酶的提取與分離純化

1、酶工程姜 靜jing_QQ: 1336754154生物制藥教研室(A511)12知識回顧知識回顧3 第四章第四章 酶的提取與分離純化酶的提取與分離純化l預(yù)處理預(yù)處理（pretreatment）：包括固液分離和細(xì)胞：包括固液分離和細(xì)胞破碎（分離胞內(nèi)產(chǎn)物）等。破碎（分離胞內(nèi)產(chǎn)物）等。l初步純化初步純化（rough fractionation） （提?。撼ㄌ崛。撼ヅc目的產(chǎn)物性質(zhì)差異很大的雜質(zhì)。去與目的產(chǎn)物性質(zhì)差異很大的雜質(zhì)。l高度純化高度純化（fine fractionation） （精制）：除（精制）：除去與產(chǎn)物性質(zhì)相似的雜質(zhì)。去與產(chǎn)物性質(zhì)相似的雜質(zhì)。l濃縮與干燥濃縮與干燥（concent

2、ration and desiccation）（成品加工）（成品加工）: :使酶與溶劑分離的過程。使酶與溶劑分離的過程。l純化工藝評價純化工藝評價 基因工程酶基因工程酶/蛋白分離純化的一般流程蛋白分離純化的一般流程6 第一節(jié)第一節(jié) 酶的分離酶的分離一、發(fā)酵液預(yù)處理一、發(fā)酵液預(yù)處理目的：目的：u 提高固液分離效率提高固液分離效率u 使產(chǎn)物轉(zhuǎn)移用于后處理相中使產(chǎn)物轉(zhuǎn)移用于后處理相中u 去除部分雜質(zhì)去除部分雜質(zhì)( (一一) )發(fā)酵液的相對純化發(fā)酵液的相對純化1. 1. 無機離子的去除無機離子的去除2. 2. 雜蛋白質(zhì)的去除雜蛋白質(zhì)的去除3. 3. 色素及其他物質(zhì)的去除色素及其他物質(zhì)的去除（降低離子強

3、度、酶活性影響）（降低離子強度、酶活性影響）（沉淀、變性、凝聚和絮凝、吸附）（沉淀、變性、凝聚和絮凝、吸附）7( (二）發(fā)酵液的固液分離二）發(fā)酵液的固液分離1 . 影響發(fā)酵液過濾的因素影響發(fā)酵液過濾的因素 l1）菌種）菌種l2）培養(yǎng)基組成）培養(yǎng)基組成2. 提高過濾性能的方法提高過濾性能的方法 1 1）絮凝和凝聚）絮凝和凝聚 2 2）稀釋、加熱）稀釋、加熱 3 3）加助濾劑，）加助濾劑，常用硅藻土等。常用硅藻土等。 8二、細(xì)胞破碎（二、細(xì)胞破碎（胞內(nèi)酶胞內(nèi)酶） （一）（一）細(xì)胞壁組成細(xì)胞壁組成 l細(xì)胞壁的主要成分：細(xì)胞壁的主要成分：l 細(xì)菌：肽聚糖細(xì)菌：肽聚糖(N-(N-乙酰萄糖胺，乙酰萄糖胺，

4、N-N-乙酰胞壁酸乙酰胞壁酸) )l 酵母：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白質(zhì)酵母：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白質(zhì)l 真菌真菌: : 多糖（幾丁質(zhì)和葡聚糖）多糖（幾丁質(zhì)和葡聚糖） l 9各種微生物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)與組成各種微生物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)與組成 10 細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu) 酵母菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)酵母菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu) M甘露聚糖；甘露聚糖；P磷酸二酯鍵；磷酸二酯鍵；G葡聚糖葡聚糖 12（二）細(xì)胞破碎的方法（二）細(xì)胞破碎的方法 機械法機械法l機械搗碎法機械搗碎法l研磨破碎法研磨破碎法l勻漿破碎法勻漿破碎法l高壓勻漿法高壓勻漿法l超聲破碎法超聲破碎法非機械法非機械法l酶法酶法l化學(xué)法化學(xué)法l物理法物理法l干燥法

5、干燥法13l1.1.機械法：機械法：l 1 1）液體剪切：攪拌、勻漿。）液體剪切：攪拌、勻漿。l 2 2）固體剪切：研磨，珠磨，搗碎。）固體剪切：研磨，珠磨，搗碎。l 3 3）超聲波破碎法。）超聲波破碎法。l2. 2. 非機械法非機械法物理法物理法l 1 1）滲透壓突變法：高滲（蔗糖，高鹽等）滲透壓突變法：高滲（蔗糖，高鹽等）l 平衡后迅速轉(zhuǎn)入低滲溶液或水中。平衡后迅速轉(zhuǎn)入低滲溶液或水中。l 2 2）凍融法：反復(fù)低溫冰凍，室溫融化。）凍融法：反復(fù)低溫冰凍，室溫融化。14l3.3.酶解法（酶解法（e enzymatic lysisnzymatic lysis）： l 外加酶法：外加酶法：l 根據(jù)

6、細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成特點，選用適當(dāng)?shù)拿父鶕?jù)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成特點，選用適當(dāng)?shù)拿?。l 自溶法（自溶法（a autolysisutolysis）: :l 細(xì)胞結(jié)構(gòu)在本身具有的各種水解酶作用下發(fā)細(xì)胞結(jié)構(gòu)在本身具有的各種水解酶作用下發(fā) l生溶解的現(xiàn)象。生溶解的現(xiàn)象。15l4. 化學(xué)法化學(xué)法 應(yīng)用各種化學(xué)試劑與細(xì)胞膜作用，應(yīng)用各種化學(xué)試劑與細(xì)胞膜作用，使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變或破壞。使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變或破壞。l 1 1）有機溶劑處理：）有機溶劑處理：破壞膜磷脂結(jié)構(gòu)，常用破壞膜磷脂結(jié)構(gòu)，常用l丙酮、丁醇、氯仿等。丙酮、丁醇、氯仿等。l 2 2）表面活性劑處理：）表面活性劑處理：常用非離子型表面常用非離子型表面l活性劑

7、，如活性劑，如Triton X-100Triton X-100，TweenTween等。等。16破菌破菌 分離策略分離策略酶法酶法+高壓勻漿高壓勻漿/超聲超聲鹽及表面活性劑鹽及表面活性劑低濃度的變性劑低濃度的變性劑DetergentIntact membraneDetergentDetergent-solubilized proteinsa17（三）細(xì)胞破碎確認(rèn)（三）細(xì)胞破碎確認(rèn) 1.1.直接測定破碎前后的細(xì)胞數(shù)直接測定破碎前后的細(xì)胞數(shù)： 破碎前，用顯微鏡或電子微粒計數(shù)器直接計數(shù)；破碎前，用顯微鏡或電子微粒計數(shù)器直接計數(shù)； 破碎后，用染色法區(qū)分破碎細(xì)胞與完整細(xì)胞。破碎后，用染色法區(qū)分破碎細(xì)胞與

