基因結(jié)構(gòu)與功能

1、分子生物學(xué)第二部分分子生物學(xué)研究的方法策略與技術(shù)支持分子生物學(xué)研究的方法策略與技術(shù)支持任課教師：肖尚英任課教師：肖尚英基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所第七章 基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本方法本章內(nèi)容簡(jiǎn)介：m序列分析；m 核酸雜交；m 體外擴(kuò)增；m 核酸測(cè)定（存在分析有無、多少）；第一節(jié) DNA序列分析Nucleic Acid Sequence Analysisn核酸序列分析的基本原理方法： 化學(xué)裂解法 (Maxam-Gillbert法) 雙脫氧末端終止法 (Sanger法)m核苷酸序列測(cè)定最早始于20世紀(jì)60年代，即Sanger和Brownlee等建

2、立的RNA序列測(cè)定技術(shù)。m真正意義上的DNA序列分析方法，是在具有極高分辨率的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)技術(shù)的基礎(chǔ)上建立并發(fā)展起來的。通過電泳可以分離長(zhǎng)度達(dá)300500個(gè)堿基，而差別僅1個(gè)堿基的同系單鏈核苷酸序列。m70年代初，Sanger建立了第一種直接測(cè)定DNA序列的方法加減法，并用該法測(cè)定了X174噬菌體DNA的全長(zhǎng)5375個(gè)核苷酸序列。1977年Sanger又建立了更為簡(jiǎn)便、精確的“雙脫氧核苷酸末端終止法”(dideoxynucleotide chain termination method)測(cè)定DNA序列。

3、這種方法迄今仍然是絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室中最常用的DNA序列分析方法。m幾乎在同一時(shí)期，Maxam和Gilbert于1977年建立了另一種快速測(cè)序的方法化學(xué)降解法。這兩種方法雖然原理不同，但是對(duì)DNA序列分析技術(shù)的快速發(fā)展都具有深遠(yuǎn)的影響。m此后，以雙脫氧核苷酸末端終止法為基礎(chǔ)，利用與光敏元件相連的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，建立了熒光DNA序列分析技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了DNA測(cè)序過程的自動(dòng)化。DNA序列分析技術(shù)伴隨現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展而不斷完善，這項(xiàng)技術(shù)已成為生命科學(xué)研究工作者探索生命奧秘的重要工具之一。ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35解旋酶

4、解鏈酶DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長(zhǎng)DNADNA的復(fù)制的復(fù)制ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長(zhǎng)GGAUCG5AUCGCG5引物酶引物酶RNA引物RNA引物DNADNA的復(fù)制的復(fù)制ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長(zhǎng)GGAUCG5AUCGCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3DNA聚合酶DNA聚合酶DNADNA的復(fù)制的復(fù)制

5、一、雙脫氧末端終止法m ATP、dATP和ddATP的結(jié)構(gòu)示意圖DNA合成反應(yīng)原理圖末端終止部位示意圖PhosphodiesterbondP R P R P R P R P R P ROH531 135A1 12 23456APO4 2-H352 2HdideoxynuceotideddNTP Sangers Method: How Terminated Normal LinkingCan not reactJuang RH (2004) BCbasics雙脫氧末端終止法測(cè)序反應(yīng)的基本原理和過程m1How DNA Sequence Is Determined?Polyacrylamide Ge

6、l ElectrophoresisATC32PAT32PA32PT A G CTACGATCG32PATCGA32PATCGAT32PATCGATC32PATCGATCG32PATCGATCGA32PATCGATCGAT32PDNA fragments having a difference of one nucleotide can be separated on gel electrophoresisBut these bands cant tell usthe identity of the terminal nucleotidesIf those band with the samet

7、erminal nucleotide can begrouped, then it is possible to read the whole sequenceJuang RH (2004) BCbasicsGATC 測(cè)序反應(yīng) 電泳AACGTGGACTAACGTGGACAACGTGGAAACGTGGAACGTGAACGTAACGAACAAA5 3 正極負(fù)極ddGddAddTddCn鏈末端合成終止法測(cè)定DNA序列的原理末端終止測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)物電泳區(qū)帶放射自顯影二、化學(xué)降解法m化學(xué)降解法是建立在對(duì)原有DNA的化學(xué)降解過程基礎(chǔ)之上的。m在化學(xué)降解法中，單側(cè)末端標(biāo)記的DNA片段在5 5組組相互獨(dú)立的化學(xué)反

8、應(yīng)中分別得到部分降解，其中每一組反應(yīng)特異地針對(duì)某一種或某一類被修飾堿基，因此形成5組帶有放射性標(biāo)記的長(zhǎng)短不一的DNA混合物。它們的長(zhǎng)度取決于該組反應(yīng)所針對(duì)的堿基在原有DNA片段上的位置。m然后，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分別分離這5組DNA混合物，再通過放射自顯影來檢測(cè)末端標(biāo)記DNA鏈的電泳區(qū)帶位置。Maxam-Gilbert 法所用的化學(xué)技術(shù)堿基特異修飾方法GPh8.0,用硫酸二甲酯對(duì) N7進(jìn)行甲基化,使 C8-C9鍵對(duì)堿基裂解有特殊敏感性A+GpH2.0 哌啶甲酸可使嘌呤環(huán)的N原子化,從而導(dǎo)致脫嘌呤,并因此消弱腺嘌呤和鳥嘌呤的糖苷鍵C+T肼可打開嘧啶環(huán),后者重新環(huán)化成五元環(huán)后易除去C1.5 m

9、ol/L NaCl存在時(shí),可用肼除去胞嘧啶化學(xué)法測(cè)序?qū)嵗哙angers Method:Maxam-Gilberts Method:How to Obtain DNA Fragments32P32PATCGATCG32PATCGATATCGATATCGTAGCTAGCTATAGCTAGCTATAGCTAGCTAATCGA32PSpecific Reaction to G ATCGSTOPATerminatedKeep on goingBiosynthetic methodChemical methodTemplateorNon-radioactive(invisible)32PA,T,C,G

10、AAnalogueDestroy CleavageDestroy CleavageATCGATCGATProducing various fragmentsJuang RH (2004) BCbasics三、三、Sanger第一步：加入復(fù)制終止劑熒光檢測(cè)探頭電泳，看誰(shuí)跑得快熒光偶聯(lián)法自動(dòng)DNA測(cè)序結(jié)果四、新一代DNA測(cè)序技術(shù)m自學(xué)第二節(jié) 核酸分子雜交技術(shù)Nuclic Acid Molecular Hybridization雜交簡(jiǎn)介m1969年，Pardue等建立了細(xì)胞原位雜交技術(shù)。m1975年，Southern建立了檢測(cè)DNA的southern印跡雜交技術(shù)。m1977年，Stark建立了檢測(cè)m

