基因工程復(fù)習(xí)題答案版副本

1、基因工程原理復(fù)習(xí)題思考題基因工程緒論1、基因工程的定義與特征。定義：在體外把核酸分子（DNA的分離、合成）插入載體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合（重組DNA），引入原先沒有這類分子的受體細胞內(nèi)，穩(wěn)定地復(fù)制表達繁殖，培育符合人們需要的新品種（品系），生產(chǎn)人類急需的藥品、食品、工業(yè)品等。特征：1、具跨越天然物種屏障的能力。 2、 強調(diào)了確定的DNA片段在新寄主細胞中的擴增。2、試述基因工程的主要研究內(nèi)容。1）、目的基因的分離2）、DNA的體外重組（載體、受體系統(tǒng)等）3）、重組DNA分子轉(zhuǎn)移到受體細胞及其篩選4）、基因在受體細胞內(nèi)的擴增、表達、檢測及其分析。3、基因工程在食品工業(yè)上有何應(yīng)用發(fā)展？主要是通

2、過基因重組，使各種轉(zhuǎn)基因生物提高生產(chǎn)谷氨酸、調(diào)味劑、酒類和油類等有機物的產(chǎn)率；或者改良這些有機物組成成分，提高利用價值。4、轉(zhuǎn)基因是一把雙刃劍，請客觀談?wù)剬D(zhuǎn)基因及轉(zhuǎn)基因食品安全性的認(rèn)識。轉(zhuǎn)基因技術(shù)所帶來的好處是顯而易見的，在人類歷史進步和發(fā)展中起到了積極作用。首先，通過該項技術(shù)可以提供人們所需要的特性，改良培育新品種；第二，延長食品保存時間或增加營養(yǎng)成分；第三，將抗蟲防菌基因轉(zhuǎn)入到作物中，使作物本身產(chǎn)生抵抗病蟲害侵襲的能力， 減少了農(nóng)藥的使用量，有利于環(huán)境保護；第四，轉(zhuǎn)基因技術(shù)及基因食物在醫(yī)學(xué)方面得到廣泛研究和應(yīng)用。人們對轉(zhuǎn)基因技術(shù)的主要擔(dān)憂在于環(huán)境方面。外源基因的導(dǎo)入可能會造就某種強勢生物

3、， 產(chǎn)生新物種或超級雜草、損害非目標(biāo)生物、破壞原有生物種群的動態(tài)平衡和生物多樣性，也即轉(zhuǎn)基因生物存在潛在的環(huán)境安全問題。轉(zhuǎn)基因作物的大面積種植已有數(shù)年， 食用轉(zhuǎn)基因食品的人群至少有10億之多，但至今仍未有轉(zhuǎn)基因食品對生命造成危害的實例；更何況目前每一種基因工程食品在上市前，都要經(jīng)過國家法律認(rèn)可， 食品衛(wèi)生部門和環(huán)境部門的嚴(yán)格檢測。只有測試合格了，才能投放市場。因此公眾完全可以安全地消費、大膽地食用轉(zhuǎn)基因食品。第一章    DNA的分子特性與利用1、 原核生物和真核生物的基因表達調(diào)控有何差別？1）原核基因表達調(diào)控的三個水平：轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控、翻譯水平調(diào)控、蛋白質(zhì)加工水平

4、的調(diào)控原核基因表達調(diào)控主要是在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控。2）真核生物基因表達的特點：l 1基因組DNA存在的形式與原核生物不同；l 2真核生物中轉(zhuǎn)錄和翻譯分開進行；l 3基因表達具有細胞特異性或組織特異性；l 4真核基因表達的調(diào)控在多個水平上進行：DNA水平的調(diào)控、轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控、翻譯水平調(diào)控、蛋白質(zhì)加工水平的調(diào)控； 2、 什么是基因？根據(jù)基因的產(chǎn)物，基因可分為哪三類？基因是具有生物學(xué)功能的、在染色體上占據(jù)一定位置的一段核苷酸序列，是分子遺傳的功能單位。根據(jù)基因的產(chǎn)物，基因可分為三類：l 轉(zhuǎn)錄并翻譯編碼蛋白質(zhì)的基因: 包括結(jié)構(gòu)蛋白基因、編碼酶的基因、調(diào)節(jié)基因l 轉(zhuǎn)錄但不翻譯產(chǎn)物的基因:

