一種新型_a類細(xì)菌素的克隆表達(dá)和活性鑒定

1、生物 工程 學(xué)報 journals.im.ac cjbim.ac Chin J Biotech 2011, July 25; 27(7): 976982Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061©2011 CJB, All rights reserved. 基因工程 IIa 類細(xì)菌素的克隆表達(dá)和活性鑒定一種新型謝燕，陳海琴，張秋香，田豐偉，陳永泉，張灝，陳衛(wèi)江南大學(xué)食品學(xué)院，無錫 214122摘 要: NB-C1 為一種潛在的 IIa 類細(xì)菌素基因，為實現(xiàn)其在大腸桿菌中的高效可溶表達(dá)，首先構(gòu)建了 NB-C1 蛋白與綠色熒光蛋白 (G

2、FP) 的融合表達(dá)載體 pIVEX 2.4d-GFP-NB-C1 ，然后將構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21(DE3) pLysS，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后，重組蛋白 GFP-NB-C1 以可溶的形式存在于細(xì)胞內(nèi)。經(jīng) Ni-NTA 親和層析柱分離純化后，重組 融合蛋白的純度大于 95，產(chǎn)量達(dá) 36.1 mg/L。抑菌試驗表明，純化后的重組蛋白對單核細(xì)胞增生李斯特氏菌具有明顯 的抑制作用。關(guān)鍵 詞 : IIa 類細(xì)菌素，融合表達(dá)，蛋白質(zhì)純化，活性鑒定Expression and characterization of a new class IIa bacteriocinYan Xie, Haiqin C

3、hen, Qiuxiang Zhang, Fengwei Tian, Yongquan Chen, Hao Zhang, and Wei ChenSchool of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, ChinaAbstract: NB-C1 gene is a potential class IIa bacteriocin gene. To obtain its soluble expression, NB-C1 was fused with thegreen fluorescent protein (

4、GFP) gene and a recombinant expression vector pIVEX 2.4d-GFP-NB-C1 was constructed, which was transformed into Escherichia coli BL21(DE3) pLysS. The expressed fusion protein GFP-NB-C1 was purified by Ni-NTA affinity chromatography and the bioactivity was examined using Listeria monocytogenes as the

5、indicator bacteria. The results showed that the expressed fusion protein GFP-NB-C1 was soluble and the final concentration of the purified fusion protein was 36.1 mg/L E. coli culture and had the purity above 95%. The antimicrobial assay of GFP-NB-C1 was analyzed and showedits high activity against

6、Listeria monocytogenes.Keywords: class IIa bacteriocin, fusion expression, protein purification, activity identification生的細(xì)菌素具自身免疫性1 。很多微生物均可產(chǎn) 生細(xì)菌素，其中乳酸菌細(xì)菌素研究得最為深入。IIa 類 細(xì)菌素是乳酸菌細(xì)菌素的一個亞類，為抗李斯特氏細(xì)菌 素 (Bacteriocin) 是 某 些 細(xì)菌產(chǎn)生的 具有 抗菌活性的多肽、蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合物，一般只 對親緣關(guān)系較近的細(xì)菌有毒害作用。產(chǎn)生菌對其產(chǎn)Received: September 6, 2010;

7、Accepted: January 26, 2011Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 20706023, 20836003).Corresponding author: Wei Chen. Tel/Fax: +86-510-85912155; E-mail: 國家自然科學(xué)基金 (Nos. 20706023, 20836003) 資助。菌的多肽。近年來世界范圍內(nèi)發(fā)生多起由單核細(xì)胞增生李斯特氏菌引起的中毒事件，具有很大的危害 性，預(yù)防和控制食品中的李斯特氏菌則成為