11、RNA的Northern印跡雜交技術(shù)。m隨后，在液體介質(zhì)中進(jìn)行的分子雜交技術(shù)，如核酸酶S1保護(hù)分析法、RNA酶保護(hù)分析法、抑制性消減雜交等技術(shù)也得到了充分發(fā)展。m分子雜交是研究核酸的有力工具，在分子克隆、基因診斷、基因表達(dá)分析、核酸序列分析等方面發(fā)揮著重要作用。核酸分子雜交技術(shù)是分子生物學(xué)領(lǐng)域中最廣泛應(yīng)用的技術(shù)之一，它的應(yīng)用大大地推進(jìn)了分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展。一、核酸分子雜交的原理m1.變性（denaturation）m2.復(fù)性（renaturation)m3.雜交（hybridization）1.核酸的變性m維系DNA雙股螺旋的主要力量是氫鍵和疏水作用力。其中氫鍵是一種次級(jí)鍵，能量較低，因此，

12、加熱、強(qiáng)酸和強(qiáng)堿、有機(jī)溶劑（如甲醛、甲酰胺）及高鹽等條件都可破壞DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)解旋，兩條鏈完全解離，但未破壞其一級(jí)結(jié)構(gòu)，此過程稱為DNA的變性(denaturation)。m實(shí)驗(yàn)室中常用的使DNA變性的方法是加熱。由于GC堿基對(duì)之間形成3個(gè)氫鍵，A=T堿基對(duì)之間為2個(gè)氫鍵，因此DNA分子中GC配對(duì)越多，解鏈所需的溫度就越高。DNADNA變性的本質(zhì)是雙鏈間氫鍵的斷裂變性的本質(zhì)是雙鏈間氫鍵的斷裂例：變性引起紫外吸收值的改變例：變性引起紫外吸收值的改變DNA的紫外吸收光譜的紫外吸收光譜增色效應(yīng)：增色效應(yīng)：DNA變性時(shí)其溶液變性時(shí)其溶液OD260增高的現(xiàn)象。增高的現(xiàn)象。目目 錄錄m

13、當(dāng)核苷酸摩爾數(shù)相同時(shí)，A260值大小有如下關(guān)系：m單核苷酸單鏈DNA雙鏈DNA，這種關(guān)系稱為DNA的減色效應(yīng)(hypo-chromic effect)；m在DNA變性過程中，隨著堿基暴露程度的增加（分子內(nèi)的共軛雙鍵暴露程度增加），其溶液的A260值增高的現(xiàn)象稱為增色效應(yīng)(hyperchromic effect)；mDNA變性從開始到完全解鏈，只是在一個(gè)相對(duì)窄的溫度范圍內(nèi)完成，在這個(gè)溫度范圍內(nèi)，A260值達(dá)到最大值的50%時(shí)的溫度稱為DNA的解鏈溫度(melting temperature,Tm);此時(shí)，DNA分子內(nèi)50%的雙鏈結(jié)構(gòu)被打開。mDNA鏈越長(zhǎng)，Tm值越高；DNA分子中G和C的含量越高

14、，Tm值越高。熱變性解鏈曲線：解鏈曲線：如果在連續(xù)加熱如果在連續(xù)加熱DNADNA的過程中以溫的過程中以溫度對(duì)度對(duì)A260（absorbance，A，A260代表溶液在代表溶液在260nm260nm處的吸光率）值作圖，所得的曲線稱為解處的吸光率）值作圖，所得的曲線稱為解鏈曲線鏈曲線。目目 錄錄 Tm：變性是在一個(gè)相變性是在一個(gè)相當(dāng)窄的溫度范圍內(nèi)完成，當(dāng)窄的溫度范圍內(nèi)完成，在這一范圍內(nèi)，紫外光在這一范圍內(nèi)，紫外光吸收吸收增加增加值值達(dá)到達(dá)到最大最大增增加加值值的的一半一半時(shí)的溫度稱時(shí)的溫度稱為為DNA的解鏈溫度，又的解鏈溫度，又稱融解溫度稱融解溫度(melting temperature, Tm)

15、。其大小與其大小與G+C含量成正含量成正比。比。目目 錄錄2.核酸的復(fù)性m變性的兩條互補(bǔ)DNA單鏈在適當(dāng)條件下重新締合形成雙鏈的過程稱為復(fù)性(renaturation)或退火。m復(fù)性并不是變性反應(yīng)的簡(jiǎn)單逆反應(yīng)過程。復(fù)性的過程是相當(dāng)復(fù)雜的。m變性過程可以在一個(gè)極短的時(shí)間內(nèi)迅速完成，而復(fù)性卻需要相對(duì)較長(zhǎng)的時(shí)間才能完成。如果使熱變性的溶液迅速冷卻，則只能形成一些不規(guī)則的堿基對(duì)，而不能立即恢復(fù)DNA雙鏈的原有結(jié)構(gòu)。m但是，將此變性的DNA溶液在低于Tm值25的溫度下維持相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間，則可回復(fù)到天然的雙鏈結(jié)構(gòu)狀態(tài)。復(fù)性RNADNA3.核酸的雜交m如果把不同的DNA鏈放在同一溶液中作變性處理，或把單鏈

16、DNA與RNA放在一起，只要有某些區(qū)域有形成堿基配對(duì)的可能，它們之間就可形成局部的雙鏈，這一過程被稱為核酸雜交( hybridization)。m生成的核酸雙鏈稱為雜交雙鏈。m核酸探針是指標(biāo)記有放射性或帶有其他標(biāo)記物的單鏈多聚核苷酸片段，用于檢測(cè)核酸樣品中的特定核苷酸序列。m標(biāo)記的核酸探針是核酸分子雜交、DNA序列測(cè)定等技術(shù)的基礎(chǔ)，已被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)領(lǐng)域中的克隆篩選、酶切圖譜制作、DNA序列測(cè)定、基因點(diǎn)突變分析及疾病的臨床診斷等方面DNA-DNA雜交雙鏈分子雜交雙鏈分子變性變性 復(fù)性復(fù)性 不同來源的不同來源的DNA分子分子（一）印跡技術(shù)利用各種物理方法使電泳膠中的生物大分子轉(zhuǎn)移到NC等各

17、種膜上，使之成為固相化分子。這一技術(shù)類似于用吸墨紙吸收紙張上的墨跡，因此稱之為“blotting”，譯為印跡技術(shù)。 用放射性核素、生物素或熒光染料標(biāo)記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸鏈被稱為“探針”，探針可以與固定在NC膜上的核苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。 （二）探針技術(shù)印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用（一）DNA印跡 (Southern Blotting)（二）RNA印跡 (Northern Blotting)（三）蛋白質(zhì)的印跡 (Western Blotting)用于基因組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。 用于RNA的定性定量分析。用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。三種印跡技術(shù)的比較二、

