陰性組：抗HCV-NS3 N陽性、抗HCV-NS3 C陰性和抗HCV-NS3 N陰性、抗HCV-NS3 C 陰性的患者。Group 1：完全反應(yīng)者；Group 2：部分反應(yīng)，無反應(yīng)和復(fù)發(fā)者。同時進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)檢測，見表2。結(jié)果證明在丙型肝炎患者中，抗HCV-NS3 C陽性者完全反應(yīng)率低，復(fù)發(fā)率高。表2丙型肝炎患者完全反應(yīng)和抗HCV-NS3 C陽性、陰性組與IF療

16、效Tab.2Effect of IFN in relation with anti HCV-NS3 Cpositive,negative and respond reaction of hepatitis C patients組別Group抗NS3-CAnti-NS3-C陽性組例數(shù)(%)Group of positivecase(%)陰性組例數(shù)(%)Group of negativecase(%)1a2(6.25)22(70.97)2b30(90.75)9(29.03)合計Total3231     注：P<0.01a：完全反應(yīng)者；b：部分反應(yīng)，無

17、反應(yīng)和復(fù)發(fā)者Note: a: Sustained response. b: Partial response,nonresponse and the relapse 表3慢性丙型肝炎患者抗NS3-N和C狀態(tài)與IFN治療關(guān)系Tab.3Effect of IFN in relation with anti NS3-N or C status and respond reaction of chronic hepatitis C patients對IFN反應(yīng)Response to IFNA組例數(shù)(%)A group Case(%)B組例數(shù)(%)B group Case(%)C組例數(shù)(%)C grou

18、p Case(%)D組例數(shù)(%)D group Case(%)完全反應(yīng)Sustained response1(16.66)3(60.00)1(4.00)9(81.82)部分反應(yīng) Partial response1(16.66)1(20.00)5(20.00)1(9.09)無反應(yīng)Non response1(16.66)1(20.0)10(40.00)0(0.00)復(fù)發(fā)Relapse3(50.00)0(0.00)9(36.00)1(9.09)合計Total652511     注：A組，B組，C組，D組抗HCV-NS3 N,抗HCV-NS3 C狀態(tài)與表1同N

19、ote:The status of anti HCV-NS3 N and anti HCV-NS3 C of group A,B,C,D is identieal with Tab.1. 從表3可見，統(tǒng)計學(xué)處理差異有顯著性。組間兩兩比較，其中AB、AD、BC、CD組間P值分別<0.05或<0.01。結(jié)果證實：慢性丙型肝炎患者中，抗HCV-NS3-N(+)、抗HCV-NS3-C(+)者完全反應(yīng)率低；而抗HCV-NS3-N(+)和抗HCV-NS3-C(-)、抗HCV-NS3-N(-)和抗HCV-NS3-C(-)者完全反應(yīng)率高。表4慢性丙型肝炎患者完全反應(yīng)和抗HCV-NS3 C陽性、陰性

20、組與IFN療效Tab.4Effect of IFN in relation with anti HCV-NS3 C positive,negative and respond reaction of chronic hepatitis C patients組別Group抗NS3-CAnti-NS3-C陽性組例數(shù)(%)Group of positivecase(%)陰性組例數(shù)(%)Group of negativecase(%)1a2(6.25)12(75.00)2b29(93.55)4(25.00)合計Total3116     a,b: Seen th

21、at in Tab.2 從表4可見，慢性丙型肝炎患者，亦是抗HCV-NS3 C陽性者完全反應(yīng)率低，而復(fù)發(fā)率高。統(tǒng)計學(xué)處理差異有顯著性。因此HCV-NS3末端抗體的檢測有可能作為IFN治療丙型肝炎的療效預(yù)測指標(biāo)之一。3討論HCV-NS3按功能特點可分成N和C末端。HCV NS3 N端基因編碼有絲氨酸蛋白酶活性的蛋白與非結(jié)構(gòu)區(qū)蛋白翻譯水平加工后的病毒蛋白生物活性有關(guān)，可用來推測HCV感染性的強弱2，3。C端編碼的456個氨基酸，有RNA-刺激(RNA-stimulated)NTP酶和RNA解鏈酶活性4，這種RNA解鏈酶以與核苷三磷酸相結(jié)合的模式存在參與病毒的復(fù)制過程5，解鏈方向是從35端。由于與R