5、包括tRNA、rRNAl 不轉(zhuǎn)錄但有功能的DNA區(qū)段: 如啟動子、操縱基因3、 引起核酸變性的因素主要有哪些？核酸變性后性質(zhì)有何變化？引起核酸變性的因素：-溫度、酸、堿、甲醛和尿素等。DNA變性后，它的一系列性質(zhì)發(fā)生變化，如紫外吸收(260 nm)值升高（增色效應(yīng)）, 粘度降低等，如DNA增加2540%. RNA約增加1.1%。4、 DNA復(fù)性及其影響因素。變性DNA在適當(dāng)?shù)臈l件下，兩條彼此分開的單鏈可以重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)，這一過程稱為復(fù)性。DNA復(fù)性的程度、速率與復(fù)性過程的條件有關(guān)，也與它本身的組成和結(jié)構(gòu)有關(guān)：分子量越大復(fù)性越難。濃度越大，復(fù)性越容易。（附加：注意：將熱變性的DNA驟然冷

6、卻至低溫時，DNA不可能復(fù)性。但是將變性的DNA緩慢冷卻時，可以復(fù)性。復(fù)性的應(yīng)用：核酸的雜交，分子擴增）第二章    基因工程操作的基本技術(shù)1. DNA凝膠電泳中核酸分子分離的機理。 在堿性環(huán)境下，核酸分子帶負(fù)電荷，在外加電場的作用下，分子在凝膠多孔性剛性濾孔中從負(fù)極向正極泳動，其中主要由于分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)達到分離不同大小核酸分子的目的。2. DNA凝膠電泳中影響電泳遷移率的因素主要有哪些？1）分子本身的影響 Ø分子的大?。盒t快 Ø帶電荷數(shù)：多則快 Ø分子構(gòu)型：超螺旋>解螺旋2）電場：直流電場 Ø電壓高則快 &#

7、216;電壓太高則結(jié)果不準(zhǔn)確常用35V/CM3）支持物介質(zhì) Ø種類：瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠 Ø凝膠濃度: 濃度大，篩孔小，適合小分子電泳；濃度小，篩孔大，適合大分子電泳4）電泳緩沖液 Ü pH值：偏堿性，帶負(fù)電荷 Ü 離子濃度：離子濃度高_ 電流大_發(fā)熱快_膠溶解 Ü種類：TAE、TBE、TPE、TNE3. PCR的原理和主要反應(yīng)過程，并分析影響PCR擴增的影響因素。PCR原理：變性溫度下， DNA雙鏈變性雙螺旋解開成單鏈DNA，在退火溫度中人工合成的特異引物根據(jù)堿基互補配對原則與單鏈DNA特異結(jié)合，然后在DNA聚合酶的作用下，在延伸溫度下

8、不同的脫氧核苷酸按照堿基互補配對原則在引物的引導(dǎo)下合成與模板DNA互補的新鏈，實現(xiàn)DNA的擴增。影響PCR擴增的影響因素：§(1)Taq酶：常用1U/25µL ³濃度低，擴增產(chǎn)物不夠； ³濃度高，非特異性擴增增加； ³酶的活性；§(2)dNTP的濃度：常用100-200µmol/L，不能低于20µmol/L，特異性、保真性；§(3)模板：主要考慮純度及使用量，對純度要求不高，但含有酚、氯仿等雜質(zhì)則難以成功。使用量從幾個ng到100ng.§µmol/L之間，過多則非特異擴增增加，形成引物