18、Southern印跡雜交Southern印跡雜交印跡雜交( (Southern blotting)是指將電泳分離的待是指將電泳分離的待測(cè)測(cè)DNADNA片段結(jié)合到一定的固相支持物上，然后與存在于液相片段結(jié)合到一定的固相支持物上，然后與存在于液相中標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交的過程，是目前最常用的一種中標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交的過程，是目前最常用的一種核酸分子雜交方法。核酸分子雜交方法。19751975年，英國(guó)愛丁堡大學(xué)的年，英國(guó)愛丁堡大學(xué)的Southern首創(chuàng)了這一方法，并稱首創(chuàng)了這一方法，并稱之為之為Southern印跡轉(zhuǎn)移。印跡轉(zhuǎn)移。利用利用Southern印跡雜交可進(jìn)行克隆基因的酶切圖譜分析、基印

19、跡雜交可進(jìn)行克隆基因的酶切圖譜分析、基因組基因的定性和定量分析、基因突變分析及限制性片段因組基因的定性和定量分析、基因突變分析及限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析長(zhǎng)度多態(tài)性分析(RFLP)(RFLP)等。等。目前用于印跡轉(zhuǎn)移的固相支持物有硝酸纖維素膜（目前用于印跡轉(zhuǎn)移的固相支持物有硝酸纖維素膜（NC膜）、膜）、尼龍膜、化學(xué)活化膜和濾紙等尼龍膜、化學(xué)活化膜和濾紙等。Southern印跡的基本步驟m(1)制備基因組DNAm(2)用限制性內(nèi)切核酸酶消化基因組DNAm(3)適當(dāng)濃度的瓊脂糖凝膠電泳分離DNA酶切片段m(4) Southern印跡轉(zhuǎn)移前的凝膠預(yù)處理m(5) Southern印跡轉(zhuǎn)移m(6)用標(biāo)記的

20、核酸探針與轉(zhuǎn)移到固相支持物上的核酸片段進(jìn)行雜交m(7)雜交結(jié)果的顯示（a）（b）（c）（d）（e）基因組基因組DNADNA限制片段限制片段硝酸纖維素濾膜硝酸纖維素濾膜同探針同源雜交的同探針同源雜交的基因基因DNA片段片段X光底片光底片放射自顯影照片三、Northern印跡雜交mNorthern印跡雜交(Northern blotting)是指將RNA變性及電泳分離后，將其轉(zhuǎn)移到固相支持物上，然后利用雜交反應(yīng)來鑒定其中特定mRNA分子的含量及其大小的過程。m1977年，Stark建立了這一方法，被對(duì)應(yīng)地稱為Northern印跡雜交。Northern印跡雜交可以對(duì)mRNA進(jìn)行定性和定量分析，即基因

21、表達(dá)分析。mNorthern印跡雜交除了在樣品的制備、凝膠電泳分離及凝膠的處理步驟與Southern印跡雜交不同外，其他步驟與Southern印跡雜交基本一致。四、斑點(diǎn)雜交和狹縫印跡雜交m斑點(diǎn)雜交斑點(diǎn)雜交(dot blotting)和狹縫印跡雜交狹縫印跡雜交(slot blotting)是指RNA或DNA變性后直接點(diǎn)樣于硝酸纖維素膜或尼龍膜上，然后再與相應(yīng)的探針雜交并顯示結(jié)果，除無需電泳分離外，其整個(gè)過程與Southern印跡雜交基本相同，用于基因組中特定基因及其表達(dá)的定性及定量研究，稱為斑點(diǎn)雜交。m斑點(diǎn)雜交也是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中常用的技術(shù)之一。與Southern印跡雜交及Northern印跡雜

22、交相比，其優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單、迅速；可以在同一張膜上同時(shí)進(jìn)行多個(gè)樣品的檢測(cè)；對(duì)于核酸粗提樣品的檢測(cè)效果也較好。m其缺點(diǎn)是不能確定所測(cè)基因或基因片段的分子質(zhì)量大小，而且特異性不高，有一定比例的假陽(yáng)性五、原位分子雜交m組織細(xì)胞的核酸原位分子雜交(in situ hybridization)是用已標(biāo)記的核酸探針與組織切片或細(xì)胞中的待測(cè)核酸互補(bǔ)序列雜交，從而對(duì)組織細(xì)胞中的核酸進(jìn)行定性、定位和相對(duì)定量分析。m這一方法已被廣泛應(yīng)用于組織細(xì)胞中mRNA及病毒DNA和RNA的檢測(cè)、特定基因在染色體上的定位及基因轉(zhuǎn)移（易位）效果分析等領(lǐng)域m核酸原位分子雜交的基本原理仍是根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，在一定條件下使兩條互補(bǔ)核酸單

23、鏈形成雙鏈復(fù)合體。m可用放射性核素或非放射性物質(zhì)（如生物素、辣根過氧化物酶、熒光素等）標(biāo)記核酸探針，與細(xì)胞涂片、染色體壓片或組織切片上具有互補(bǔ)序列的單鏈DNA或RNA形成雙鏈結(jié)構(gòu)（雜交），然后通過放射自顯影或激發(fā)熒光、酶底物顯色等方法檢測(cè)特定核酸分子所在的部位；還可利用顯微分光光度法進(jìn)行定量分析；也可將顯微鏡和計(jì)算機(jī)聯(lián)用，把激發(fā)熒光信號(hào)數(shù)字化，由計(jì)算機(jī)進(jìn)行定性和定量分析熒光原位雜交原理示意熒光原位雜交原理示意 熒光原位雜交過程熒光原位雜交過程 急性骨髓白血病急性骨髓白血病10、11號(hào)染色體間易位號(hào)染色體間易位10、11號(hào)染色體易發(fā)生號(hào)染色體易發(fā)生斷裂的基因斷裂的基因(MLL)位點(diǎn)位點(diǎn)熒光原位雜

24、交熒光原位雜交m將標(biāo)記的核酸探針與將標(biāo)記的核酸探針與細(xì)胞或組織中的細(xì)胞或組織中的核酸進(jìn)行雜交，核酸進(jìn)行雜交，稱為原位雜交。稱為原位雜交。m特點(diǎn)特點(diǎn) 能在成分復(fù)雜的組織中進(jìn)行單一細(xì)胞的研究能在成分復(fù)雜的組織中進(jìn)行單一細(xì)胞的研究。 不需從組織或細(xì)胞中提取核酸，對(duì)含量極低的靶序列靈敏度高不需從組織或細(xì)胞中提取核酸，對(duì)含量極低的靶序列靈敏度高。 能準(zhǔn)確反映組織細(xì)胞的相互關(guān)系及功能狀態(tài)能準(zhǔn)確反映組織細(xì)胞的相互關(guān)系及功能狀態(tài)。Florescence in-situ hybridization, FISH核酸原位雜交的基本步驟核酸原位雜交的基本步驟m細(xì)胞或組織的固定：載玻片細(xì)胞或組織的固定：載玻片m組織細(xì)胞

