核酸凝膠電泳.終（課堂PPT）

1、1核酸凝膠電泳核酸凝膠電泳2什么是電泳？什么是電泳？ 帶點(diǎn)顆粒在電場作用下，向著與其電性相反的電極移動，稱為電泳。生物大分子如蛋白質(zhì)，核酸，多糖等大多都有陽離子和陰離子基團(tuán)，稱為兩性離子在電場中，帶電顆粒向正極或負(fù)極遷移，遷移的方向取決于它們帶點(diǎn)的符號。3凝膠電泳有幾類？一瓊脂凝膠電泳（分辨DNA范圍為0.250kb)二聚丙烯酰胺凝膠電泳（分辨范圍為11000kb）三脈沖電場凝膠電泳（分離到高達(dá)107bp的DNA大分子）前言；核酸凝膠電泳是分子克隆技術(shù)之一，用于分離鑒定和純化DNA或 RNA片段。4核酸凝膠電泳的基本原理 凝膠電泳的原理比較簡單。當(dāng)一種帶電分子放在電場當(dāng)中時(shí)，它們就會以一定的速

2、度移向適當(dāng)?shù)碾姌O。帶點(diǎn)分子在電場作用下的移動速度，稱之為電泳遷移率，它同電場的強(qiáng)度和電泳分子本身攜帶的靜電荷數(shù)成正比。也就是說，電場強(qiáng)度越大，電泳分子所攜帶的靜電荷越多，其移動速度也就越快，反之則慢。在哪電泳中，使用無反應(yīng)活性的瓊脂糖與聚丙烯酰胺凝膠作支持介質(zhì)，從而將電泳分子的對流運(yùn)動降低到極低，使電泳分子的移動速度與其分子的摩擦系數(shù)成反比。已知摩擦系數(shù)是分子大小、極性及介質(zhì)黏度的函數(shù)，因此根據(jù)分子大小的不同、構(gòu)型或形狀的差異，以及所帶凈電荷的多寡，便可以通過電泳將核酸或蛋白質(zhì)分子混合物中的各種成分彼此分離開來。5 在生理?xiàng)l件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基團(tuán)，是呈離子狀態(tài)的。從這種意義上

3、講，DNA和RNA的多核苷酸鏈可稱為多聚陰離子。因此，當(dāng)核酸分子被放置在電場當(dāng)中時(shí)，它們就會向正極的方向遷移。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相當(dāng)數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正極方向遷移。在一定的電場強(qiáng)度，DNA分子的這種遷移速度，亦即電泳遷移率，取決于核算分子本身的大小和 結(jié)構(gòu)。分子質(zhì)量較小的DNA分子比分子質(zhì)量較大的DNA分子，具有較緊密的構(gòu)型，所以其電泳遷移率也就比同等分子質(zhì)量的的松散型的開環(huán)DNA分子或線性分子要快些。這就是應(yīng)用凝膠電泳技術(shù)分離DNA片段的基本原理。6常見的電泳儀常見的電泳儀水平電泳儀水平電泳儀垂直電泳儀垂直電泳儀7脈沖電泳脈沖電泳

4、8電泳的梳子電泳的梳子電泳槽電泳槽9電泳儀電泳儀10一瓊脂糖凝膠電泳 瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂或瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳方法。對于分子量較大的樣品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔徑較大的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離。瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，物質(zhì)分子通過時(shí)會受到阻力，大分子物質(zhì)在涌動時(shí)受到的阻力大，因此在凝膠電泳中，帶電顆粒的分離不僅取決于凈的性質(zhì)和數(shù)量，而且還取決于分子大小，這就大大提高了分辨能力。 凝膠的分辨能力 同凝膠的類型和濃度有關(guān)。分辨DNA片段范圍0.250kb；而要分辨較小分子質(zhì)量的DNA片段，則要用聚丙烯酰胺凝膠，其分辨范圍為11000bp。凝膠濃度的高低影響凝膠介質(zhì)孔隙的大小，濃

5、度越高，孔隙越小，其分辨能力也就越強(qiáng)；反之，濃度越低，孔隙就增大，其分辨能力也就越弱。11DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA分子在高于等電點(diǎn)的pH溶液中帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速率向正極方向移動。12瓊脂糖凝膠電泳的操作瓊脂糖凝膠電泳的操作操作步驟：配膠 EB染色 點(diǎn)樣 膠圖分析 成像拍照 電泳 131 1、配膠、配膠 按所要分離的DNA分子的大小，稱取適量的瓊脂糖粉末，放入錐形瓶，加適量1TAE電泳緩沖液； 然后置微波爐內(nèi)加熱搖勻至完全溶化成透明狀，適當(dāng)冷卻后倒入膠