9、二聚體；§mmol/L； 影響：酶的活性、引物-模板退火、特異性§(6)PCR反應(yīng)程序設(shè)定：變性溫度和時間、引物退火溫度Tm與時間、引物延伸溫度與時間和循環(huán)數(shù)4. PCR引物設(shè)計的原則，若給一指定DNA序列并需要通過PCR擴增此序列，如何設(shè)計擴增引物？（關(guān)于如何設(shè)計這個問題，靠自己了）引物設(shè)計原則： 1、G+C含量45-55%； 2、Tm值高于55； 3、引物特異性； 4、引物擴增跨度； 5、是否形成引物二聚體5. 定量PCR的原理？Ct值的含義。原理：通過實時檢測PCR每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物相對應(yīng)的熒光信號，來實現(xiàn)對起始模板進行定量及定性的分析。初始模板量X0的對數(shù)值與C(T

10、) 值之間呈線性關(guān)系：log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log N Ct值的含義是：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號開始由本底進入指數(shù)增長階段時到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（如后圖所示，圖僅供參考）Threshold line C(t) value C(t) value18.12 +/-0.04閾值線Ct值Ct值6. 分子雜交的類型主要有哪些？探針的標(biāo)記方法與標(biāo)記類型？常用的雙鏈DNA的標(biāo)記方法是哪兩種？探針的標(biāo)記方法：切口平移法、隨機引物合成法，末端標(biāo)記法，PCR標(biāo)記法，體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)記法。探針按核酸分子分：DNA探針和RNA探針；按標(biāo)記物的不同：放射性標(biāo)記探針和非放射性標(biāo)記探針。標(biāo)記類

11、型：按核酸分子的不同：可分為DNA探針和RNA探針根據(jù)標(biāo)記物的不同：可分放射性標(biāo)記探針和非放射性標(biāo)記探針；雙鏈DNA探針標(biāo)記主要方法：切口平移法、隨機引物合成法；7. Southern雜交一般過程及影響雜交因素。Southern雜交操作步驟:(1) 用限制性內(nèi)切酶酶切DNA, 經(jīng)凝膠電泳分離各酶切片段； (2) 轉(zhuǎn)膜：將DNA片段轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上；(3) 預(yù)雜交：封阻濾膜上非特異性位點； (4) 雜交：讓探針與同源DNA片段特異性結(jié)合；(5) 洗脫：去除非特異性結(jié)合的探針；(6) 自顯影檢查目的DNA所在的位置。Southern雜交影響因子1）、目的DNA在總DNA中所占的比例2

12、）、探針的大小和標(biāo)記效率3）、轉(zhuǎn)移到濾膜上的DNA量4）、探針與靶DNA的同源性8. 基因組文庫的構(gòu)建過程？如何確定文庫的大小？基因組文庫的構(gòu)建過程：1）從生物體提取大片斷的基因組DNA；2）用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶（常為4堿基識別位點）進行部分酶切或超聲波打斷基因組DNA ；3）在瓊脂凝膠電泳上或蔗糖梯度離心篩選適當(dāng)長度的DNA片斷（根據(jù)載體的要求）； 4）載體的酶切、回收；5）將處理好的基因組DNA片斷與載體連接；6）將重組子導(dǎo)入宿主細胞7）文庫的鑒定、收集、保存；確定文庫大小的方法：以在構(gòu)建的基因組文庫中任一基因存在的概率來衡量文庫的質(zhì)量或完備性，它與基因文庫最低所含克隆數(shù)N（即文庫大小）之