8、完整細(xì)胞。 2.2.測定導(dǎo)電率測定導(dǎo)電率： 利用破碎前后導(dǎo)電率的變化測定破碎程度。利用破碎前后導(dǎo)電率的變化測定破碎程度。 3.3.測定釋放的蛋白質(zhì)量或酶活力測定釋放的蛋白質(zhì)量或酶活力： 測定破碎液中胞內(nèi)蛋白質(zhì)或目的酶的釋放量，測定破碎液中胞內(nèi)蛋白質(zhì)或目的酶的釋放量，估算破碎率。估算破碎率。 18三、酶的提取三、酶的提取(extraction)(extraction) l 把酶從生物組織或細(xì)胞中以溶解狀態(tài)釋放把酶從生物組織或細(xì)胞中以溶解狀態(tài)釋放出來的過程，即將盡可能多的酶，盡量少的雜出來的過程，即將盡可能多的酶，盡量少的雜質(zhì)從原料中引入溶液。質(zhì)從原料中引入溶液。 l 19 提取目標(biāo)：提取目標(biāo)：

9、a. 將將目的酶最大限度地溶解出來。目的酶最大限度地溶解出來。 b. 保持生物活性。保持生物活性。l注意：溫度升高，溶解度加大。但為防止酶失活，注意：溫度升高，溶解度加大。但為防止酶失活，l一般一般采用低溫下（采用低溫下（0 0 1010）操作。操作。20提取原則提取原則la. 相似相溶。相似相溶。lb. 遠離等電點的遠離等電點的pH值，溶解度增加。值，溶解度增加。21 提取方法提取方法：（一）鹽溶液提?。ㄒ唬}溶液提取 常用稀鹽（常用常用稀鹽（常用NaClNaCl）溶液（鹽溶），）溶液（鹽溶），對酶穩(wěn)定性好、溶解度大對酶穩(wěn)定性好、溶解度大 ，最常用。，最常用。 （二）酸、堿溶液提?。ǘ┧帷?/p>

10、堿溶液提?。ㄈ┯袡C溶劑提取（三）有機溶劑提取22四、四、 離心分離離心分離三種形式：三種形式：1 1）離心沉降）離心沉降2 2）離心過濾）離心過濾3 3）離心分離和超離心）離心分離和超離心 23（一）一）基本原理基本原理1. 1. 離心力離心力 Fc = m ac m r r 2 2 m r r （2 N/60）2 2 N為離心機為離心機每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)每分鐘轉(zhuǎn)數(shù) （r/min ）；）； Fc通常以相對離心力通常以相對離心力RCF（relative centrifugal force）表示，）表示，即離心力即離心力F的大小相當(dāng)于地球引力（重力常數(shù)的大小相當(dāng)于地球引力（重力常數(shù)g）的多少倍。）的多少

11、倍。一一般用般用g g（或數(shù)字（或數(shù)字 g g）表示。）表示。RCF = RCF = m r r （2 N/60）2 2 /mg= 1.12 = 1.12 1010-5 -5 N2 2 r 此公式描述了相對離心力與轉(zhuǎn)速之間的關(guān)系此公式描述了相對離心力與轉(zhuǎn)速之間的關(guān)系 旋轉(zhuǎn)半徑用旋轉(zhuǎn)半徑用r r平均平均代替代替 r r平均平均=1/2=1/2（r r大大+r+r小?。ヽmcm242. 沉降系數(shù)沉降系數(shù):（sedimentation constant） 指單位離心力下顆粒的沉降速度指單位離心力下顆粒的沉降速度（sedimentation velocity）, ,用用S表示表示。 由于許多生物大分子

12、的由于許多生物大分子的S S值很小，所以定值很小，所以定義義10 10 13 s 為一個沉降單位，為一個沉降單位，1S = 1 10 13 s。 常用常用S表示某些生物大分子、亞細(xì)胞及亞表示某些生物大分子、亞細(xì)胞及亞細(xì)胞器的大小，如細(xì)胞器的大小，如16sRNA，蛋白質(zhì)的沉降系，蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)一般在數(shù)一般在1 200之間。之間。 25（二）離心機的種類（二）離心機的種類 按離心機轉(zhuǎn)速的不同，分為：按離心機轉(zhuǎn)速的不同，分為： 常速（低速）常速（低速） 高速高速 超速超速 26離心機的種類離心機的種類 27l溫度類型：溫度類型：常溫及常溫及冷凍冷凍l超速離心機均為冷超速離心機均為冷凍型。凍型。l使

13、用冷凍離心機時使用冷凍離心機時提前降溫，預(yù)冷離提前降溫，預(yù)冷離心頭。心頭。l使用超速離心機時使用超速離心機時先抽真空。先抽真空。28l角式及外擺式：外擺式一般為低速，角式及外擺式：外擺式一般為低速， l 角式由低速到超速均有。角式由低速到超速均有。 29l角式離心頭要配套，低溫使用要預(yù)冷，操角式離心頭要配套，低溫使用要預(yù)冷，操作注意穩(wěn)、蓋、旋緊。作注意穩(wěn)、蓋、旋緊。303132l材質(zhì)：玻璃，材質(zhì)：玻璃，塑料塑料l強度：和離強度：和離心速度相配心速度相配l大?。汉娃D(zhuǎn)大小：和轉(zhuǎn)子配套子配套l高速超速管高速超速管要加蓋要加蓋33l平衡、定溫、定速、定時。平衡、定溫、定速、定時。34（三）常用離心方法

14、（三）常用離心方法 差速離心法差速離心法 沉降速度法沉降速度法 密度梯度離心密度梯度離心 沉降平衡法沉降平衡法 等密度梯度離心等密度梯度離心351差速離心差速離心 （differential centrifugationdifferential centrifugation） 采用不同的離心速度和離心時間，使沉降速采用不同的離心速度和離心時間，使沉降速度不同的顆粒分批分離的方法度不同的顆粒分批分離的方法。特點：特點：用于分離大小和密度差異較大的顆粒。用于分離大小和密度差異較大的顆粒。 優(yōu)點：優(yōu)點：操作簡單操作簡單 。缺點：缺點：1）分離效果較差，分離效果較差， 不能一次得到純顆粒。不能一次得到

15、純顆粒。 2）沉降的顆粒受到擠壓沉降的顆粒受到擠壓。36 差速離心分離示意圖差速離心分離示意圖 （a a）離心前的懸浮液）離心前的懸浮液 （b b）（）（e e）離心不同時間后顆粒的沉降情況）離心不同時間后顆粒的沉降情況 37382密度梯度離心密度梯度離心 （density gradient centrifugationdensity gradient centrifugation） 樣品在樣品在密度梯度介質(zhì)密度梯度介質(zhì)中進行離心，使沉中進行離心，使沉降系數(shù)比較接近的組分得以分離的一種區(qū)帶降系數(shù)比較接近的組分得以分離的一種區(qū)帶分離方法。分離方法。 常用的密度梯度溶液是常用的密度梯度溶液是蔗糖蔗