8、了人們 關(guān)注的熱點，而 IIa 類細(xì)菌素對李斯特氏菌具有特異 的抗菌活性，并且還具有安全性、酶穩(wěn)定性、熱穩(wěn) 定性、免疫性等優(yōu)點 2，因此在食品領(lǐng)域具有很 好 的應(yīng)用前景。但目前僅有幾個細(xì)菌素在食品和生物 藥物領(lǐng)域中得到應(yīng)用，因此從乳酸菌天然資源中挖 掘更多高效的細(xì)菌素已成為研究熱點。采用傳統(tǒng)的菌種篩選法尋找新的細(xì)菌素，存在 乳酸菌出發(fā)菌株細(xì)菌素產(chǎn)量低，分離純化困難等問 題3 。我國有豐富的乳酸菌資源，隨著乳酸菌基 因 組序列報道的日趨增多，利用基因搜索工具尋找新 的細(xì)菌素已成為一條快速有效的途徑。根據(jù)細(xì)菌素 氨基酸的保守序列及其結(jié)構(gòu)基因上下游的特征編碼 基因，如調(diào)節(jié)基因、轉(zhuǎn)運基因、免疫基因等的

9、特征， 利用生物信息學(xué)工具設(shè)計 IIa 類細(xì)菌素基因的搜索 比對腳本，在已測序乳酸菌基因組數(shù)據(jù)庫中搜索潛 在的 IIa 類細(xì)菌素基因，然后通過比對分析，排除錯 誤基因和已報道的乳酸菌細(xì)菌素基因，從而確定新的細(xì)菌素基因。目前已從乳酸菌基因組中鑒定出多種細(xì)菌素基因4-6。Diep 等7從一株戊糖片球菌中得 到一條新的類片球菌素基因，在沙克乳桿菌中表達(dá) 并獲得較高的產(chǎn)量和活性。國外已有關(guān)于細(xì)菌素異 源表 達(dá)的研究 8-10 ， 其重組表 達(dá)宿主以大 腸桿菌居 多，其中不乏理想的研究成果11-14。利用基因搜索 工具篩選細(xì)菌素基因并結(jié)合基因工程重組表達(dá)，定 能加強(qiáng)新型高效乳酸菌細(xì)菌素的開發(fā)和應(yīng)用，這對

10、 食品安全和保藏具有重要意義。IIa 類細(xì)菌素通常含有 3748 個氨基酸殘基，并 且擁有相似的序列，如表 1 所示，N 端具有共同的 YGNGVXaaC 保守序列 (Xaa 為出現(xiàn)頻率高的 殘 基)，保守區(qū)含有 2 個半胱氨酸殘基，可形成 1 個二 硫鍵，研究表明此二硫鍵對抑制李斯特氏菌是必需 的15；序列的 C 端只有 3480.5的相似性。本 研究中的 NB-C1 基因通過生物信息學(xué)方法從乳酸菌 基因組數(shù)據(jù)庫中篩選得到，與 IIa 類乳酸菌細(xì)菌素同 源性較高，人工合成其成熟肽的全基因序列，并命 名為 NB-C1 (GenBank Accession No. HQ 015716)。 NB-

11、C1 的成熟肽序列含有 42 個氨基酸殘基，序列為表 1a 類乳酸菌細(xì)菌素的氨基酸序列分析2Table 1 Sequence alignment of class a bacteriocins2978ISSN1000-3061 CN11-1998/QChin J BiotechJuly 25, 2011 Vol.27 No.7KYYGNGVHCGKKTCYVDWGQATASIGKIIVNGWTQHGPWAHR。其 N 端保守區(qū)序列為 YGNGVHC， 且 N 端含有 2 個半胱氨酸，可形成 1 個二硫鍵，C 端序列則與已知的 IIa 類細(xì)菌素同源性較差。根據(jù) NB-C1 氨基酸組成的特點，可推