13、間的關(guān)系可用下式表示： N = ln ( 1 P ) / ln ( 1 f ) 其中： N：文庫所需的總克隆數(shù)； P：任一基因被克?。ɑ虼嬖谟诨蛭膸熘校┑母怕?； f：克隆片段的平均大小/ 生物基因組的大小。9. 基因文庫的類型包括哪兩種？各有什么特點？10. 一般質(zhì)粒DNA的構(gòu)型有哪幾種？在瓊脂糖凝膠電泳中的有何特點？超螺旋質(zhì)粒DNA、開環(huán)質(zhì)粒DNA、線狀質(zhì)粒DNA在瓊脂糖凝膠電泳的特點是：電泳的泳動速度由大到小分別是：超螺旋質(zhì)粒DNA>線狀質(zhì)粒DNA>開環(huán)質(zhì)粒DNA11. 堿裂解法提取質(zhì)粒DNA的原理，分析影響試驗結(jié)果的各種可能因素。堿裂解法原理：在堿性條件下，雙連DNA氫鍵斷

14、裂，結(jié)構(gòu)破壞變性，環(huán)狀超螺旋質(zhì)粒不充分變性。在中性條件下變性質(zhì)?；謴?fù)原來構(gòu)型，而線性大分子細菌DNA不能復(fù)性呈不溶物而經(jīng)離心除去。（各種可能因素是上一屆的，具體其實大家可以根據(jù)那天師兄說的去寫）提取失?。?）洗去雙鏈時，將質(zhì)粒DNA洗去； 2）破壁失敗，質(zhì)粒沒析出； 3）加劑問題電泳失?。?）電壓太高 2）沒加染色劑 3）膠穿孔 4）電泳時間過長12. 電泳緩沖液使用一定時間后出現(xiàn)DNA在凝膠中跑不動現(xiàn)象的原因，有何解決辦法？原因：電泳緩沖液的離子的富集作用；解決方法：1.更換成新配置的電泳緩沖液； 2.把電泳槽中的緩沖液倒出混勻后再重新使用13. 電泳的指示劑和染色劑有何區(qū)別，各自的作用是什

15、么？指示劑一定要在電泳前加入，指示劑一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400組成載樣緩沖液；（一般為：溴酚蘭，二甲苯青）作用：預(yù)知電泳的速率及方向；使樣品呈現(xiàn)顏色，便于加樣；一些高濃度蔗糖或其它物質(zhì)增加DNA的密度，可以防止DNA的擴散染色劑即可以在電泳前加入樣液，又可以電泳后再對凝膠染色；（溴化已錠EB、硝酸銀、Goldview染料）作用：呈現(xiàn)出核酸電泳后的帶型。第三章 基因克隆的酶學(xué)基礎(chǔ)1、 限制性核酸內(nèi)切酶的類型，基因工程常用的是哪種限制性核酸內(nèi)切酶？（常用II型）2、 什么是星活性，產(chǎn)生星活性的因素可能有哪些？在非最適合的條件下酶的識別特異性降低，產(chǎn)生非特異性帶，這種活性稱星活性。產(chǎn)生Star活

16、性的因素：（書上P46-P47答案）高濃度甘油，堿性pH，存在Mn2+，低離子強度，低鹽濃度，低pH3、 結(jié)合已做的實驗，分析影響酶切的因素。（這個答案是上屆的，僅供參考）1）DNA的純度：DNA中的雜質(zhì)如蛋白質(zhì)、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都會影響酶的活性。 2）DNA的甲基化程度 ：dam甲基化酶（修飾GATC中的A）； dcm甲基化酶（修飾CCA/TGG的C）。3）溫度 ：不同的限制性內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度不同。大多數(shù)是37 oC，少數(shù)要求40-65 oC。4）緩沖液(Buffer)：是影響限制酶活性的重要因素。 MgCl2、NaCl/KCl：提供Mg2+和離子強度； Tris-HC