16、糖溶液。溶液。39特點：特點：區(qū)帶內(nèi)的液相介質(zhì)密度小于樣品物質(zhì)區(qū)帶內(nèi)的液相介質(zhì)密度小于樣品物質(zhì) 顆粒的密度。顆粒的密度。適宜分離密度相近而大小不同的固相適宜分離密度相近而大小不同的固相 物質(zhì)物質(zhì)。40 密度梯度離心示意圖密度梯度離心示意圖 （a a）離心前）離心前 （b b）離心后）離心后 41Density gradient ultracentrifugation42 步驟：步驟： A.形成密度梯度形成密度梯度 B. 加樣加樣 C.離心離心 D.收集樣品收集樣品433. 等密度梯度離心等密度梯度離心 又稱又稱沉降平衡離心沉降平衡離心 （sedimentation sedimentation

17、equilibrium centrifugationequilibrium centrifugation）。）。 根據(jù)根據(jù)顆粒的密度不同顆粒的密度不同而進行分離。而進行分離。 離心時，在離心介質(zhì)的密度梯度范圍內(nèi)，離心時，在離心介質(zhì)的密度梯度范圍內(nèi)，不同密度的物質(zhì)顆?；蛳蛳鲁两担蛳蛏掀煌芏鹊奈镔|(zhì)顆?；蛳蛳鲁两?，或向上漂浮，達到與其相同的密度時不再移動，形成浮，達到與其相同的密度時不再移動，形成區(qū)帶。區(qū)帶。 44常用常用氯化銫氯化銫（CsClCsCl）作為梯度介質(zhì)。）作為梯度介質(zhì)。特點：特點： 介質(zhì)的密度梯度范圍包括所有待分離介質(zhì)的密度梯度范圍包括所有待分離物質(zhì)的密度。物質(zhì)的密度。適于分離沉

18、降系數(shù)相近，但密度不同適于分離沉降系數(shù)相近，但密度不同的物質(zhì)。的物質(zhì)。45 等密度梯度離心示意圖等密度梯度離心示意圖 （a a）離心前；）離心前； （b b）離心后）離心后 46沉降速度離心和沉降平衡離心的特點沉降速度離心和沉降平衡離心的特點4748（四）離心條件（四）離心條件離心力離心力: RCF = 1.12 RCF = 1.12 1010-5 -5 N2 2 r 離心時間離心時間: t=K/S*(最高立離心速度最高立離心速度/所需離心速度所需離心速度)2K=(lnr2-lnr1)/2= =(lnr2-lnr1)2.351011/n2溫度和溫度和pH:49五、沉淀分離（根據(jù)溶解度的不同）五

19、、沉淀分離（根據(jù)溶解度的不同）使溶液中的溶質(zhì)由液相轉(zhuǎn)變?yōu)楣滔辔龀鍪谷芤褐械娜苜|(zhì)由液相轉(zhuǎn)變?yōu)楣滔辔龀龉爬?、實用、簡單的初步分離方法古老、實用、簡單的初步分離方法50l在生物大分子制備中最常用的幾種沉淀方法：在生物大分子制備中最常用的幾種沉淀方法：l 中性鹽沉淀（鹽析法）中性鹽沉淀（鹽析法）l 有機溶劑沉淀有機溶劑沉淀l 選擇性沉淀（熱變性和酸堿變性）選擇性沉淀（熱變性和酸堿變性）l 等電點沉淀等電點沉淀l 有機聚合物沉淀有機聚合物沉淀51（一）鹽析沉淀法（改變離子強度）（一）鹽析沉淀法（改變離子強度） 1. 基本原理（鹽溶和鹽析）基本原理（鹽溶和鹽析） 向蛋白質(zhì)或酶的水溶液中加入中性鹽，可向蛋白

20、質(zhì)或酶的水溶液中加入中性鹽，可產(chǎn)生兩種現(xiàn)象：產(chǎn)生兩種現(xiàn)象： 1) 鹽溶鹽溶（salting insalting in） ： 低濃度的中性鹽增加蛋白質(zhì)的溶解度。低濃度的中性鹽增加蛋白質(zhì)的溶解度。 2) 鹽析鹽析（salting outsalting out） ： 高濃度的中性鹽降低蛋白質(zhì)的溶解度。高濃度的中性鹽降低蛋白質(zhì)的溶解度。52硫酸銨對馬血紅蛋白的溶解度的影響硫酸銨對馬血紅蛋白的溶解度的影響離子強度離子強度53 原因：原因： 高鹽濃度下鹽離子與蛋白質(zhì)分子爭奪水高鹽濃度下鹽離子與蛋白質(zhì)分子爭奪水分子，除去蛋白質(zhì)的水合外殼，降低溶解度分子，除去蛋白質(zhì)的水合外殼，降低溶解度而沉淀。而沉淀。 不同

21、蛋白質(zhì)分子量、表面電荷不同，在不同蛋白質(zhì)分子量、表面電荷不同，在不同鹽濃度下沉淀，不同鹽濃度下沉淀，逐漸增大鹽濃度，不同逐漸增大鹽濃度，不同蛋白質(zhì)先后析出，稱分段鹽析。蛋白質(zhì)先后析出，稱分段鹽析。54蛋白質(zhì)分子表面的疏水區(qū)域和荷電區(qū)域蛋白質(zhì)分子表面的疏水區(qū)域和荷電區(qū)域 555657l1）中性鹽的選擇）中性鹽的選擇l 常用（常用（NH4）2SO4，其突出優(yōu)點：，其突出優(yōu)點：l a. 溶解度大溶解度大l b. 分離效果好分離效果好l c. 不易引起變性不易引起變性l d. 價格便宜價格便宜l2. 鹽析用鹽鹽析用鹽582) 鹽濃度的表示鹽濃度的表示 用飽和（溶解）度表示用飽和（溶解）度表示: 溶液中

22、飽和硫酸銨的體積溶液中飽和硫酸銨的體積 飽和度飽和度 溶液的總體積溶液的總體積593) 調(diào)整鹽濃度的方式調(diào)整鹽濃度的方式 a. 飽和溶液法（添加飽和硫酸銨溶液）飽和溶液法（添加飽和硫酸銨溶液）適用于：蛋白質(zhì)溶液體積不太大，而達到的鹽濃適用于：蛋白質(zhì)溶液體積不太大，而達到的鹽濃度又不太高時。度又不太高時。 配制飽和硫酸銨溶液配制飽和硫酸銨溶液60所需添加飽和硫酸銨的體積可按下式計算：所需添加飽和硫酸銨的體積可按下式計算： S2-S1 V=V0 1-S2式中式中 V,V0分別為所需加入的飽和硫酸銨分別為所需加入的飽和硫酸銨體積及原溶液體積體積及原溶液體積S2,S1分別為所需達到的硫酸銨飽和度和分別

23、為所需達到的硫酸銨飽和度和原來溶液的硫酸銨飽和度原來溶液的硫酸銨飽和度61b. 添加固體硫酸銨添加固體硫酸銨適用于：蛋白質(zhì)溶液原來體積已經(jīng)很大，而要適用于：蛋白質(zhì)溶液原來體積已經(jīng)很大，而要達到的鹽濃度又很高時。達到的鹽濃度又很高時。按下式計算，得表中數(shù)據(jù)按下式計算，得表中數(shù)據(jù) B(S2-S1)W= 1-AS2A,B常數(shù)，與溫度有關(guān)。常數(shù)，與溫度有關(guān)。 實際使用時，可直接查表實際使用時，可直接查表 （各種飽和度下（各種飽和度下需加固體硫酸銨的量）。需加固體硫酸銨的量）。62調(diào)整硫酸銨溶液飽和度計算調(diào)整硫酸銨溶液飽和度計算表表63l低飽和度：低飽和度：飽和溶液滴加法。易于迅速混合均勻，一般飽和溶液