6、托；膠完全冷凝后放入電泳槽，電泳槽里的緩沖液必須沒過膠面。14鋪鋪 膠膠15凝膠凝固后取出梳子凝膠凝固后取出梳子16加緩沖液加緩沖液17 2、EB染色染色溴化乙錠是一種扁平分子，可以嵌入核酸雙鏈的配對堿基之間。在在紫外照射EB-DNA復(fù)合物時(shí)，出現(xiàn)不同的效應(yīng)。注意：嚴(yán)格區(qū)分污染區(qū)和非污染區(qū)，不把污染區(qū)的物品拿到非污染區(qū)碰過EB的手套要及時(shí)丟棄！183、點(diǎn)樣、點(diǎn)樣根據(jù)樣品不同可分兩種點(diǎn)樣體系：A、樣品+6Xloading bufferB、樣品可以直接點(diǎn)樣194、電泳、電泳點(diǎn)完樣后連接電源，設(shè)置好電源的參數(shù)，開始電泳。當(dāng)溴酚藍(lán)的帶（藍(lán)色）的移動至一定長度即可停止電泳。電壓要求：20V/CM膠，在樣

7、品出孔用低壓（3V/CM，15min）,然后調(diào)回標(biāo)準(zhǔn)電壓，跑出的條帶較好。20成像拍照成像拍照21膠圖分析膠圖分析22注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)23 一、配膠一、配膠1.電子稱的使用，要時(shí)刻注意保持電子稱的精確性，保持清潔，根據(jù)不同的濃度的膠稱取瓊脂糖。2.加TAE的量要適當(dāng)，以避免配出來的膠太薄導(dǎo)致膠孔太淺或濃度太低。3.倒膠前膠托一定要洗干凈，并檫干。倒膠時(shí)要待膠冷到一定溫度搖勻盡量不要產(chǎn)生氣泡。若膠液的溫度太高膠托容易變形。24二、二、EBEB染色染色1.碰到EB的手套要及時(shí)丟棄。2.加量要適當(dāng)，加EB至終濃度0.5g/ml3抹布要嚴(yán)格區(qū)分，不可交叉使用。25三、點(diǎn)樣電泳三、點(diǎn)樣電泳1.加樣時(shí)，槍

8、頭要上緊，吸樣均一準(zhǔn)確，排液時(shí)吸頭不要有殘留。2.點(diǎn)完樣后及時(shí)蓋上膠墊，注意不要蓋反。3.點(diǎn)電泳前最好檢查待用膠是否合格，點(diǎn)電泳時(shí)要對準(zhǔn)膠孔，盡量點(diǎn)完所有的樣。4.點(diǎn)完樣勿忘marker,并擺正膠位，電泳儀正負(fù)極不要插反，電泳槽的蓋子要蓋緊。26二二聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺(簡稱Acr)和交聯(lián)劑N，N一亞甲基雙丙烯酰胺(簡稱Bis)在催化劑過硫酸銨(AP)，N，N，N，N 四甲基乙二胺(TEMED)作用下，聚合交聯(lián)向成的具有網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)的凝膠，并以此為支持物進(jìn)行電泳。 聚丙烯酰胺凝膠電泳可根據(jù)不同分子所帶電荷的差異及分子大小的不同所產(chǎn)生的不同遷移率將DN

9、A或蛋白質(zhì)分離成若干條區(qū)帶，如果分離純化的樣品中只含有同一種DNA蛋白質(zhì)，樣品電泳后，就應(yīng)只分離出一條區(qū)帶。SDS是一種陰離子表面活性劑能打斷蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵，并按一定的比例和蛋白質(zhì)分子結(jié)合成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其本身原有的電荷，掩蓋了各種蛋白分子間天然的電荷差異。因此，各種蛋白質(zhì) SDS復(fù)合物在電泳時(shí)的遷移率，不再受原有電荷和分子形狀的影響，只是棒長的函數(shù)。這種電泳方法稱為SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(簡稱SDSPAGE)。27聚丙烯酰胺凝膠電泳種類 1.變性聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE） 變性聚丙烯酰胺凝膠是分子生物學(xué)常用技術(shù)之一，是根據(jù)寡核苷酸的大小來分離，因此可將全

10、長產(chǎn)物與不完整的短分子分開。電泳時(shí)通常每一泳道至少加1mg合成的寡核苷酸，電泳后在紫外燈下定位寡核苷酸條帶，將長度正確的寡核苷酸從凝膠上切下。主要用于單鏈DNA片段的分離或純化。 用途；放射性DNA探針的分離，DNA測序等。28 2.非變性聚丙烯酰胺凝膠（native-PAGE） 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native-PAGE)或稱為活性電泳是在不加入SDS 和疏基乙醇等變性劑的條件下，對保持活性的蛋白質(zhì)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，常用于酶的鑒定、同工酶分析和提純。使生物大分子在電泳過程中保持其天然的形狀和電荷，尤其是在電泳分離后仍能保持蛋白質(zhì)和酶等生物大分子的生物活性，對于生物大分子的鑒定有重