17、l：維持pH； 二硫蘇糖醇（DTT）：保持酶穩(wěn)定性； 牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的穩(wěn)定；巰基乙醇：保持酶的穩(wěn)定性，防止酶失活4、 限制性核酸內(nèi)切酶命名規(guī)則及各字母代表的含義。（例子和圖幫助大家理解而已）命名規(guī)則：寄主菌屬名的第1個字母種名的前兩個字母菌株或菌型代號（大寫）空白發(fā)現(xiàn)序列（羅馬數(shù)字）例子：EcoR(E：屬名；co：種名；R：株；：發(fā)現(xiàn)次序)5、 簡單敘述同尾酶和同裂酶的差別。同尾酶：來源不同，識別的序列不同，但能切出相同的粘性末端，連接后不能被相關(guān)的酶同時切割。同裂酶：識別序列相同，切割位點有些相同，有些不同。分完全同裂酶和不完全同裂酶（PS：完全同裂酶：識別位點和切點完全相同

18、。 不完全同裂酶：識別位點相同，但切點不同。）6、 連接酶主要有哪些類型？有何異同點？影響連接酶連接效果的因素主要有哪些？類型：DNA連接酶和RNA連接酶異同點：相同點：都能以DNA為模板，從5'向3'進行核苷酸或脫氧核苷酸的聚合反應(yīng)。不同點：DNA聚合酶識別脫氧核糖核苷酸，在DNA復(fù)制中起作用；而RNA聚合酶聚合的是核糖核苷酸，在轉(zhuǎn)錄中起作用。 影響因素：（影響因素就四個，后面分析覺得煩的話大家自己看著辦啦）1）連接所用的目的片段的狀態(tài)： ¹ 效率：粘性末端>平端(100倍)； ¹ 5，突出>3，突出； ¹平端：HaeIII>A

19、luI>HinCII>SmaI2）連接溫度 ¹連接效果最好在37 ，但形成的互補不穩(wěn)定;¹最佳連接溫度：12-16 ，較好的連接效果，互補又較穩(wěn)定;3）反應(yīng)液中的成分： ¹ ATP：反復(fù)凍熔，ATP活性降低，ATP溶解度不高，連接緩沖液宜分裝； ¹單價離子：150-200mM NaCl，提高連接效果； ¹ PEG：5%以下可以提高連接效率4）插入片段與載體的濃度比例 ¹載體DNA與外源DNA的分子摩爾比通常為13左右，甚至110 或更高。 ¹目的或作用：增加插入片段與載體的接觸機會，減少載體自我連接的現(xiàn)象。7、

20、試分析提高平端DNA連接效率的可能方法。（傳說中的網(wǎng)上答案）1、低溫下長時間的連接效率比室溫下短時間連接的好。2、在體系中加一點切載體的酶，只要連接后原來的酶切位點消失。這樣可避免載體自連，應(yīng)該可以大大提高平端連接的效率。3、足夠多的載體和插入片段是最重要的 。4、平端的連接對于離子濃度很敏感5、盡可能縮小連接反應(yīng)的體積6、建議放在四度冰箱連接兩天效率更高比14度好8、 基因工程中常用的DNA聚合酶主要有哪些？1）大腸桿菌DNA聚合酶 2）Klenow fragment 3）T7 DNA聚合酶 4）T4 DNA聚合酶 5）修飾過的T7 DNA聚合酶 6）逆轉(zhuǎn)錄酶7）Taq DNA聚合酶第四章

21、基因克隆的載體系統(tǒng)1、 作為基因工程載體，其應(yīng)具備哪些條件？! 具有針對受體細胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性）； ! 具有合適的篩選標(biāo)記；! 具有較高的外源DNA的載裝能力；! 具有多克隆位點（MCS）；! 具有與特定受體細胞相適應(yīng)的復(fù)制位點或整合位點。2、 質(zhì)粒的不相容性及其分子機理。 定義：任何兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，不能同時存在于一個細胞中，這種現(xiàn)象稱為質(zhì)粒的不相容性。 分子機理：兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制同時受到同一種拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的干擾，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)不同，其中拷貝數(shù)多的質(zhì)粒在以后的細胞分裂周期中更具優(yōu)勢。3、 載體的類型主要有哪些？在基因工程操作中如