24、滴加法。易于迅速混合均勻，一般終飽和度不超過終飽和度不超過4040。l高飽和度：高飽和度：固體鹽添加法。不會大量增加溶液體積。固體鹽添加法。不會大量增加溶液體積。l1 1）固體硫酸銨充分研細(xì)，溫和攪拌中緩慢加入。）固體硫酸銨充分研細(xì)，溫和攪拌中緩慢加入。l2 2）冰箱中（）冰箱中（4 4）放置過夜，待沉淀完全后高速離心。）放置過夜，待沉淀完全后高速離心。l3 3）沉淀再溶解后可用超濾）沉淀再溶解后可用超濾（ultrafiltrationultrafiltration） 、透、透析析（dialysisdialysis）或?qū)游龌驅(qū)游觯╟hromatographychromatography）方法脫

25、鹽。方法脫鹽。64 3. 鹽析曲線的制作鹽析曲線的制作 l 如要分離一種新的蛋白質(zhì)和酶，應(yīng)先確定沉淀該如要分離一種新的蛋白質(zhì)和酶，應(yīng)先確定沉淀該物質(zhì)的硫酸銨飽和度。物質(zhì)的硫酸銨飽和度。 蛋白質(zhì)量蛋白質(zhì)量(mg)或酶活力或酶活力 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 硫銨硫銨 飽和度飽和度 65 硫酸銨濃度（硫酸銨濃度（% %） 枯草桿菌枯草桿菌 - -淀粉酶發(fā)酵液的鹽析曲線淀粉酶發(fā)酵液的鹽析曲線 66l4. 鹽析的影響因素鹽析的影響因素l1) 離子強度和種類（介紹鹽析常數(shù)）離子強度和種類（介紹鹽析常數(shù)） 蛋白質(zhì)溶解度與鹽濃度之間的關(guān)系：蛋白質(zhì)溶解度與鹽濃度之間的關(guān)系：I

26、KSSs0loglogI I：離子強度，：離子強度，I = MZI = MZ2 2；M M：離子濃度（：離子濃度（mol/Lmol/L）；）； Z Z：離子價數(shù)：離子價數(shù)S S：離子強度為：離子強度為I I時的蛋白質(zhì)的溶解度（時的蛋白質(zhì)的溶解度（g/Lg/L）S S0 0：離子強度為：離子強度為0 0時蛋白質(zhì)的溶解度（時蛋白質(zhì)的溶解度（g/Lg/L）KsKs：鹽析常數(shù)，是與：鹽析常數(shù)，是與蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)和和鹽種類鹽種類有關(guān)的特性常數(shù)。有關(guān)的特性常數(shù)。 Ks Ks代表鹽析效率代表鹽析效率 ，其含義是隨著鹽濃度的增加，其含義是隨著鹽濃度的增加，蛋白質(zhì)溶解度降低的速度，蛋白質(zhì)溶解度降低的速度，K Ks

27、 s越大鹽析效果越好。越大鹽析效果越好。 67 當(dāng)溫度一定時，當(dāng)溫度一定時，S S0 0對于某一溶質(zhì)是常數(shù)，對于某一溶質(zhì)是常數(shù)，用用表示，鹽析方程式可改寫為：表示，鹽析方程式可改寫為： log S = - Klog S = - Ks s I I 兩種鹽析法：兩種鹽析法：Ks分級鹽析法分級鹽析法 ：在一定的在一定的pH和溫度條件下，和溫度條件下，利用不同蛋白質(zhì)利用不同蛋白質(zhì)Ks的不同，通過改變離子強的不同，通過改變離子強度或鹽濃度（即改變度或鹽濃度（即改變I值）的沉淀方法。值）的沉淀方法。分級鹽析法分級鹽析法 ：在一定離子強度下，通過改在一定離子強度下，通過改變?nèi)芤旱淖內(nèi)芤旱膒H及溫度的沉淀方法

28、及溫度的沉淀方法。6869l2) 蛋白質(zhì)濃度：蛋白質(zhì)濃度：l 過稀回收沉淀困難，過濃易共沉淀，過稀回收沉淀困難，過濃易共沉淀，2.5%-3%2.5%-3%最好。最好。 l3) pH值：值：等電點處最易沉淀。等電點處最易沉淀。l4) 溫度的影響：溫度的影響：l稀鹽溶液中，溫度升高蛋白質(zhì)溶解度提高。稀鹽溶液中，溫度升高蛋白質(zhì)溶解度提高。l濃鹽溶液中，溫度升高蛋白質(zhì)溶解度下降。濃鹽溶液中，溫度升高蛋白質(zhì)溶解度下降。l 一般可在室溫下進行。某些對溫度敏感的一般可在室溫下進行。某些對溫度敏感的酶，可在酶，可在04下操作下操作。70（二）（二） 有機溶劑沉淀（降低介電常數(shù)）有機溶劑沉淀（降低介電常數(shù)）l

29、利用酶等蛋白質(zhì)在有機溶劑中的溶解度不同而利用酶等蛋白質(zhì)在有機溶劑中的溶解度不同而使之分離的方法。使之分離的方法。l1. 沉淀機理沉淀機理l 降低溶液的介電常數(shù)降低溶液的介電常數(shù)l 部分地引起蛋白質(zhì)脫水部分地引起蛋白質(zhì)脫水l2. 常用有機溶劑常用有機溶劑l 丙酮丙酮 乙醇乙醇 甲醇，用量一般為酶液體積的甲醇，用量一般為酶液體積的2 2倍倍左右，終濃度為左右，終濃度為70%70%。 71l3.優(yōu)缺點：優(yōu)缺點：l 優(yōu)點優(yōu)點：1）分辨率比鹽析法高分辨率比鹽析法高l 2） 沉淀不需脫鹽沉淀不需脫鹽l 3）溶劑易蒸發(fā)，沉淀易離心）溶劑易蒸發(fā)，沉淀易離心l缺點：缺點：1）容易引起蛋白質(zhì)變性失活）容易引起蛋白

30、質(zhì)變性失活l2)2)有機溶劑易燃、易爆，對安全要求較高。有機溶劑易燃、易爆，對安全要求較高。 l 72l4. 影響有機溶劑沉淀的因素影響有機溶劑沉淀的因素（1 1）溫度）溫度 ：低溫（低溫（0 0）操作。）操作。（2 2）pH pH 值：值：盡可能靠近其等電點。盡可能靠近其等電點。 （3 3）離子強度：）離子強度：采用采用 0.05mol/L0.05mol/L的稀鹽溶液的稀鹽溶液 增加蛋白質(zhì)在有機溶劑中的溶解度增加蛋白質(zhì)在有機溶劑中的溶解度 目的目的 防止蛋白質(zhì)變性防止蛋白質(zhì)變性 （4 4）蛋白質(zhì)濃度：）蛋白質(zhì)濃度：適當(dāng)，一般為適當(dāng)，一般為5 52020mg/ml mg/ml 73（三）（三）