25、雜交前的預(yù)處理組織細(xì)胞雜交前的預(yù)處理 用去垢劑或蛋白酶除去核酸表面蛋白質(zhì)用去垢劑或蛋白酶除去核酸表面蛋白質(zhì)m探針的選擇和標(biāo)記探針的選擇和標(biāo)記m雜交雜交m雜交結(jié)果檢測(cè)雜交結(jié)果檢測(cè)FISH的基本原理m是用已知的標(biāo)記單鏈核酸為探針，按照堿基互補(bǔ)是用已知的標(biāo)記單鏈核酸為探針，按照堿基互補(bǔ)的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進(jìn)行特異的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進(jìn)行特異性結(jié)合，形成可被檢測(cè)的雜交雙鏈核酸。性結(jié)合，形成可被檢測(cè)的雜交雙鏈核酸。m由于由于DNADNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排列，因而可以將探針直接與染色體進(jìn)行雜線性排列，因而可以將探針直接與染色體

26、進(jìn)行雜交從而將特定的基因在染色體上定位交從而將特定的基因在染色體上定位。m與傳統(tǒng)的放射性標(biāo)記原位雜交相比，熒光原位雜交具與傳統(tǒng)的放射性標(biāo)記原位雜交相比，熒光原位雜交具有快速、檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)、雜交特異性高和可以多重染色有快速、檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)、雜交特異性高和可以多重染色等特點(diǎn)，因此在分子細(xì)胞遺傳學(xué)領(lǐng)域受到普遍關(guān)注。等特點(diǎn)，因此在分子細(xì)胞遺傳學(xué)領(lǐng)域受到普遍關(guān)注。m目前這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物基因組結(jié)構(gòu)研究、目前這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物基因組結(jié)構(gòu)研究、染色體精細(xì)結(jié)構(gòu)變異分析、病毒感染分析、人類產(chǎn)前染色體精細(xì)結(jié)構(gòu)變異分析、病毒感染分析、人類產(chǎn)前診斷、腫瘤遺傳學(xué)和基因組進(jìn)化研究等許多領(lǐng)域。診斷、腫瘤遺傳學(xué)

27、和基因組進(jìn)化研究等許多領(lǐng)域。 六、液相雜交m液相雜交(solution hybridization)是將標(biāo)記的探針與待測(cè)樣品置于同一溶液體系中，即雜交反應(yīng)在一個(gè)均勻的液相中進(jìn)行，互補(bǔ)的堿基序列彼此配對(duì)形成雜交分子，雜交反應(yīng)完成后，以含變性劑（通常為尿素）的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并進(jìn)行信號(hào)顯示。第三節(jié) 聚合酶鏈反應(yīng)Polymerase Chain Reaction(PCR)m聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)是K.Mullis于1985年發(fā)明的一種模擬天然DNADNA復(fù)制復(fù)制過程的核酸體外擴(kuò)增技術(shù)。mPCR技術(shù)的發(fā)明使人們夢(mèng)寐以求的體外無限擴(kuò)增核酸片段的愿

28、望成為現(xiàn)實(shí)。m耐熱Taq DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)實(shí)現(xiàn)了PCR的完全自動(dòng)化，從此，PCR及其相關(guān)技術(shù)更以驚人的速度發(fā)展，迅速地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、考古學(xué)等各學(xué)科領(lǐng)域PCR PCR 可以把可以把 數(shù)數(shù)量放大量放大染色體PCR 基因放大連瑣反應(yīng)一、一、PCRPCR反應(yīng)的基本原理反應(yīng)的基本原理PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35解旋酶解鏈酶DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長(zhǎng)DNADNA的復(fù)制的復(fù)制PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCG

29、ATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長(zhǎng)GGAUCG5AUCGCG5引物酶引物酶RNA引物RNA引物DNADNA的復(fù)制的復(fù)制PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長(zhǎng)GGAUCG5AUCGCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3DNA聚合酶DNA聚合酶DNADNA的復(fù)制的復(fù)制PCR技術(shù)

30、簡(jiǎn)史DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明m19711971年，年，KhoranaKhorana提出：經(jīng)過提出：經(jīng)過DNADNA變性，變性，與合適引物雜交，用與合適引物雜交，用DNADNA聚合酶延伸引聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNAtRNA基基因。因。m但由于測(cè)序和引物合成的困難，以及但由于測(cè)序和引物合成的困難，以及7070年代基因工程技術(shù)的發(fā)明使克隆基因成年代基因工程技術(shù)的發(fā)明使克隆基因成為可能，所以，為可能，所以，KhoranaKhorana的設(shè)想被人們遺的設(shè)想被人們遺忘了忘了核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA的復(fù)

31、制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明m19851985年，美國(guó)年，美國(guó)PE-CetusPE-Cetus公司的公司的MullisMullis等人發(fā)明了聚等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（合酶鏈反應(yīng)（PCRPCR）m基本原理是在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的基本原理是在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的DNADNA復(fù)制復(fù)制m最初采用最初采用E-coli DNAE-coli DNA聚合酶進(jìn)行聚合酶進(jìn)行PCRPCR，由于該酶，由于該酶不耐熱，使這一過程耗時(shí)，費(fèi)力，且易出錯(cuò)不耐熱，使這一過程耗時(shí)，費(fèi)力，且易出錯(cuò)m耐熱耐熱DNADNA聚合酶的應(yīng)用使得聚合酶的應(yīng)用使得PCRPCR能高效率的進(jìn)行，能高效率的進(jìn)行，隨后隨后PE-CetusPE-C

32、etus公司推出了第一臺(tái)公司推出了第一臺(tái)PCRPCR自動(dòng)化熱循自動(dòng)化熱循環(huán)儀環(huán)儀m19931993年，年，MullisMullis等因此項(xiàng)技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)等因此項(xiàng)技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明 聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明PCRPCR應(yīng)用應(yīng)用PCR應(yīng)用應(yīng)用引物引物引物引物聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明XX聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明因此因此PCR儀也稱熱循環(huán)儀儀也稱熱循環(huán)儀 Thermal Cycler聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)的PCRPCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系4 4種種dNTP

33、dNTP混合物混合物 各各200umol/L200umol/L引物引物 各各1010100pmol100pmol模板模板DNA DNA 0.10.12ug2ugTaq DNATaq DNA聚合酶聚合酶 2.5u2.5uMgMg2+ 2+ 1.5mmol/L1.5mmol/L1234522557294時(shí)間（min）溫度（）PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1-3步25-30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍PCRPCR的基本原理的基本原理mPCR反應(yīng)條件mPCR過程mPCR