12、斷其很可能為一種 潛在的新型 IIa 類細(xì)菌素基因。在抗菌肽重組表達(dá) 研 究中，為避免其對宿主的毒性作用，多采用融合 表達(dá)方式11-14,16-17。我們曾將 NB-C1 基因進(jìn)行直接 表達(dá)，但未能檢測到目的蛋白及其活性，推測該細(xì) 菌素對宿主可能具有一定的毒性作用，另外目的蛋 白為約 5 kDa 的小肽，易被內(nèi)源蛋白酶降解18-19， 穩(wěn)定性較差，故本文嘗試融合表達(dá)。本文以綠色 熒 光蛋白 (GFP) 作 為融合載體蛋白 ，在大腸桿 菌中 進(jìn) 行 融 合 表 達(dá) 并 獲 得 足 夠 的 活 性 重 組 蛋 白 GFP-NB-C1。這為 NB-C1 生物學(xué)性質(zhì)的進(jìn)一步研 究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，以及為

13、新型 IIa 類細(xì)菌素的發(fā) 掘和研究提供了一種新的路徑和方法。司；PCR 儀購自 Gene Technologies ；電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)購自 BIO-RAD 公司；引物由上 海 博 尚 公司合 成； DNA 測 序 由 北京華 大基 因有限 公司完成。1.3 方法常規(guī)分子生物學(xué)操作參 照分子克隆手冊 20 進(jìn)行。 1.3.1 NB-C1 的全基因合成根據(jù) NB-C1 基因序列設(shè)計寡核苷酸鏈，合成多 條具有互補(bǔ)序列的引物 (表 2)，然后通過重疊延伸 PCR 技 術(shù) 反 應(yīng) 合 成 其 全 基 因 序 列 (GenBank Accession No. HQ 015716)。將 NB-C1 的

14、成熟片段與 pGM-T 載體連接，構(gòu)建克隆載體 pGMT-NB-C1。表 2NB-C1 全基因合成的寡核苷酸片段引物Table 2Primers of NB-C1 oligonucleotides for gene synthesisPrimer namePrimer sequence (53)GTACTCGAGTCATTATCTATGTGCCCAAGG CCCGTGTTGTGTCCATCCGTTCACTATAATTTTTCCAATG CTAGCTGTAGCTTGTCCCCAGTCCACATAGCAAGTCTTTTTACCACAATG CACTCCGTTACCGTAATACTTTCCTCCTA

15、CGACATTTTTTAGTTCCTTAT CGTTTAGTACTTTAATTTCAATTTGCGGCCGCATGACTGAAATTAAAGTA CTAAACGATAAGGAACTAAAAAATGTCGTAGGAGGAAAGTAT TACGGTAACGGAGTGCATTGTGGTAAAAAGACTTGCTATGTGGACTGGGG ACAAGCTACAGCTAGCATTGGAAAAATTATAGTGAACGGATGGACACAAC ACGGGCCTTGGGCACATAGANB-C1-S11材料與方法1.1菌株和質(zhì)粒T 載體 pGM-T 購自天根生化有限科技 (北京)公司；表達(dá)載體 pIVEX

16、2.4d 購自 Roche 公司；質(zhì)粒 pEGFP-C1 由本實驗室提供；表達(dá)菌株 Escherichia coli BL21(DE3) pLysS 購自 Stratagene 公司；抑菌試 驗 的 指 示菌單 核細(xì) 胞增生 李斯 特氏菌 Listeria monocytogenes，由江南大學(xué)食品學(xué)院姚衛(wèi)蓉實驗室 提供。1.2主要試劑和儀器DNA 聚合酶和 T4 DNA 連接酶購自寶生物工程 (大連) ；限制性內(nèi)切酶購自 NEB 公司； GeneRuler DNA Leader Mix Maker 購自 Fermentas 公 司；低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白 Marker 購自國藥集團(tuán)化學(xué)試 劑；三

17、(羥甲基) 氨基甲烷 (Tris)、N-三 (羥甲基) 甲基甘氨酸 (Tricine)、質(zhì)粒抽提試劑盒、 氨芐青霉素以及氯霉素均購自上海生工生物工程有 限公司；膠回收試劑盒購自北京索來寶科技有限公NB-C1-S2NB-C1-S3NB-C1-S4NB-C1-A1NB-C1-A2NB-C1-A3NB-C1-A41.3.2融合表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù) pIVEX 2.4d 質(zhì)粒多克隆區(qū)的酶切位點進(jìn)行引物設(shè)計，GFP 和 NB-C1 的融合順序為 GFP-NB-C1，其 N 端為質(zhì)粒自帶的 6×His 標(biāo)簽編碼序列。以測序正確的 pGMT-NB-C1 為模板，利用表 3 中引物 P1 和 P2 進(jìn)