31、 等電點沉淀等電點沉淀(isoelectric precipitation)(isoelectric precipitation) l1.原理原理l 蛋白質(zhì)在等電點時溶解度最低蛋白質(zhì)在等電點時溶解度最低l 不同的蛋白質(zhì)具有不同的等電點不同的蛋白質(zhì)具有不同的等電點 l2. 使用方法使用方法l 單獨單獨使用使用較少（較少（用于從粗酶液中除去某些等電用于從粗酶液中除去某些等電點相距較大的雜蛋白）點相距較大的雜蛋白），多與其它方法聯(lián)合使用，多與其它方法聯(lián)合使用（如鹽析法、有機溶劑法），因（如鹽析法、有機溶劑法），因蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)在等電點時在等電點時仍有一定的溶解度。仍有一定的溶解度。74l3. 優(yōu)點：優(yōu)

32、點：l 1）大多數(shù)蛋白質(zhì)的大多數(shù)蛋白質(zhì)的pI都在偏酸性范圍內(nèi)都在偏酸性范圍內(nèi)l 2）無機酸（如磷酸、鹽酸、硫酸）價格較低）無機酸（如磷酸、鹽酸、硫酸）價格較低l 3）無需除掉多余酸即可進行下一步純化）無需除掉多余酸即可進行下一步純化l4. 缺點：缺點：l 酸化時，容易引起蛋白質(zhì)失活酸化時，容易引起蛋白質(zhì)失活l 75（四）有機聚合物沉淀法（四）有機聚合物沉淀法 1. 作用機理：作用機理： 與有機溶劑類似與有機溶劑類似 ，是發(fā)展較快的一種新方法。，是發(fā)展較快的一種新方法。2. 沉淀劑：沉淀劑：常用常用聚乙二醇聚乙二醇 （Polyethyene glycol，簡寫，簡寫 PEGPEG ） 多用分子量

33、為多用分子量為600020000的的 PEG。3. 優(yōu)點：優(yōu)點：l操作條件溫和，不易引起生物大分子變性。操作條件溫和，不易引起生物大分子變性。l沉淀效能高，使用少量的沉淀效能高，使用少量的PEG即可沉淀相當(dāng)即可沉淀相當(dāng) l 多的生物大分子。多的生物大分子。l沉淀后有機聚合物容易去除。沉淀后有機聚合物容易去除。76l（五）選擇性變性沉淀法（五）選擇性變性沉淀法l 選擇一定的條件使溶液中存在的某些雜蛋白質(zhì)變選擇一定的條件使溶液中存在的某些雜蛋白質(zhì)變性沉淀而不影響所需蛋白質(zhì)的方法。性沉淀而不影響所需蛋白質(zhì)的方法。 l 熱變性熱變性l 幾乎所有的蛋白質(zhì)都因加熱變性而凝固，幾乎所有的蛋白質(zhì)都因加熱變性而

34、凝固，加熱升加熱升高溫度使雜蛋白變性沉淀而保留目的物在溶液中。高溫度使雜蛋白變性沉淀而保留目的物在溶液中。l pH變性變性l 等電點沉淀法是等電點沉淀法是pH變性法中的一種變體。變性法中的一種變體。l 有機溶劑變性有機溶劑變性l 使那些對有機溶劑敏感的雜蛋白變性沉淀。使那些對有機溶劑敏感的雜蛋白變性沉淀。77六、萃?。⑤腿。╡xtraction）分離）分離 利用溶質(zhì)在互不相溶的兩相之間分利用溶質(zhì)在互不相溶的兩相之間分配系數(shù)的不同而使溶質(zhì)得到純化或濃縮配系數(shù)的不同而使溶質(zhì)得到純化或濃縮的方法。的方法。l特點：特點：l1）比化學(xué)沉淀法分離程度高）比化學(xué)沉淀法分離程度高l2）比離子交換法選擇性好

35、、傳質(zhì)快）比離子交換法選擇性好、傳質(zhì)快l3）比蒸餾法能耗低）比蒸餾法能耗低 78（一）溶劑萃取法（一）溶劑萃取法 明確幾個概念：明確幾個概念：料液：料液：供提取的溶液。供提取的溶液。 溶質(zhì)：溶質(zhì)：料液中欲提取的物質(zhì)料液中欲提取的物質(zhì) 。萃取劑萃取劑 ：用來進行萃取的溶劑，通常是有機溶劑用來進行萃取的溶劑，通常是有機溶劑 。萃取液萃取液 ：經(jīng)接觸分離后，溶質(zhì)轉(zhuǎn)移到萃取劑中與經(jīng)接觸分離后，溶質(zhì)轉(zhuǎn)移到萃取劑中與 萃取劑形成的溶液萃取劑形成的溶液 。萃余液：萃余液：被萃取出溶質(zhì)后的料液被萃取出溶質(zhì)后的料液 。反萃?。ǚ摧腿。╞ack extractionback extraction）：）：完成萃取操

36、作后，完成萃取操作后， 將產(chǎn)物從有機相轉(zhuǎn)入水相的萃取操作。將產(chǎn)物從有機相轉(zhuǎn)入水相的萃取操作。 79l溶劑萃取法是以分配定律（即溶質(zhì)的分配平溶劑萃取法是以分配定律（即溶質(zhì)的分配平衡規(guī)律衡規(guī)律 ）為基礎(chǔ)。）為基礎(chǔ)。l 在一定溫度、壓力下，溶質(zhì)分布在兩個在一定溫度、壓力下，溶質(zhì)分布在兩個互不相溶的溶劑里，達到平衡后，溶質(zhì)在兩互不相溶的溶劑里，達到平衡后，溶質(zhì)在兩相中的濃度比為一常數(shù)。相中的濃度比為一常數(shù)。l 萃取相濃度萃取相濃度 C1l分配系數(shù)分配系數(shù) K K0 0 = = l 萃余相濃度萃余相濃度 C2l K K0 0值隨溶液值隨溶液pHpH的變化甚大，這是用萃取的變化甚大，這是用萃取法實現(xiàn)溶質(zhì)提

37、取的重要基礎(chǔ)。法實現(xiàn)溶質(zhì)提取的重要基礎(chǔ)。80l 普通有機溶劑萃取難以進行蛋白質(zhì)的分離，普通有機溶劑萃取難以進行蛋白質(zhì)的分離， l 因為因為:l1） 蛋白質(zhì)親水性，不溶于有機溶劑蛋白質(zhì)親水性，不溶于有機溶劑l2） 蛋白質(zhì)在有機相中易變性失活蛋白質(zhì)在有機相中易變性失活 故溶劑萃取法一般僅用于抗生素等小故溶劑萃取法一般僅用于抗生素等小分子生物物質(zhì)的提取。分子生物物質(zhì)的提取。 81萃取操作的萃取操作的3 3個步驟：個步驟： 1）混合）混合 2）分離）分離 3）溶劑回收）溶劑回收82（二）（二） 雙水相萃取技術(shù)雙水相萃取技術(shù)l 又稱水溶液兩相分配技術(shù)又稱水溶液兩相分配技術(shù)l（partion of two

