病原細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)

1、病原細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)【訓(xùn)練目標(biāo)】 掌握常用抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)，為合理用藥打下良好基礎(chǔ)?！局饕獌x器設(shè)備與場地】設(shè)備材料：瓊脂培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基，青霉素、鏈霉素、磺胺嘧啶及黃連素、慶大霉素、磺胺嘧啶等藥物的干燥濾紙片，葡萄球菌、大腸桿菌等菌種，酒精燈、試管、微量注射器、微量吸管、恒溫培養(yǎng)箱。場地：傳染病實(shí)驗(yàn)室?！居?xùn)練內(nèi)容與步驟】（1）紙片法 紙片法操作簡單，應(yīng)用也最普遍。抗菌素紙片的制備將質(zhì)量較好的濾紙用打孔機(jī)打成直徑6mm的圓片，每100片放入一小瓶中，160干熱滅菌12hr，或用高壓滅菌（15磅30min）后在60條件下烘干。用無菌操作法將欲測的抗菌藥物溶液1ML（青霉素200IU/ML、其他抗

2、菌素1000µg/ML、磺胺類藥物10µg/ML）加入100片紙片中，置冰箱內(nèi)浸泡12hr，如立即試驗(yàn)可不烘干，若保存?zhèn)溆每捎孟路ê娓桑ǜ稍锏目咕丶埰杀４媪鶄€(gè)月）。培養(yǎng)皿烘干法：將浸有抗菌藥液的紙片攤平在培養(yǎng)皿中，于37溫箱內(nèi)保持23hr即可干燥，或放在無菌室內(nèi)過夜干燥。真空抽干法：將放有抗菌藥物紙片的試管，放在干燥器內(nèi)，用真空抽氣機(jī)抽干，一般需要1824hr。將制好的各種藥物紙片裝入無菌小瓶中，置冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆茫⒂脴?biāo)準(zhǔn)敏感菌株作敏感性試驗(yàn)，記錄抑制圈的直徑，若抑菌圈比原來的縮小，則表明該抗菌藥物已失效，不能再用?，F(xiàn)在已有現(xiàn)成的藥敏紙片供應(yīng)，可根據(jù)需要購買。培養(yǎng)基一般

3、細(xì)菌如腸道桿菌及葡萄球菌等可用普通瓊脂平板；鏈球菌、巴氏桿菌或肺炎球菌等可用血液瓊脂平板；測定對磺胺類藥物的敏感試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)使用無蛋白胨瓊脂平板。菌液為培養(yǎng)1013hr的幼齡菌液（抑菌圈的大小受菌液濃度的影響較大，因而菌液培養(yǎng)的時(shí)間一般不宜超過17hr）。試驗(yàn)方法用接種環(huán)挑取培養(yǎng)1018hr的幼齡菌，均勻涂抹于瓊脂平板上，待干燥后，用鑷子夾取各種抗菌素紙片，平均分布于瓊脂表面（每塊平板放置45片），在37溫箱內(nèi)培養(yǎng)18hr后觀察結(jié)果。結(jié)果測定根據(jù)藥敏紙片周圍無菌區(qū)（抑菌區(qū)）的大小，測定其抗藥程度。因此，必須測量抑菌圈的直徑（包括紙片），按其大小，報(bào)告該菌株對某種藥物敏感與否。表1-1青霉素抑菌圈

4、的標(biāo)準(zhǔn)抑菌圈直徑敏感性10mm1020mm20mm抗藥中度敏感極度敏感表1-2其他抗菌素及磺胺類藥物的敏感標(biāo)準(zhǔn)抑菌圈直徑敏感性10mm1115mm15mm抗藥中度敏感極度敏感表1-3中藥抑菌素的標(biāo)準(zhǔn)抑菌圈直徑敏感性15mm15mm1520mm抗藥中度敏感極度敏感（2）快速敏感試驗(yàn)葡萄糖指示法許多細(xì)菌能分解葡萄糖而產(chǎn)酸，使培養(yǎng)基PH值發(fā)生改變，若在培養(yǎng)基中加入抗菌藥物，接種的細(xì)菌對抗菌藥物敏感時(shí)，培養(yǎng)基中的葡萄糖就不被細(xì)菌分解利用，不會(huì)形成酸性物質(zhì)，PH值不發(fā)生變化，因而指示劑也不變色，相反，細(xì)菌對抗菌藥物不敏感時(shí)，抗菌藥物抑制不了該菌的生長繁殖，因而分解葡萄糖并產(chǎn)酸，使加入其中的溴甲酚紫由紫變