11、要意義，用于雙鏈DNA片段的分離于純化。 用途；制備高純度的DNA片段。29操作步驟操作步驟制板制板制濃縮膠制濃縮膠電泳槽安裝電泳槽安裝加樣加樣制分離膠制分離膠染色染色電泳電泳固定固定剝膠剝膠脫色脫色觀察結(jié)果觀察結(jié)果301.1.制膠制膠1）在聚合的分離膠上直接灌注濃縮膠，并立即在濃縮膠溶液中插入干凈的梳子。小心避免混入氣泡，再加入濃縮膠溶液以充滿梳子之間的空隙，將凝膠垂直放置于室溫下。2）濃縮膠聚合完成后（30分鐘）小心移出梳子。把凝膠固定于電泳裝置上，上下槽各加入Tris-甘氨酸電極緩沖液。2.2.樣品制備樣品制備取樣品加入0.5ml2SDS凝膠加樣緩沖液混勻。3.3.加樣及電泳加樣及電泳用

12、吸嘴吸取50l，從加樣孔底部緩慢加樣。注意：加樣時(shí)不得插傷凝膠孔面，不得產(chǎn)生氣泡、樣品不得溢出加樣孔。314.4.接電源與電泳接電源與電泳上槽接負(fù)極，下槽接正極。調(diào)節(jié)電壓至80V電泳至樣品前沿剛好進(jìn)入分離膠后，把電壓提高到120V（凝膠上所加電壓為8V/cm），繼續(xù)電泳直至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部上方約1cm（約23小時(shí)），然后關(guān)閉電源，取出插頭。5.5.剝膠剝膠從電泳裝置上卸下玻璃，用水果刀撬開玻璃板。并用刀在緊靠最左邊一孔凝膠下部切去一角以標(biāo)注凝膠的方位。6.6.染色與脫色染色與脫色用考馬氏亮藍(lán)染色液對SDS聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行室溫染色12小時(shí)后，用脫色液在脫色搖床上與脫色34次，每次2030分

13、鐘。32注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)1.丙烯酰胺和雙丙烯酰胺具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性并容易吸附于皮膚，操作時(shí)應(yīng)避免沾在臉、手等皮膚上。最好戴一次性手套進(jìn)行操作。2.過硫酸銨的主要作用是提供自由基引發(fā)丙烯酰胺和雙丙烯酰胺的聚合反應(yīng)，故一定要新鮮，貯存過久的過硫酸銨商品不能使用。此外，10 過硫酸銨必須現(xiàn)配現(xiàn)用。3.灌制凝膠時(shí)，應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡，因?yàn)闅馀輹绊戨娪痉蛛x效果。4.剛灌制注分離膠混合溶液后，應(yīng)在分離膠液面上加12cm高得水層，以阻隔空氣。膠液面上加水層時(shí)要特別小心，緩緩疊加，以免沖壞凝膠的膠面。5.聚丙烯酰胺凝膠電泳耗時(shí)長，電泳過程中產(chǎn)熱多，特別是夏天產(chǎn)熱更多。顧電泳過程中應(yīng)安裝循環(huán)冷卻水以帶走熱量，或在

14、4 冰箱中電泳。3334非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳變性聚丙烯酰胺凝膠電泳變性聚丙烯酰胺凝膠電泳35三脈沖電場凝膠電泳（PFGE ）在脈沖電場中，DNA分子的遷移方向隨著電場方向的周期性變化而不斷改變。在標(biāo)準(zhǔn)的PFGE中，第一個(gè)脈沖的電場方向在另一側(cè)成45夾角。由于瓊脂糖凝膠的電場方向、電流大小及作用時(shí)間都在交替變化，使得DNA分子能夠隨時(shí)調(diào)整其游動方向，以適應(yīng)凝膠孔隙的無規(guī)則變化。與相對分子質(zhì)量較小的DNA相比，相對分子質(zhì)量較大的DNA需要更多的脈沖次數(shù)來更換其構(gòu)型和方位，使其按新的方向游動。應(yīng)用脈沖電場凝膠電泳技術(shù)，可成功分離到高達(dá)107bp的DNA大分子。 36倒轉(zhuǎn)電