38、 aqueous phase systempartion of two aqueous phase system） l 用兩種不相溶的親水性高分子聚用兩種不相溶的親水性高分子聚合物水溶液，如聚乙二醇（合物水溶液，如聚乙二醇（PEGPEG）和葡）和葡聚糖（聚糖（DextranDextran）進行萃取。由于形成）進行萃取。由于形成的兩相均有很高的含水量（達的兩相均有很高的含水量（達70%70%90%90%），故稱），故稱“雙水相雙水相”系統(tǒng)。系統(tǒng)。 83l優(yōu)點：優(yōu)點：l1 1）每一水相中均有很高的含水量，為每一水相中均有很高的含水量，為 l酶等生物物質(zhì)提供了一個良好的環(huán)境；酶等生物物質(zhì)提供了一個良

39、好的環(huán)境；l2 2）PEGPEG、DextranDextran和無機鹽對酶等無毒和無機鹽對酶等無毒l害作用，不會引起變性。害作用，不會引起變性。 84 雙水相的形成：雙水相的形成： 兩種不同水溶性聚合物濃度達到兩種不同水溶性聚合物濃度達到一定值時，體系會自然地分成互不相一定值時，體系會自然地分成互不相容的兩相，構(gòu)成雙水相體系。容的兩相，構(gòu)成雙水相體系。 8586l 幾種典型的雙水相系統(tǒng)幾種典型的雙水相系統(tǒng)l聚丙二醇聚丙二醇 聚乙二醇、聚乙烯醇聚乙二醇、聚乙烯醇l 葡聚糖（葡聚糖（Dex）l 羥丙基葡聚糖羥丙基葡聚糖l聚乙二醇（聚乙二醇（ PEG） 葡聚糖（葡聚糖（Dex）l硫酸葡聚糖鈉鹽硫酸葡

40、聚糖鈉鹽 聚丙烯乙二醇聚丙烯乙二醇l羧基甲基葡聚糖鈉鹽羧基甲基葡聚糖鈉鹽 甲基纖維素甲基纖維素l聚乙二醇（聚乙二醇（ PEG） 磷酸鉀、磷酸鉀、硫酸銨硫酸銨l 硫酸鈉、硫酸鎂硫酸鈉、硫酸鎂872. 萃取原理：萃取原理： 利用生物物質(zhì)在雙水相體系中的利用生物物質(zhì)在雙水相體系中的選擇性分配。選擇性分配。88l3. 應(yīng)用應(yīng)用l 胞內(nèi)酶的提取和精制胞內(nèi)酶的提取和精制: l 除去細(xì)胞碎片，并使酶得到純化。除去細(xì)胞碎片，并使酶得到純化。l 89l 幾種典型的雙水相萃取酶蛋白實例幾種典型的雙水相萃取酶蛋白實例 酶酶 菌菌 種種 相系統(tǒng)相系統(tǒng)l延胡索酸酶延胡索酸酶 Brevibacterium sp. PEG

41、/ 鹽鹽l天冬氨酸酶天冬氨酸酶 E. coli PEG/ 鹽鹽l -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 E. coli PEG/ 鹽鹽l亮氨酸脫氫酶亮氨酸脫氫酶 Bacillus sp. PEG/Dexl乙醇脫氫酶乙醇脫氫酶 Bakers yeast PEG/ 鹽鹽l青霉素?；盖嗝顾仵；?E. coli PEG/ 鹽鹽90 雙水相萃取法的重要研究方向雙水相萃取法的重要研究方向 親和萃?。ㄓH和分配親和萃?。ㄓH和分配 ） 使用具有生物特異性的配基（使用具有生物特異性的配基（ligandligand）來提高分離選擇性。來提高分離選擇性。 91親和萃取酶實例親和萃取酶實例蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)配基配基胰蛋白酶胰蛋白酶胰蛋

42、白酶抑制劑胰蛋白酶抑制劑磷酸果糖激酶磷酸果糖激酶三嗪染料三嗪染料甲酸脫氫酶甲酸脫氫酶三嗪染料三嗪染料葡糖葡糖-6-6-磷酸脫氫酶磷酸脫氫酶三嗪染料三嗪染料92l（三）（三） 超臨界流體萃取超臨界流體萃取l 兼有蒸餾和溶液萃取的特征，兼有蒸餾和溶液萃取的特征，與常與常規(guī)溶劑萃取的區(qū)別：將超臨界流體作為規(guī)溶劑萃取的區(qū)別：將超臨界流體作為萃取劑。萃取劑。 l 超臨界流體超臨界流體(supercritical fluid(supercritical fluid，SCFSCF）：超過氣液共存時的最高壓力和：超過氣液共存時的最高壓力和最高溫度下物質(zhì)特有的點最高溫度下物質(zhì)特有的點臨界點后臨界點后的流體的流體

43、。93（四）（四） 反膠團萃取反膠團萃取l1. 反膠團：反膠團：又稱反膠束（又稱反膠束（Reversed Micelles）l 指指表面活性劑表面活性劑（由親水的極性基團和疏水的非極由親水的極性基團和疏水的非極性基團兩部分組成）分散在連續(xù)性基團兩部分組成）分散在連續(xù)有機有機 溶劑溶劑中自發(fā)形成中自發(fā)形成的一種穩(wěn)定的納米級的聚集體的一種穩(wěn)定的納米級的聚集體。 反膠團模型反膠團模型親水基團向內(nèi)聚集親水基團向內(nèi)聚集9495 2. 萃取過程萃取過程第一步：第一步：將酶從水相中萃取到反膠束相中。將酶從水相中萃取到反膠束相中。第二步：第二步：將酶蛋白從反膠束轉(zhuǎn)移到第二種水相將酶蛋白從反膠束轉(zhuǎn)移到第二種水相

44、 中，實現(xiàn)對蛋白質(zhì)的反萃取過程。中，實現(xiàn)對蛋白質(zhì)的反萃取過程。96 反膠團萃取原理反膠團萃取原理 97 3. 表面活性劑及有機溶劑表面活性劑及有機溶劑l 反膠團萃取與溶劑萃取的不同，是反膠團萃取與溶劑萃取的不同，是在有機溶劑中加入了少量表面活性劑。在有機溶劑中加入了少量表面活性劑。98l（1）表面活性劑）表面活性劑l 常用：常用： AOT(Aerosol OT)（陰離子表面活（陰離子表面活性劑，琥珀酸性劑，琥珀酸2-乙基己基酯磺酸鈉）。乙基己基酯磺酸鈉）。l特點：特點：易獲得，強度好；極性基團小，形成的易獲得，強度好；極性基團小，形成的反膠團空間較大，有利于蛋白質(zhì)等生物大分子反膠團空間較大，有