22、NA復(fù)制中的解鏈有關(guān)，因此可用于判斷復(fù)制活躍程度。已證實HCV NS3在HCV株中具有保守性6。本實驗應(yīng)用HCV-NS3序列的N和C兩段cDNA核苷酸序列，以pGEX為載體，重組cDNA轉(zhuǎn)染大腸埃希菌，表達(dá)出有較高產(chǎn)量、良好抗原性和特異性的相應(yīng)蛋白，已此作為抗原，用于檢測丙型肝炎患者血中相關(guān)抗體。目前大部分HCV診斷試劑來源于合成肽或大腸埃希菌表達(dá)重組蛋白。合成肽抗原因缺乏蛋白天然構(gòu)型而影響敏感性，大腸埃希菌表達(dá)重組蛋白可提高抗原純度，這對保證特異性是十分重要的。從本研究結(jié)果看，應(yīng)用HCV-NS3序列中兩段cDNA核苷酸序列，以pGEX為載體，重組HCV-NS3 cDNA導(dǎo)入大腸埃希菌，可表達(dá)

23、較高產(chǎn)量的相應(yīng)蛋白(見1)。純化后的蛋白作為抗原，有良好抗原性，HCV-NS3抗體陽性血清與抗原具有較好的特異性反應(yīng)(見2)，證實它是一個良好的抗原來源。可用以檢測丙型肝炎患者血清中的相關(guān)抗體。研究應(yīng)用HCV-NS3 N和HCV-NS3 C cDNA表達(dá)相應(yīng)蛋白作為抗原，檢測丙型肝炎患者血中相關(guān)抗體，觀察IFN治療反應(yīng)。追蹤IFN治療結(jié)束后6個月的ALT及HCV RNA結(jié)果與治療前血清HCV-NS3 N和HCV-NS3 C抗體檢測結(jié)果對照，觀察其與IFN療效關(guān)系。結(jié)果顯示，丙肝型炎患者血清HCV-NS3不同末端抗體的陽性與IFN治療療效有一定關(guān)系(見表1.2)，統(tǒng)計學(xué)處理，P<0.05或

24、<0.01有顯著性差異，即抗NS3-C陽性組完全反應(yīng)率低于抗NS3-C陰性組；而復(fù)發(fā)率高。特別是在慢性丙肝型炎患者(見表3.4)。目前丙型肝炎抗病毒治療仍認(rèn)為IFN有確切療效7。但有效率僅為20%40%，且價格昂貴及有毒副作用。影響IFN治療療效有諸多因素，如患者年齡、病期、IFN劑量、療程、HCV基因型和HCV-RNA含量等，但主要是與HCV-RNA含量有密切關(guān)系。HCV-RNA含量測定由于操作復(fù)雜、對血清標(biāo)本保存要求高、成本高等不易在臨床作為常規(guī)檢查應(yīng)用。因此HCV-NS3末端抗體檢測方法似乎可反映HCV在體內(nèi)的復(fù)制情況，有助于預(yù)測丙型肝炎患者的治療反應(yīng)，更好的選擇丙型肝炎患者IFN治療適應(yīng)癥，作為IFN治療丙型肝炎療效預(yù)測指標(biāo)之一。且有檢測方法簡單及成本低的優(yōu)點。由于病例數(shù)尚少，故此方法需進(jìn)一步在臨床驗證。作者單位：彭向欣（100029北京，中日友好醫(yī)院普內(nèi)科）王勤環(huán)（北京醫(yī)科大學(xué)感染疾病科）參考文獻(xiàn)2，Bouffard P, Bartenschlager R, Ahlhorn-laake L., et al. An in vitro assay for hepatitis C virus NS3 serum proteinase. Virology, 1995; 209:52-59.3，Tanji Y, Hijikata M, Satoh S, et a