34、的特點(diǎn)1234522557294時(shí)間（min）溫度（）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)13步2530輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA95PCRPCR的基本原理的基本原理mPCR反應(yīng)條件mPCR過程mPCR的特點(diǎn) 55引物1引物2DNA引物PCRPCR的基本原理的基本原理mPCR反應(yīng)條件mPCR過程mPCR的特點(diǎn)引物1引物2DNA引物 72Taq酶Taq酶PCRPCR的基本原理的基本原理mPCR反應(yīng)條件mPCR過程mPCR的特點(diǎn)第1輪結(jié)束 95第2輪開始PCRPCR的基本原理的基本原理mPCR反應(yīng)條件mPCR過

35、程mPCR的特點(diǎn)095 55 72TaqTaqTaqTaqPCRPCR的基本原理的基本原理mPCR反應(yīng)條件mPCR過程mPCR的特點(diǎn)72第2輪結(jié)束PCRPCR的基本原理的基本原理mPCR反應(yīng)條件mPCR過程mPCR的特點(diǎn)模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)增第5輪擴(kuò)增第6輪擴(kuò)增PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)m靈敏度高n 皮克(pg=10-12)量級(jí)擴(kuò)增到微克(ug=10-6)水平n 能從100萬個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞n 病毒檢測(cè)的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFUn 細(xì)菌檢測(cè)的最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌m簡(jiǎn)便、快速n 一次性加好反應(yīng)液，24 小時(shí)完成擴(kuò)增n 擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析

36、m對(duì)標(biāo)本的純度要求低1.血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等組織的粗提DNAPCR的擴(kuò)增效率m在指數(shù)擴(kuò)增期，擴(kuò)增產(chǎn)物的量取決于最初靶DNA的數(shù)量、PCR擴(kuò)增效率及循環(huán)次數(shù)。公式y(tǒng) =A (1+E)n可描述它們之間的關(guān)系，式中y表示擴(kuò)增產(chǎn)物的量，A代表最初靶DNA分子的數(shù)量，E代表PCR擴(kuò)增效率，n代表循環(huán)次數(shù)。m擴(kuò)增效率對(duì)擴(kuò)增程度影響較大：m當(dāng) 擴(kuò) 增 效 率 為 1 0 0 % 時(shí) ， 2 5 個(gè) 循 環(huán) 后 ，y=225A=33554432A：m當(dāng)效率為90%時(shí)，y=l.925A =9307649A，擴(kuò)增產(chǎn)物為前者的28%。m從圖7-10中可以看出，比兩引物限定區(qū)長(zhǎng)的延伸產(chǎn)物（又稱為

37、引物延伸產(chǎn)物）僅能發(fā)生在以原始模板DNA為模板的擴(kuò)增過程中，第一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增后這種引物延伸產(chǎn)物僅增加2條，即以倍數(shù)形式擴(kuò)增，當(dāng)起始模板數(shù)為A、n個(gè)循環(huán)后，理論上有An2個(gè)拷貝的引物延伸產(chǎn)物產(chǎn)生。這種產(chǎn)物極其微量，在電泳中是無法檢測(cè)到的。平臺(tái)期與平臺(tái)效應(yīng)m實(shí)際上，PCR擴(kuò)增反應(yīng)并不是無限的。經(jīng)過一定數(shù)量的循環(huán)后，隨著產(chǎn)物的對(duì)數(shù)累積趨于飽和，DNA片段不再呈指數(shù)積累，而是進(jìn)入線性增長(zhǎng)期或靜止期，此過程稱為平臺(tái)效應(yīng)(plateau effect)。根據(jù)反應(yīng)條件和熱循環(huán)，下列因素與平臺(tái)期有關(guān)。引物、dNTP快速摻入底物中，濃度降低，摻入速率減慢。隨著產(chǎn)物的增加，酶與模板的比例下降。當(dāng)合成的DNA量超過反

38、應(yīng)體系中DNA聚合酶在限定延伸時(shí)間內(nèi)所能復(fù)制的能力時(shí)，底物便過量了，這時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物便不再以指數(shù)形式增加。在2.5U Tag DNA聚合酶/l00 ul體系中，產(chǎn)物DNA約lug時(shí)(相當(dāng)于3 nmol dNTP)便出現(xiàn)底物過量。非特異性產(chǎn)物或引物二聚體與反應(yīng)物的競(jìng)爭(zhēng)。產(chǎn)物的再結(jié)合。變性后的單鏈DNA片段在引物退火前即自身配對(duì)結(jié)合，這種抑制作用是因?yàn)榉种нw移和引物被取代，還是因?yàn)镈NA聚合酶的無效取代合成所致，目前尚不清楚。當(dāng)產(chǎn)物濃度達(dá)到l0 pmol/ul時(shí)常出現(xiàn)這種限制效應(yīng)，而且很難避免，除非稀釋反應(yīng)溶液。二、耐熱的DNA聚合酶m早期在PCR技術(shù)中使用的是大腸桿菌DNA聚合酶工的大片段，即Kl

39、enow片段，延伸溫度為37。由于Klenow片段在95時(shí)完全失活，因此需要在每輪循環(huán)變性步驟后再添加新酶。同時(shí)，由于Klenow片段聚合反應(yīng)溫度偏低，使非特異性產(chǎn)物增多，受DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)影響較大，聚合反應(yīng)不完全。改用T4 DNA聚合酶，效果也無明顯改善。直至1987年發(fā)現(xiàn)了熱穩(wěn)定Taq DNA聚合酶才使PCR技術(shù)有了重大發(fā)展。Taq DNA聚合酶能經(jīng)受95以上高溫而不失活，同時(shí)它催化的聚合反應(yīng)的最適溫度為7080。m現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種耐熱DNA聚合酶，如Tth DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶等。其中以Taq DNA聚合酶應(yīng)用最為廣泛。三、PCR引物設(shè)計(jì)的原則m1長(zhǎng)度及堿

40、基分布 m2引物之間及引物自身的堿基序列m3引物3端 m4引物5端 m5二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū) m6簡(jiǎn)并引物 圖7-11A表示引物與引物之間或引物與模板的非引物結(jié)合部位部分互補(bǔ)。那么，DNA聚合酶的5-3外切核酸酶活性可能將5端的堿基切除；同時(shí)，DNA聚合酶也可發(fā)揮5-3聚合活性，此即發(fā)生了非特異性擴(kuò)增。圖7-11B表示引物形成3 端突出的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，DNA聚合酶發(fā)揮5-3 外切核酸酶活性，切去引物5端的堿基。圖7-11C表示引物形成5端突出發(fā)夾結(jié)構(gòu)，DNA聚合酶將發(fā)揮5-3 聚合活性。圖7-11D表示引物間3 端互補(bǔ)黏合，從3端發(fā)生模板依賴性延伸，形成引物二聚體。這樣形成的二聚體是非常有效的PCR擴(kuò)增模板