45、利于蛋白質(zhì)等生物大分子進入。進入。 l（2） 非極性有機溶劑非極性有機溶劑 環(huán)己烷、庚烷、辛烷、異辛烷、己醇、硅油。環(huán)己烷、庚烷、辛烷、異辛烷、己醇、硅油。 99l4. 優(yōu)點優(yōu)點l1）萃取率和反萃取率高。）萃取率和反萃取率高。l2）分離濃縮同時進行，溶劑可反復(fù)利用。）分離濃縮同時進行，溶劑可反復(fù)利用。l3 3）解決胞內(nèi)酶在非細(xì)胞環(huán)境中迅速失活問題。解決胞內(nèi)酶在非細(xì)胞環(huán)境中迅速失活問題。l4）破壁功能，直接從完整細(xì)胞提取酶蛋白。）破壁功能，直接從完整細(xì)胞提取酶蛋白。l5）成本低。）成本低。100離心離心沉沉淀淀粗純化粗純化精純化（制）精純化（制）上上清清分離分離101第二節(jié) 酶的精制（精純化）l

46、純化原理（掌握）l基本原則（掌握）l純化技術(shù)（掌握原理、選擇依據(jù)）102u純化方法依據(jù)原理： 溶解度、特異性吸附、電荷、分子大小u酶純化的基本原則：建立一個方便靈敏的分析方法(純度、收率)；選擇有效的純化方法，盡可能減少純化步驟；選擇適宜溫度，保持酶活性以避免酶的變性；抗氧化失活（DTT, BME, EDTA, etc） ；其他添加劑，防止酶失活。第二節(jié) 酶的精制（精純化）103u 酶精純化常用技術(shù)l膜分離技術(shù)l柱層析技術(shù)l蛋白質(zhì)結(jié)晶透析超濾凝膠過濾（分子篩/排阻）層析離子交換層析疏水層析吸附層析親和層析反相層析104一、膜分離一、膜分離 借助一定孔徑的高分子薄膜，將借助一定孔徑的高分子薄膜，

47、將不同大小、形狀、性質(zhì)的顆?；蚍肿硬煌笮　⑿螤?、性質(zhì)的顆?；蚍肿舆M行分離的技術(shù)。進行分離的技術(shù)。105膜分離技術(shù)的分類擴散膜分離擴散膜分離106（一）擴散膜分離（一）擴散膜分離 透析透析（dialysis）溶質(zhì)分子溶質(zhì)分子Y 從高濃度一側(cè)通過膜向低濃度一側(cè)移動從高濃度一側(cè)通過膜向低濃度一側(cè)移動107 1. 透析膜透析膜1 1）特點：）特點：多孔薄膜，允許小分子通過，阻止大分子通過；多孔薄膜，允許小分子通過，阻止大分子通過；化學(xué)惰性，多種溶液中不溶解；（化學(xué)惰性，多種溶液中不溶解；（材料：纖維素材料：纖維素衍生物衍生物）一定的機械強度；一定的機械強度；2）透析膜規(guī)格選擇（表）透析膜規(guī)格選擇（表

48、4.11-4.12）1082）透析膜的預(yù)處理：目的：除雜質(zhì)。 3）透析袋的保存 ：防腐劑冷藏。109蛋白質(zhì)透析蛋白質(zhì)透析1102. 透析方法及裝置透析方法及裝置 透析袋透析簡單裝置。透析袋透析簡單裝置。A:A:透析夾，透析夾，B:B:透析，透析，C:C:透析示意圖透析示意圖 1113. 透析速度影響因素透析速度影響因素P164v濃度梯度v分子大小和形狀v溫 度v膜表面積v膜厚度112（二） 超濾 依據(jù)被分離物質(zhì)分子大小、形狀和性質(zhì)的不同，在外力作用下形成一定壓力差，使溶液中物質(zhì)在超濾膜表面發(fā)生分離，從而達到分離、提純和濃縮產(chǎn)品的目的。1131. 超濾膜特點l非對稱雙膜結(jié)構(gòu)，包括分離層和支撐層。

49、l超濾膜性能指標(biāo)包括滲透通量和截留率。1142. 超濾裝置實驗室裝置115根據(jù)所截留物質(zhì)顆粒大小的不同，分為根據(jù)所截留物質(zhì)顆粒大小的不同，分為：116微濾微濾( (MicrofiltrationMicrofiltration，MF)MF) 一種靜態(tài)過濾，隨過一種靜態(tài)過濾，隨過濾時間延長，膜面上截流濾時間延長，膜面上截流沉積不溶物，引起水流阻沉積不溶物，引起水流阻力增大，透水速率下降，力增大，透水速率下降，直至微孔全被堵塞；直至微孔全被堵塞；無 流 動 操 作滲 透 液原 料 液117常規(guī)過濾常規(guī)過濾(A)(A)和超濾和超濾(B)(B)的示意圖的示意圖 A AB1181192. 超濾裝置工業(yè)裝置

50、l中空纖維系統(tǒng)120l超濾膜包裝置2. 超濾裝置工業(yè)裝置1213. 超濾膜的選擇及使用l截留分子量l流速l材質(zhì)l膜完整性l清洗與保存4. 影響流速的因素u溶質(zhì)分子性質(zhì)u溶質(zhì)濃度u壓 力u攪 拌u溫 度u其 他122色譜起源色譜起源色譜色譜組分組分色素色素石油醚石油醚碳酸鈣顆粒碳酸鈣顆粒 用色彩（用色彩（chromachroma）和圖譜（）和圖譜（graphsgraphs）組）組成色譜一詞（成色譜一詞（Chromatography) Chromatography) 。123Column Chromatography124 層析柱的制備與層析操作層析柱的制備與層析操作 柱層析的設(shè)備柱層析的設(shè)備:

51、層析柱、蠕動泵（恒流泵）、檢測儀、層析柱、蠕動泵（恒流泵）、檢測儀、部分收集器、梯度洗脫器。部分收集器、梯度洗脫器。125l層析裝置：層析裝置：l 梯度混和器梯度混和器l 蠕動泵蠕動泵l 層析柱層析柱l 監(jiān)測儀監(jiān)測儀l 記錄儀記錄儀l 收集器收集器 126127128129現(xiàn)代化層析設(shè)備AKTA層析柱XKBPG130現(xiàn)代化層析設(shè)備AKTA131記錄系統(tǒng)132良好的線性放大133134（1）. 基本原理基本原理 大分子物質(zhì)不能進入凝膠孔內(nèi)，在凝膠顆粒之間大分子物質(zhì)不能進入凝膠孔內(nèi)，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動，并最先被洗脫出來；的空隙向下移動，并最先被洗脫出來； 小分子物質(zhì)可自由出入凝膠孔，流程

52、長而后流出小分子物質(zhì)可自由出入凝膠孔，流程長而后流出層析柱。層析柱。135136137Size-exclusion chromatography138凝膠對溶質(zhì)的排阻程度可用分配系數(shù)凝膠對溶質(zhì)的排阻程度可用分配系數(shù)KdKd表示：表示： Ve-Vo Kd= ViVo外水體積外水體積，層析柱內(nèi)凝膠顆粒之間空隙，層析柱內(nèi)凝膠顆粒之間空隙的體積（的體積（ml）Vi內(nèi)水體積內(nèi)水體積，層析柱內(nèi)凝膠顆粒內(nèi)部各微，層析柱內(nèi)凝膠顆粒內(nèi)部各微孔體積的總和（孔體積的總和（ml）Ve某組分的洗脫體積某組分的洗脫體積，從加進層析柱到流，從加進層析柱到流出液中該組分出現(xiàn)高峰時的洗脫液體積（出液中該組分出現(xiàn)高峰時的洗脫液體