22、何選擇載體？基因工程中常用的載體(vector)主要包括質(zhì)粒(plasmid)、噬菌體(phage)和病毒(virus)三大類。這些載體均需經(jīng)人工構(gòu)建，除去致病基因，并賦予一些新的功能，如有利于進行篩選的標(biāo)志基因、單一的限制酶切點等。 4、 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原理，影響轉(zhuǎn)化率的因素有哪些？A、 化學(xué)法（CaCl2法)轉(zhuǎn)化原理：是Ca2+與細菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，后者經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細胞膜出現(xiàn)空隙，質(zhì)?；駾NA重組分子便可進入細胞內(nèi)（感受態(tài)細胞）。B、 電穿孔轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化原理：將待轉(zhuǎn)化的質(zhì)?；駾NA重組連接液加在電穿孔轉(zhuǎn)化儀的樣品池中，兩極施加高壓電場，在強大電場的作用下，細菌細胞壁和細胞膜

23、產(chǎn)生縫隙，質(zhì)粒或DNA重組分子便可進入細胞內(nèi)。影響轉(zhuǎn)化率的主要影響因素:1）載體本身的性質(zhì)及其空間構(gòu)象：超螺旋構(gòu)象轉(zhuǎn)化率最高；2）插入片段的大?。翰迦肫卧酱螅D(zhuǎn)化效率越低；3）受體細胞的類型及預(yù)處理；4）轉(zhuǎn)化方法：電擊法高于化學(xué)法。5、重組體分子的選擇方法主要有哪些？并簡單闡述其原理。從總體上看，重組體分子的選擇與鑒定方法基本上可以分為如下幾個類型： （1）基于載體遺傳標(biāo)記檢測法在構(gòu)建基因工程載體系統(tǒng)時，載體DNA分子上通常攜帶了一定的選擇性遺傳標(biāo)記基因，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞后可以使后者呈現(xiàn)出特殊的表型或遺傳學(xué)特性，據(jù)此可進行轉(zhuǎn)化子或重組子的初步篩選。（2）基于克隆DNA序列檢測法Southe

24、rn印跡雜交：根據(jù)毛細管作用的原理，使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉(zhuǎn)移并結(jié)合在適當(dāng)?shù)臑V膜上，然后通過與已標(biāo)記的單鏈DNA探針的雜交作用以檢測這些被轉(zhuǎn)移的DNA片段。（3）基于外源基因產(chǎn)物檢測法如果目的基因產(chǎn)物能降解某些藥物使菌株呈現(xiàn)出抗性標(biāo)記，或者基因產(chǎn)物與某些藥物作用是顯顏色反應(yīng)，則可根據(jù)抗性或顏色直接篩選含目的基因的克隆子。6、用已學(xué)過的重組體分子的選擇與鑒定技術(shù)，試設(shè)計一個試驗方案，假如一特異PCR擴出的基因或基因片斷重組進T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，如何鑒定并獲得真實轉(zhuǎn)化子？(自理)第五章 基因的克隆一般方法1、基因的克隆方法主要有哪些？并闡述其克隆原理（至少3種，都是書上找的，自選哈，建議

25、必選DD RT-PCR和SSH，原因請看下題）？1）差減雜交（SH）通過DNA復(fù)性動力學(xué)原理富集目的基因序列，并以此構(gòu)建減數(shù)文庫的方式來進行目的基因分離克隆的。2）抑制性差減雜交（SSH）SSH的核心技術(shù)是抑制性PCR，它是一種將檢測子cDNA單鏈標(biāo)準(zhǔn)化步驟和消減雜交步驟結(jié)合為一體的技術(shù)。其中標(biāo)準(zhǔn)化步驟均等了檢測子中的cDNA單鏈豐度，而消減雜交步驟去除了檢測子和驅(qū)趕子之間的共同序列，使檢測子和驅(qū)趕子之間不同的序列得到擴增。3）差異顯示PCR（DD RT-PCR）利用真核生物mRNA結(jié)尾處有POLY（A）結(jié)構(gòu)，在其3端設(shè)計象5-T11GA樣引物，該引物可與mRNA總數(shù)的十二分之一結(jié)合，從而使這