15、場系統(tǒng)倒轉(zhuǎn)電場系統(tǒng)垂直交變電場垂直交變電場箝位勻強(qiáng)電場系統(tǒng)箝位勻強(qiáng)電場系統(tǒng)反轉(zhuǎn)電場系統(tǒng)反轉(zhuǎn)電場系統(tǒng)37脈沖電泳的操作步驟脈沖電泳的操作步驟DNADNA樣品制備樣品制備限制酶消化限制酶消化脈沖脈沖分離、純化大分離、純化大的的DNA 片段片段EB染色，拍照染色，拍照紫外遞質(zhì)監(jiān)測紫外遞質(zhì)監(jiān)測DNA收集目的收集目的DNA381.脈沖電泳凝膠電泳的脈沖電泳凝膠電泳的DNA樣品制備（以金黃樣品制備（以金黃色葡萄球菌為例）色葡萄球菌為例）（1）取100ml對數(shù)生長期的金黃色葡萄球菌細(xì)胞于4，5000g離心5分鐘（2）用20ml TEN緩沖液沖洗沉淀，同樣條件離心5分鐘。在用10ml EC緩沖液使細(xì)胞懸浮。（

16、3）取1.5ml細(xì)胞樣品與相同體積含2%SeaPLaque瓊脂糖的EC緩沖液迅速混合均勻并等分流溶液至封閉的模塊中于4凝固，混合前加熱至瓊脂糖熔解并冷卻至50。39（4）對于每一個(gè)菌株，需要15-20個(gè)凝膠塊，將它們放至含有30-45ug/ml RNase的10ml EC緩沖液中，于37振蕩過夜。（5）去掉裂解緩沖液，換為10ml ESP緩沖液于50輕度搖溫育48h。（6）將凝膠塊放在10ml含有174ug/ml 苯甲基磺酰氟（PMSF）的TE緩沖液中，室溫溫育4h,以滅活ESP中的蛋白酶K。（7）用TE清洗瓊脂塊6h，至于TE中4 保存。402.限制酶消化（1）25ul 10 x反應(yīng)緩沖液，

17、30U 限制酶，加雙蒸餾水至250ul混勻。（2）取一個(gè)凝膠塊置其中，合適溫度下過夜后，用TE緩沖液洗滌并貯存。413.應(yīng)用應(yīng)用PFGE對樣品對樣品DNA進(jìn)行分析進(jìn)行分析（1）用0.5xTBE緩沖液制備一個(gè)0.8%SeakemHGT瓊脂糖凝膠，膠的厚度盡量與樣品凝膠塊相符。若用Wide Mini-Sub Cell進(jìn)行電泳的話，50ml該溶液即可。（2）凝膠后，小心移去樣品梳。將凝膠塊用小刀切成與樣孔一致的大小，將樣心的插入加樣孔，避免產(chǎn)生氣泡。（3）把膠放入電泳槽內(nèi)，加緩沖液，剛好覆蓋膠的表面即可，緩沖液事先14冷卻。42（4)將電泳槽和一個(gè)連著穩(wěn)壓電源的程序性開關(guān)設(shè)備相連。打開電源，調(diào)節(jié)蠕動

18、泵到適當(dāng)流速(510mL/rain)或打開變速泵至40。（5) 通過計(jì)算機(jī)啟動極性轉(zhuǎn)換程序。大于50kb 的限制性片段在1.2s 和0.4s 正向和反向的電脈沖下得以分離，時(shí)間一般為3.5h 或更長。小于50kb的限制性片段在0.4s正向和0.2s 反向的電脈沖(比率為2:1)下得以分離，時(shí)間為35h。（6)在 0.5g/mL 溴化乙錠中進(jìn)行染色并拍照。434.4.分離、純化大的分離、純化大的DNA DNA 片段片段（1)凝膠染色、分析后，在目的帶前(靠近正極處)切一個(gè) 0.25cm2左右的槽，注入0.8%Seaplaque瓊脂糖，使之凝固。（2)重新打開極性轉(zhuǎn)換開關(guān)，用紫外遞質(zhì)檢測DNA的遷

19、移，當(dāng)目的帶進(jìn)入Seaplaque凝膠中時(shí)，關(guān)閉開關(guān)，切下目的帶，移至1.5mL EP 管中。（3)加入2L 的tRNA，30L 5mol/L NACl，370L 蒸餾水，在6570之間，化膠并保溫10min。（4)苯酚/氯仿500L 抽提兩次。（5)用2.5 倍體積95%乙醇和1/10 體積NaAc3mol/L，pH5.2)于-7010min 沉淀水相。再用70%乙醇洗兩次并將沉淀溶于TE 緩沖液中。44脈沖電場凝膠電泳圖脈沖電場凝膠電泳圖45注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)1.換緩沖掖時(shí)盡可能小心不要碰壞瓊脂凝膠。2.PMSF 是一個(gè)強(qiáng)烈的蛋白酶共價(jià)抑制劑，即有毒又揮發(fā)，操作時(shí)應(yīng)在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。3.用蛋白酶K 包埋的材料時(shí)50溫育時(shí)間很長(2448h)，有些學(xué)者提出如此長時(shí)間不必要(Mortimer et al.1990)，且可能造成高分子質(zhì)量DNA 降解。在實(shí)驗(yàn)中可視情況而定。4.瓊脂糖凝膠塊在T