53、積（ml）139凝膠過濾柱色譜洗脫的三種峰凝膠過濾柱色譜洗脫的三種峰. K. Kd d=0=0時時, ,即即Ve=Vo,Ve=Vo,說明該組分分子量足夠大，不進入微孔，最說明該組分分子量足夠大，不進入微孔，最先流出。先流出。. K. Kd d=1=1時時, ,即即Ve=Vo+ViVe=Vo+Vi，說明該組分能進入凝膠的全部內(nèi)空隙，說明該組分能進入凝膠的全部內(nèi)空隙，最后流出。最后流出。. . 其它組分其它組分0K0Kd d1,1,因分子大小而改變洗脫峰的位置。因分子大小而改變洗脫峰的位置。KdKd小的先小的先流出，流出，KdKd大的后流出。大的后流出。140 分配系數(shù)分配系數(shù)Kd的意義：的意義：

54、1) 可定量地衡量各組分的流出順序?？啥康睾饬扛鹘M分的流出順序。2) 判斷分離效果，判斷分離效果，Kd差異大，分離效果好，差異大，分離效果好， Kd差異小，分離效果差。差異小，分離效果差。141（2 2）. .凝膠的種類和性質(zhì)凝膠的種類和性質(zhì) 1)1)交聯(lián)葡聚糖凝膠（交聯(lián)葡聚糖凝膠（dextran gel)dextran gel) 商品名商品名:Sephadex:Sephadex 型號型號 Sephadex GSephadex G1010至至G-200 G-200 G G 后的數(shù)字為凝膠吸水值的后的數(shù)字為凝膠吸水值的1010倍。倍。數(shù)字越大，交聯(lián)度越小，孔徑越大，分?jǐn)?shù)字越大，交聯(lián)度越小，孔徑

55、越大，分離范圍越廣。離范圍越廣。142 葡聚糖凝膠層析介質(zhì)的有關(guān)參數(shù)葡聚糖凝膠層析介質(zhì)的有關(guān)參數(shù) 1432 2）瓊脂糖凝膠（）瓊脂糖凝膠（agarose gel)agarose gel) 商品名商品名:Sepharose :Sepharose （瑞典）（瑞典）; ; Bio-Gel A ( Bio-Gel A (美國）美國） 依靠糖鏈之間的次級鍵維持網(wǎng)狀依靠糖鏈之間的次級鍵維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，瓊脂糖密度越大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越結(jié)構(gòu)，瓊脂糖密度越大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越密集。密集。1443 3）聚丙烯酰胺凝膠）聚丙烯酰胺凝膠 （polyacrylamide gelpolyacrylamide gel） 商品名為商品名為

56、Bio-Gel,Bio-Gel,型號從型號從 Bio-Gel P Bio-Gel P2 2至至P-300P-300，P P值越大，孔徑也越大。值越大，孔徑也越大。 以丙烯酰胺為單體，以甲叉雙丙烯酰以丙烯酰胺為單體，以甲叉雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑聚合成的高分子聚合物。胺為交聯(lián)劑聚合成的高分子聚合物。145146（3） 操作：操作：1）凝膠的選擇和處理）凝膠的選擇和處理 根據(jù)相對分子質(zhì)量范圍選擇相應(yīng)型號的根據(jù)相對分子質(zhì)量范圍選擇相應(yīng)型號的凝膠介質(zhì)。凝膠介質(zhì)。 將干膠懸浮于將干膠懸浮于510倍的倍的蒸餾水中蒸餾水中 ，充分，充分溶脹，抽氣，裝柱。溶脹，抽氣，裝柱。2）柱的選擇）柱的選擇 采用采用L/D比值

57、高的柱子，可提高分辨率，比值高的柱子，可提高分辨率，但影響流速但影響流速。147l3）加樣）加樣l 體積不能過多，不超過床體積的體積不能過多，不超過床體積的5，脫鹽時，脫鹽時可在可在10左右。左右。l4）洗脫）洗脫l 洗脫液與平衡時用的洗脫液與平衡時用的buffer一致。一致。l 洗速不可過快，保持恒速。洗速不可過快，保持恒速。l5）膠的保存）膠的保存l 洗脫完畢后，凝膠柱已恢復(fù)到上柱前的狀態(tài)，洗脫完畢后，凝膠柱已恢復(fù)到上柱前的狀態(tài)，不必再生處理。不必再生處理。l 用用0.02%NaN3防腐。防腐。1481494. 應(yīng)用應(yīng)用 1）脫鹽）脫鹽) 生物大分子物質(zhì)的生物大分子物質(zhì)的分離純化分離純化

58、3）分子量的測定）分子量的測定 4）溶液濃縮）溶液濃縮 150（二）離子交換層析（二）離子交換層析 （ion exchange chromatography，IEC）1512.離子交換劑離子交換劑： 離子交換劑由載體、電荷基團和反離子構(gòu)成。離子交換劑由載體、電荷基團和反離子構(gòu)成。 纖維素纖維素 瓊脂糖瓊脂糖 葡聚糖葡聚糖 載體載體 電荷基團電荷基團 O OCHCH2 2COOCOO- -NaNa+ +反離子反離子1.原理:根據(jù)待分離物質(zhì)帶電性質(zhì)不同的分離 純化方法。152離子交換劑離子交換劑-帶有電荷基團的帶有電荷基團的不溶性不溶性載體載體-O-CH2CH2N-HCH2CH3CH2CH3Cl-

59、載體載體Diethylaminoethyl(DEAE) 陰離子交換劑陰離子交換劑(可吸附可吸附帶負(fù)電的蛋白質(zhì)帶負(fù)電的蛋白質(zhì)) 陽離子交換劑陽離子交換劑(可吸附可吸附帶正電的蛋白質(zhì)帶正電的蛋白質(zhì))153l陰離子交換劑：陰離子交換劑：l常用二乙氨基乙基，二乙氨基乙基常用二乙氨基乙基，二乙氨基乙基2-羥丙基羥丙基l陽離子交換劑：陽離子交換劑：l常用羧甲基常用羧甲基 CM CH2COO l磺丙基磺丙基 SP C3H6SO3DEAE C2H4N+(C2H5)2HQAE C2H4N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH3154 化學(xué)原料合成化學(xué)原料合成 ：樹脂類物質(zhì)：樹脂類物質(zhì) 載體載體 天然材料制成：天

60、然材料制成： cellulose cellulose sephadex sepharose 陽離子交換劑陽離子交換劑: 電荷基團（）電荷基團（）, 反離子（）反離子（）電荷基團電荷基團 陰離子交換劑陰離子交換劑: 電荷基團（）電荷基團（）, 反離子（）反離子（） 如：如：DEAE-Sepharose， CM-Sepharose155l以以Sephadex G-25, G-50為骨架，接入離子為骨架，接入離子交換基團。交換基團。l DEAE（QAE） Sephadex A-25，A-50 CM（SP） Sephadex C-25，C-50 A：anion 陰離子陰離子 C: cation 陽離子