41、；如果發(fā)生在早期PCR循環(huán)，可以很快成為主要的PCR產(chǎn)物。四、PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化五、常用的PCR改進(jìn)技術(shù)m（一）反轉(zhuǎn)錄-PCRm反轉(zhuǎn)錄-PCR (reverse transcription PCR，RT-PCR)是一種快速、簡(jiǎn)便、敏感性極高的檢測(cè)RNA的方法。m其原理是先在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以mRNA為模板合成cDNA，再以此cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)(圖7-12)。這樣，低豐度的mRNA通過RT-PCR得以擴(kuò)增，便于檢測(cè)。mRT-PCR中的關(guān)鍵步驟是RNA的反轉(zhuǎn)錄，要求RNA模板必須是完整的，且不含DNA、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。m常用的反轉(zhuǎn)錄酶有兩種，即鳥類成髓細(xì)胞性白血病病毒(avian my

42、eloblastosis virus，AMV)反轉(zhuǎn)錄酶和莫洛尼鼠類白血病病毒(Moloney murlne leukemia virus，MMLV)反轉(zhuǎn)錄酶（二）、定量RT-PCRm定量RT-PCR(quantitative RT-PCR，QRT-PCR)是當(dāng)前精確定量分析基因表達(dá)的一種最快速、敏感的方法。與傳統(tǒng)的RNA分析法相比具有敏感度高、特異性強(qiáng)及能快速分析大量樣本等優(yōu)點(diǎn)。m由于在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期內(nèi)很小的擴(kuò)增效率的改變會(huì)極大地影響其產(chǎn)量，所以RT-PCR很難獲得數(shù)量信息。如果設(shè)立一定的RNA競(jìng)爭(zhēng)性參考標(biāo)準(zhǔn)，將能利用RT-PCR對(duì)mRNA水平進(jìn)行半定量或絕對(duì)定量分析選擇內(nèi)源性基因模板標(biāo)準(zhǔn)

43、：m內(nèi)源性基因模板標(biāo)準(zhǔn)是選用在組織中普遍表達(dá)、表達(dá)量比較恒定的一類mRNA。編碼這些mRNA的基因都是一些保守性強(qiáng)的管家基因，如2-微球蛋白、-肌動(dòng)蛋白、核糖體蛋白、翻譯延長(zhǎng)因子、二氫葉酸還原酶和磷酸甘油醛脫氫酶等基因（三）實(shí)時(shí)熒光定量PCRm定量定量PCRPCR概念概念m以外參照或內(nèi)參照為標(biāo)準(zhǔn)，通過對(duì)以外參照或內(nèi)參照為標(biāo)準(zhǔn)，通過對(duì)PCRPCR終產(chǎn)物終產(chǎn)物的分析或的分析或PCRPCR過程的監(jiān)測(cè)，對(duì)過程的監(jiān)測(cè)，對(duì)PCRPCR起始模板量起始模板量的的定量定量 PCR 反應(yīng)過程監(jiān)測(cè) n高濃度高濃度/ /高效率高效率n高濃度高濃度/ /低效率低效率n低濃度低濃度/ /高效率高效率N N: :擴(kuò)增分子的

44、數(shù)目擴(kuò)增分子的數(shù)目n n: :擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)log-phase analysislog-phase analysisN Nn nend-point analysisend-point analysisPCR PCR 和定量問題定量定量PCRPCR與定性與定性PCRPCR測(cè)定測(cè)定指數(shù)擴(kuò)增期指數(shù)擴(kuò)增期擴(kuò)增的平臺(tái)期擴(kuò)增的平臺(tái)期常規(guī)PCRPCR與定量PCRPCR的比較 常常規(guī)規(guī)PCR 定定量量PCR 反反應(yīng)應(yīng)方方式式 2步步法法 3步步法法 2步步法法 3步步法法 反反應(yīng)應(yīng)液液成成分分 dNTP，引引物物，模模板板，酶酶 dNTP，引引物物，模模板板，酶酶，探探針針，參參照照 結(jié)結(jié)果果檢

45、檢測(cè)測(cè) 瓊瓊脂脂糖糖凝凝膠膠電電泳泳 ELISA，或或?qū)崒?shí)時(shí)時(shí)熒熒光光檢檢測(cè)測(cè) 結(jié)結(jié)果果性性質(zhì)質(zhì) 定定性性 定定量量，或或定定性性 結(jié)結(jié)果果準(zhǔn)準(zhǔn)確確性性 無無法法區(qū)區(qū)別別假假陽(yáng)陽(yáng)性性假假陰陰性性 有有效效識(shí)識(shí)別別假假陽(yáng)陽(yáng)性性假假陽(yáng)陽(yáng)性性 熒光定量PCRPCR高靈敏性高靈敏性光譜技術(shù)光譜技術(shù)高精確性高精確性高靈敏性高靈敏性高特異性高特異性高精確性高精確性DNA雜交雜交高特異性高特異性淬滅基團(tuán)R熒光定量PCR示意圖模板DNADNA探針RQQ報(bào)告基團(tuán)Taqman 技術(shù)（2）m原理：原理： 當(dāng)溶液中有當(dāng)溶液中有PCRPCR產(chǎn)物時(shí)，該探針可與模板的特異序列結(jié)合產(chǎn)物時(shí)，該探針可與模板的特異序列結(jié)合 當(dāng)當(dāng)T

46、aqTaq酶靠近探針時(shí)，激活了酶靠近探針時(shí)，激活了TaqTaq酶的外切酶活性，將探針酶的外切酶活性，將探針55的的R R切下，切下，R R基團(tuán)發(fā)出熒光基團(tuán)發(fā)出熒光 根據(jù)熒光強(qiáng)度計(jì)算初始模板的數(shù)量根據(jù)熒光強(qiáng)度計(jì)算初始模板的數(shù)量 特異性熒特異性熒光雙標(biāo)記光雙標(biāo)記探針探針 Taq酶酶 5353外切酶活外切酶活性性TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR分子信標(biāo)實(shí)時(shí)熒光定量PCRTaqman 技術(shù)（4）m方法學(xué)評(píng)價(jià)：方法學(xué)評(píng)價(jià)： 不足不足 熒光淬滅難以徹底，本底較高熒光淬滅難以徹底，本底較高 定量時(shí)受酶性能影響定量時(shí)受酶性能影響570077007000 Molecular beacon 法技術(shù)（1）m羅氏公司開