26、部分基因得到逆轉(zhuǎn)錄，同時結(jié)合5端的隨機引物（20條10-mer），可以使不同長度的基因得到擴增。4）DNA代表性差異分析（DNA RDA）代表性差別分析是通過突變型（驅(qū)趕DNA，driver DNA）與野生型（檢測DNA，tester DNA）基因組之間的差異來分離和鑒定突變基因的方法。5）擴增限制性片段長度多樣性（AFLP）基因組DNA經(jīng)過限制性內(nèi)切酶消化后，產(chǎn)生粘性末端。使用人工合成的短的雙鏈接頭，該接頭一端具有同樣的內(nèi)切酶識別粘性末端，互補連接后成為DNA模板。接頭和與接頭相鄰的酶切片斷的幾個堿基序列作為引物的結(jié)合位點。參考文獻：關(guān)德軍.AFLP技術(shù)原理及其在植物研究中的應(yīng)用.安徽農(nóng)業(yè)科

27、學(xué)，2006，34（15）：3625-3628）6）cDNA微陣列建立一套統(tǒng)一且具有高質(zhì)量、高代表性的cDNA列陣膜，在這一列陣膜上每個cDNA克隆都有固定的位置和編號，這樣大大方便了數(shù)據(jù)的綜合比較分析，并可對每個cDNA克隆子進行定量分析。在列陣雜交的基礎(chǔ)上，還可以進行雜交測序，從而測定每個cDNA克隆子的序列。2、簡單闡述差異顯示PCR克隆基因的原理及其優(yōu)缺點，有何應(yīng)用？主要原理：利用真核生物mRNA結(jié)尾處有POLY（A）結(jié)構(gòu)，在其3端設(shè)計象5-T11GA樣引物，該引物可與mRNA總數(shù)的十二分之一結(jié)合，從而使這部分基因得到逆轉(zhuǎn)錄，同時結(jié)合5端的隨機引物（20條10-mer），可以使不同長度

28、的基因得到擴增。優(yōu)點：l 簡便、靈敏、高效、省時，能快速顯示mRNA的組成。l 所需的mRNA量少。l 各樣本mRNA的差異可同時進行比較。l 擴出的cDNA可直接用于測序、文庫篩選等。缺點：l 假陽性條帶多，對低豐度的基因表達不容易檢測。l 工作量大。l 無法定量研究。l 擴出的條帶往往是3端比較短的UTR區(qū)的一段序列，提供的信息較少。利用該技術(shù)，目前已有越來越多的差別表達基因得以分離和鑒定，在分子生物學(xué)和基因工程研究領(lǐng)域發(fā)揮了極大的作用。（P221）3、抑制性差減雜交的原理與應(yīng)用。原理：SSH的核心技術(shù)是抑制性PCR，它是一種將檢測子cDNA單鏈標(biāo)準(zhǔn)化步驟和消減雜交步驟結(jié)合為一體的技術(shù)。其

29、中標(biāo)準(zhǔn)化步驟均等了檢測子中的cDNA單鏈豐度，而消減雜交步驟去除了檢測子和驅(qū)趕子之間的共同序列，使檢測子和驅(qū)趕子之間不同的序列得到擴增。應(yīng)用：l 基因突變體的研究：如基因的表達與不表達；l 基因時空表達的研究：如根、莖、葉；l 不同處理條件下的基因表達差異：如施肥與不施肥、光照與不光照。4、酵母雙雜交技術(shù)、噬菌體表面展示技術(shù)的原理。A酵母雙雜交技術(shù)原理：大部分真核生物的位點特異轉(zhuǎn)錄激活因子通常具有兩個可分隔開的結(jié)構(gòu)域，一個是DNA特異結(jié)合域（DNA-binging domain,BD），一個是轉(zhuǎn)錄激活域(transcriptional activation domain,AD)。這兩個結(jié)構(gòu)域各