5、黃，以此來測定細(xì)菌對藥物的敏感性。具體操作方法如下：抗菌素紙片及菌液的準(zhǔn)備，同紙片法。配制指示培養(yǎng)基：取普通瓊脂15ML，加入1%葡萄糖及0.6%溴甲酚紫指示劑0.7ML。滅菌后，待培養(yǎng)基涼至50左右時(shí)，加入菌液0.5ML，充分混勻后（防止氣泡）作傾注培養(yǎng)。待凝固后，用鑷子將抗菌素紙片分別貼于表面，于37條件下培養(yǎng)24hr后觀察。結(jié)果判定：紙片周圍有細(xì)菌生長者呈現(xiàn)黃色，不生長時(shí)仍為紫色，并側(cè)量抑菌圈的直徑，判定其敏感方法，方法同紙片法。（3）試管法試管法是將藥物作倍比稀釋，觀察不同含量對細(xì)菌的抑制能力，以判定細(xì)菌對藥物的敏感度，常用于測定抗菌素及中草藥對細(xì)菌的抑制能力。試驗(yàn)方法：取無菌試管10

6、支，排列于試管架上，于第一管中加入肉湯1.9ML，其余9管各加入1ML，吸取配制好的抗菌素原液、磺胺類原液或中藥原液0.1ML，加入第一管中，充分混合后吸出1ML吸入第二管中，混合后，再從第二管移1ML到第三管，依此移到第九管中，吸出1ML棄去。第十管不加藥液作對照。然后向各管中加入幼齡菌液稀釋液0.05ML（培養(yǎng)17hr的菌液作1:1000稀釋，培養(yǎng)6hr作1:10稀釋），于37溫箱中培養(yǎng)1824hr后觀察結(jié)果。結(jié)果測定：培養(yǎng)18hr后，凡無細(xì)菌生長的藥物最高稀釋管中即為該菌對藥物的敏感度。若由于加入藥物（如中藥）而使培養(yǎng)基變?yōu)榛鞚?，眼觀不易判斷時(shí)，可進(jìn)行接種或涂片染色鏡檢判定結(jié)果?！咀⒁馐?/p>

7、項(xiàng)】（1）器材：抗菌藥物敏感性試驗(yàn)是利用微生物學(xué)方法進(jìn)行的，其用量極微，實(shí)驗(yàn)儀器的規(guī)格和精確度會(huì)直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此必須嚴(yán)格要求。試管、吸管、培養(yǎng)皿和其它器皿，尤其是定量用的吸管，均須選用中性，硬質(zhì)一級品，并且必須經(jīng)過徹底滅菌。（2）培養(yǎng)基成分：培養(yǎng)基成分不但影響敏感菌株的生長繁殖，并可影響到抑菌圈的直徑。不同批號的蛋白胨，所含的氨基氮的總量不同，因而抑菌圈大小有一定差別。氯化鈉、瓊脂中的鈣、鎂離子影響鏈霉素、新霉素的擴(kuò)散，尤其是氯化鈉對鏈霉素影響大，含量越高，抑菌圈越小，甚至不出現(xiàn)反應(yīng)，但氯化鈉對多粘菌素反而有助于擴(kuò)散。瓊脂含量和平板厚度也影響抑菌圈的大小，含量大，影響抗菌素的擴(kuò)散，一般以1.31.6%的濃度較合適，瓊脂層過厚抑菌圈也較小，以24mm為最適宜?；前奉愃幱铆傊桨宸ㄔ囼?yàn)時(shí)，不能含蛋白胨，因蛋白胨會(huì)使磺胺失去作用。血清成分的吸附或結(jié)合作用，會(huì)使金霉素、中藥提取物抗菌作用減弱。（3）敏感菌株：菌種的敏感度差別較大，如金黃色葡萄球菌對青霉素最敏感。四聯(lián)球菌對四環(huán)素族最敏感。大腸桿菌對鏈霉素、多粘菌素敏感。因此，接種量要適宜，接種量多，即使最敏感的菌株也不能抑制其發(fā)育，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。（4）標(biāo)準(zhǔn)液和被檢液：要用同一方法和在同一條件下配制，避免因操作方法不一致而造成誤差。（5）培養(yǎng)時(shí)間：細(xì)菌在發(fā)育過程中，對數(shù)期繁殖最快，以后處于穩(wěn)定和衰落期，必須掌握這一規(guī)律和特性