47、發(fā)羅氏公司開發(fā)m原理：原理： 將熒光分子（將熒光分子（R R基團(tuán)）和熒光淬滅分子（基團(tuán)）和熒光淬滅分子（Q Q基團(tuán)）基團(tuán)）分別標(biāo)記在可與同一模板相鄰的序列雜交的兩個(gè)分別標(biāo)記在可與同一模板相鄰的序列雜交的兩個(gè)不同探針上不同探針上 雜交后，兩個(gè)探針上的雜交后，兩個(gè)探針上的R R基團(tuán)與基團(tuán)與Q Q基團(tuán)緊密相鄰，基團(tuán)緊密相鄰， R R基團(tuán)發(fā)出的熒光被基團(tuán)發(fā)出的熒光被Q Q基團(tuán)淬滅基團(tuán)淬滅 熒光淬滅程度與起始模板數(shù)量成反比熒光淬滅程度與起始模板數(shù)量成反比Molecular beacon 法技術(shù)（2）Molecular beacon 法技術(shù)（3）m方法學(xué)評(píng)價(jià)：方法學(xué)評(píng)價(jià)： 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn) 淬滅效率高淬滅效率高

48、不足不足 由于兩個(gè)探針結(jié)合于模板上，影響擴(kuò)增效率由于兩個(gè)探針結(jié)合于模板上，影響擴(kuò)增效率 兩個(gè)探針合成成本高兩個(gè)探針合成成本高其它改進(jìn)的PCR技術(shù)m（四）、反向PCRm（五）、Alu-PCRm（六）、不對(duì)稱PCRm（七）、長(zhǎng)片段PCRm（八）、巢式PCRm（九）、多重PCRm（十）、固相錨定PCRm（十一）、原位PCR第四節(jié) 基因芯片和微陣列技術(shù)Gene chip & Microarray 生物芯片生物芯片( (biochip or bioarray) )的概念源于半導(dǎo)的概念源于半導(dǎo)體、計(jì)算機(jī)芯片。體、計(jì)算機(jī)芯片。 生物芯片生物芯片是指通過微電子、微加工技術(shù)在芯片表是指通過微電子、微加工

49、技術(shù)在芯片表面構(gòu)建的微型生物化學(xué)面構(gòu)建的微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)分析系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞、，以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞、DNADNA、蛋白質(zhì)及其他生物組分的快速、敏感、高效的、蛋白質(zhì)及其他生物組分的快速、敏感、高效的的處理。的處理。 生物芯片生物芯片是指包被在是指包被在固相載體固相載體如硅片、玻璃、塑如硅片、玻璃、塑料和尼龍膜上的料和尼龍膜上的DNADNA微陣列、寡核苷酸微陣列和蛋白微陣列、寡核苷酸微陣列和蛋白質(zhì)微陣列。質(zhì)微陣列。m 生物芯片的生物芯片的微陣列微陣列是由生物活性物質(zhì)以點(diǎn)陣是由生物活性物質(zhì)以點(diǎn)陣（array）的形式有序地固定在固相）的形式有序地固定在固相載體載體上形成的，上形成的，在一定的條件下進(jìn)行

50、生化在一定的條件下進(jìn)行生化反應(yīng)反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)果用化學(xué)熒，反應(yīng)結(jié)果用化學(xué)熒光法、酶標(biāo)法、同位素法光法、酶標(biāo)法、同位素法顯示顯示，再用掃描儀等光學(xué)，再用掃描儀等光學(xué)儀器進(jìn)行儀器進(jìn)行數(shù)據(jù)采集數(shù)據(jù)采集，最后通過專門的計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)，最后通過專門的計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行行數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析。slide生物芯片分類D N A C h ip s P ro te in C h ip sL a b C h ip sB io c h ip s按陣列活性物質(zhì)分按陣列活性物質(zhì)分m按用途分按用途分 1.1.樣品制備芯片樣品制備芯片 2.2.生化反應(yīng)芯片生化反應(yīng)芯片 3.3.檢測(cè)芯片檢測(cè)芯片m芯片實(shí)驗(yàn)室芯片實(shí)驗(yàn)室是生物芯片技術(shù)發(fā)展的最

51、終目標(biāo)是生物芯片技術(shù)發(fā)展的最終目標(biāo)m基因芯片(Gene chip)技術(shù)是指通過微陣列(Microarray)技術(shù)，將高密度DNA片段陣列通過高速機(jī)器人或原位合成方式，以一定的順序或排列方式使其附著在如玻璃片等固相表面，以熒光標(biāo)記的DNA探針，借助堿基互補(bǔ)雜交原理，進(jìn)行大量的基因表達(dá)及監(jiān)測(cè)等方面研究的最新革命性技術(shù)基因芯片基因芯片（Gene chip）Types of DNA ChipsE x p re s s io n C h ip s G e n o m ic C h ip s S e q u e n c in g C h ip sD N A C h ip s 是利用是利用DNADNA分子可

52、以變性、雜交的特性，通過分子可以變性、雜交的特性，通過DNADNA芯芯片上固定的探針或樣品片上固定的探針或樣品DNADNA與游離的樣品與游離的樣品DNADNA或探針雜交或探針雜交來推斷未知的靶分子，雜交發(fā)生與否可采用熒光標(biāo)記技來推斷未知的靶分子，雜交發(fā)生與否可采用熒光標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)。術(shù)檢測(cè)。 DNADNA芯片技術(shù)比其他芯片技術(shù)更為成熟，應(yīng)用廣泛，芯片技術(shù)比其他芯片技術(shù)更為成熟，應(yīng)用廣泛，是生物芯片中極有潛力的一種芯片。是生物芯片中極有潛力的一種芯片。DNA芯片芯片基因芯片芯片實(shí)驗(yàn)室 是一種微型化、無污染、全功能的是一種微型化、無污染、全功能的“實(shí)實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)室”，包含了運(yùn)算電路、顯示器、檢測(cè)以，包含

53、了運(yùn)算電路、顯示器、檢測(cè)以及控制系統(tǒng)，在及控制系統(tǒng)，在“隨身聽隨身聽”大小的一間實(shí)驗(yàn)大小的一間實(shí)驗(yàn)室里可一次完成芯片制備、樣品處理、靶分室里可一次完成芯片制備、樣品處理、靶分子和探針分子雜交親和，以及信號(hào)檢測(cè)、分子和探針分子雜交親和，以及信號(hào)檢測(cè)、分析。析。 芯片實(shí)驗(yàn)室芯片實(shí)驗(yàn)室將傳統(tǒng)的生物（化學(xué)）的樣品制將傳統(tǒng)的生物（化學(xué)）的樣品制備、生化反應(yīng)、數(shù)據(jù)檢測(cè)的三個(gè)步驟集成于一體，備、生化反應(yīng)、數(shù)據(jù)檢測(cè)的三個(gè)步驟集成于一體，縮小構(gòu)成芯片上的實(shí)驗(yàn)室，目前國(guó)外已成功地將縮小構(gòu)成芯片上的實(shí)驗(yàn)室，目前國(guó)外已成功地將樣品分離、樣品分離、DNADNA提取、提取、PCRPCR反應(yīng)、反應(yīng)、 DNADNA雜交測(cè)序檢