30、具功能，互不影響，但一個完整的、具有激活特定基因表達的激活因子必須同時含有這兩個結(jié)構(gòu)域，否則無法完成其激活功能。不同來源的激活因子的BD區(qū)與AD區(qū)結(jié)合后則能特異地激活BD結(jié)合基因的表達。B噬菌體表面展示技術(shù)原理：當(dāng)外源DNA片段插入絲狀噬菌體基因組的一個外被蛋白基因中時，如果兩者讀碼框結(jié)構(gòu)保持一致，這個外源DNA片段所編碼的產(chǎn)物可與此外被蛋白一起以融合蛋白的形式表達，并顯示在噬菌體的表面。利用抗此外源基因編碼產(chǎn)物（多肽或蛋白）的抗體，通過親和純化，就能從大量的噬菌體中富集、分離出含有所要的基因的融合噬菌體。然后，通過基因擴增，得到大量所要的目的基因。5、T-DNA標(biāo)簽法克隆基因的一般技術(shù)路線。

31、Ø 農(nóng)桿菌侵染植物得到轉(zhuǎn)化苗，篩選出表現(xiàn)某種突變性狀的個體。Ø 建立突變體基因組文庫及野生型基因組文庫.Ø 用T-DNA片段做probe篩選突變體文庫，獲得陽性克隆。Ø 用獲得的陽性克隆篩選野生型基因組文庫，獲得野生型的陽性克隆。Ø 把陽性克隆轉(zhuǎn)化突變體進行功能互補及進行測序分析。第七章 克隆基因的表達1、通過比較，分析大腸桿菌表達系統(tǒng)和酵母表達系統(tǒng)各有何優(yōu)缺點。大腸桿菌表達外源基因的優(yōu)勢： ò全基因組測序，共有4405個開放型閱讀框架； ò基因克隆表達系統(tǒng)成熟、完善； ò繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、操作方便、遺傳穩(wěn)定；

32、ò被FDA批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物。大腸桿菌表達外源基因的劣勢： ò缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能； ò缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng)； ò內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白； ò周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素。甲醇酵母表達系統(tǒng)的優(yōu)點：ü 具有強的受嚴(yán)格調(diào)控的AOX1啟動子ü 表達蛋白的翻譯后的加工和修飾ü 營養(yǎng)要求低，工業(yè)化生產(chǎn)成本低ü 可高密度發(fā)酵ü 表達蛋白可存在于胞內(nèi)和胞外酵母表達系統(tǒng)的缺點：酵母表達蛋白有時會出現(xiàn)蛋白切割問題（這個找不到，百度的）2、如何提高克隆基因的表達水平？1）、表達載體的優(yōu)化設(shè)計；2）、提高目標(biāo)基因mRNA和目標(biāo)基因產(chǎn)物的穩(wěn)定性；3）、密碼子偏愛性；4）、表達環(huán)境條件的優(yōu)化。3、克隆基因目的蛋白的表達的形式主要有哪些類型？表達蛋白按溶解特性通常包括：不溶性蛋白和可溶性蛋白兩類，具體包括如下幾種結(jié)構(gòu)形態(tài)：包涵體型蛋白、融合型蛋白、分泌型蛋白4、啟動子從轉(zhuǎn)錄模式上可分為哪兩種？表達系統(tǒng)常選用哪一種？其機理是什么？啟動子從轉(zhuǎn)錄模式上分為：組成型啟動子和誘導(dǎo)型啟動子表達系統(tǒng)常選用誘導(dǎo)型啟動子機理：指在某些特定的物理或化學(xué)信號的刺激下，該種類型的啟動子可以大幅度地提高基因的轉(zhuǎn)錄水平。5、 表達載體和基因工程一