54、雜交測(cè)序檢測(cè)這幾個(gè)步驟在一個(gè)或幾個(gè)芯片構(gòu)成的密閉系統(tǒng)測(cè)這幾個(gè)步驟在一個(gè)或幾個(gè)芯片構(gòu)成的密閉系統(tǒng)中一氣完成。中一氣完成。 具有防污染、自動(dòng)化，體積小、便于攜帶的具有防污染、自動(dòng)化，體積小、便于攜帶的特點(diǎn)，可大大提高分析速度和多樣品分析能力。特點(diǎn)，可大大提高分析速度和多樣品分析能力。芯片實(shí)驗(yàn)室芯片實(shí)驗(yàn)室生物芯片的研究進(jìn)展與應(yīng)用 與集成電路芯片相比（分析對(duì)象是電與集成電路芯片相比（分析對(duì)象是電信號(hào)，使用是永久性的），生物芯片分析信號(hào)，使用是永久性的），生物芯片分析的對(duì)象是生物分子，使用是的對(duì)象是生物分子，使用是一次性一次性的。的。 生物芯片的使用非常廣泛，包括，基因測(cè)序，疾生物芯片的使用非常廣泛，包

55、括，基因測(cè)序，疾病診斷和預(yù)防，中藥有效成分的鑒定、篩選及藥理作病診斷和預(yù)防，中藥有效成分的鑒定、篩選及藥理作用，環(huán)境與食品衛(wèi)生檢測(cè)，司法鑒定等。用，環(huán)境與食品衛(wèi)生檢測(cè)，司法鑒定等。 用于高通量藥物篩選，利用生物芯片可比較正常用于高通量藥物篩選，利用生物芯片可比較正常組織和病變組織大量相關(guān)基因表達(dá)的變化，從而發(fā)現(xiàn)組織和病變組織大量相關(guān)基因表達(dá)的變化，從而發(fā)現(xiàn)一組疾病相關(guān)基因作為藥物篩選靶標(biāo)。一組疾病相關(guān)基因作為藥物篩選靶標(biāo)。DNA芯片芯片遺傳作圖遺傳作圖基因分型基因分型重測(cè)序重測(cè)序新基因?qū)ふ倚禄驅(qū)ふ宜幬锖Y選藥物篩選疾病診斷疾病診斷.基因表達(dá)譜基因表達(dá)譜基因突變基因突變Agricultural

56、biotechLivestock diagnosticsor gradingHuman diagnosticsEnvironmental testingFood testingBasic ResearchIdentity testingPersonalized medicinemDNADNA芯片技術(shù)是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者芯片技術(shù)是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接將大量直接將大量DNADNA探針以顯微打印的方式有序的固定化于支探針以顯微打印的方式有序的固定化于支持物表面，然后與標(biāo)記的樣品雜交，通過對(duì)雜交信號(hào)的持物表面，然后與標(biāo)記的樣品雜交，通過對(duì)雜交信號(hào)的檢測(cè)分析，即可得

57、出樣品的遺傳信息（基因序列及表達(dá)檢測(cè)分析，即可得出樣品的遺傳信息（基因序列及表達(dá)的信息）。的信息）。m19951995年年stanford大學(xué)的大學(xué)的M.Schena和和P.O.Brown等發(fā)表第一等發(fā)表第一篇基因?yàn)榫仃囌撐模糜诨虮磉_(dá)譜研究。篇基因?yàn)榫仃囌撐?，用于基因表達(dá)譜研究。 DNA芯片技術(shù)的概念m用原位合成或者探針打印制備的用原位合成或者探針打印制備的DNADNA芯片，其固定的探針可以是芯片，其固定的探針可以是cDNAcDNA、寡核苷酸、或來自基因組的基因片斷，且這些探針固定化于芯片上寡核苷酸、或來自基因組的基因片斷，且這些探針固定化于芯片上形成基因探針陣列。形成基因探針陣列。m因此

58、，因此，DNADNA芯片又被稱為：芯片又被稱為：m 基因芯片基因芯片（gene chips）m DNA DNA陣列陣列（DNA array）m cDNA cDNA芯片（芯片（cDNA chips）m 寡核苷酸陣列（寡核苷酸陣列（oligonucleotide array）等。等。m DNADNA芯片在基因表達(dá)譜（芯片在基因表達(dá)譜（gene expression profile）、功能基因組、疾病基因能診斷等基）、功能基因組、疾病基因能診斷等基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用中已經(jīng)顯示出其重要的理論礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用中已經(jīng)顯示出其重要的理論意義和廣泛的應(yīng)用前景意義和廣泛的應(yīng)用前景DNA芯片的主要類型mDNA芯片根

59、據(jù)其制備方式分為兩大類：m 原位合成芯片原位合成芯片( (synthetic genechip) )m DNA DNA微集陣列微集陣列 ( (DNA microarray) )原位合成芯片m采用顯微光蝕刻技術(shù)等在芯片的特定部位原位合成寡核采用顯微光蝕刻技術(shù)等在芯片的特定部位原位合成寡核苷酸而制成的芯片。苷酸而制成的芯片。m這種芯片的集成度高，可達(dá)這種芯片的集成度高，可達(dá)10105 5-4-4* *10105 5點(diǎn)陣點(diǎn)陣/cm/cm2 2。m但是合成的寡核苷酸探針長(zhǎng)度短，一般為但是合成的寡核苷酸探針長(zhǎng)度短，一般為8-208-20 ntnt，最長(zhǎng)，最長(zhǎng)為為5050 ntnt。因此需用多個(gè)相互重疊的

60、探針片斷進(jìn)行檢測(cè)，。因此需用多個(gè)相互重疊的探針片斷進(jìn)行檢測(cè)，才能對(duì)基因進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定。才能對(duì)基因進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定。DNA微集陣列芯片m將預(yù)先制備的將預(yù)先制備的DNADNA片斷以顯微打印的方式有序的固化于支片斷以顯微打印的方式有序的固化于支持物的表面而制成的芯片。持物的表面而制成的芯片。m這類芯片的集成度相對(duì)較低，可達(dá)這類芯片的集成度相對(duì)較低，可達(dá)10104 4-10-105 5點(diǎn)陣點(diǎn)陣/cm/cm2 2。m使用的探針組的來源比較靈活，可以使合成的寡核苷酸使用的探針組的來源比較靈活，可以使合成的寡核苷酸片斷，也可以是來自基因組的較長(zhǎng)的片斷；可以使雙鏈，片斷，也可以是來自基因組的較長(zhǎng)的片斷；可以使雙鏈，也可