18、行 PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物回收、純化后 進(jìn)行 Nco/Xma雙酶切，酶切產(chǎn)物連接至經(jīng)同樣Journals.im.ac 表 3NB-C1 基因 PCR 擴(kuò)增引物列表Table 3 PCR primers of NB-C1收集，樣品進(jìn)行 SDS-PAGE 檢測和 Bradford 法測定蛋白質(zhì)濃度。1.3.5 融合蛋白 GFP-NB-C1 的抑菌活性測定采用固體平板擴(kuò)散法測定融合蛋白 GFP-NB-C1 對單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的抑菌活性。向培養(yǎng)皿 中倒入約 15 mL 含有 1.5瓊脂的 FB (Fraser Broth Base) 培養(yǎng)基 (加有 1 50 mg/mL 檸檬酸鐵銨溶 液)，將在 F

19、B 液體培養(yǎng)基生長至對數(shù)中期的敏感菌 按 1轉(zhuǎn)接至 5 mL 0.5瓊脂溶液中，迅速混勻，均 勻鋪在已凝固的平板培養(yǎng)基上，制備雙層固體培養(yǎng) 基，待凝固后小心放置 5 個牛津杯，然后分別加入100 L PBS (pH 8.0) (陰性對照)，以及不同濃度的 GFP-NB-C1 (40、 60、 80、 100 mg/L) 純 化樣品。 培 養(yǎng)皿于 4 放置 6 h 后轉(zhuǎn)移至 37 培養(yǎng)箱，培養(yǎng)12 h 后觀察抑菌圈情況。Primer namePrimer sequence (53)P1CATGCCATGGTAAAGTATTACGGTAACP2TCCCCCGGGTTATCTATGTGCCCAAP3

20、ATAAGAATGCGGCCGCGTGAGCAAGGGCGAGP4CATGCCATGGCCATCTTGTACAGCTCGTCCAT酶切的 pIVEX 2.4d 載體，構(gòu)建重組表達(dá)載體 pIVEX2.4d-NB-C1。同樣，以 pEGFP-C1 為模板，利用 P3 和 P4 引物擴(kuò)增 GFP 片段，經(jīng)過 Not/Nco酶切和 連接反應(yīng)，構(gòu)建重組載體 pIVEX 2.4d-GFP-NB-C1， 轉(zhuǎn)化 E. coli DH5 感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，并 進(jìn)行 PCR 鑒定和酶切鑒定。將基因測序正確的重組 質(zhì)粒 pIVEX 2.4d-GFP-NB-C1 轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主 E. coli BL21(DE3

21、)pLysS ，構(gòu)建 重組 菌 BL21(DE3)pLysS/ pIVEX2.4d-GFP-NB-C1。1.3.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和 SDS-PAGE 檢測將重組菌株 BL21(DE3)pLysS/pIVEX2.4d-GFP- NB-C1 劃 線 培 養(yǎng) ， 挑 取 單 菌 落 接 種 于 LB (Luria-Bertani) 培養(yǎng)基中 (含 100 mg/L 氨芐青霉素 和 34 mg/L 氯霉素)，37 振蕩培養(yǎng)至 OD600 為 0.6， 加入 IPTG 至終濃度 0.8 mmol/L，20 、200 r/min 誘導(dǎo)培養(yǎng) 20 h。離心收集菌體并重懸于 PBS 緩沖液 中 (0.1

22、 mol/L，pH 8.0)，在冰浴下進(jìn)行超聲破碎， 離心得上清和沉淀。將全細(xì)胞、上清和沉淀樣品進(jìn) 行 SDS-PAGE 檢測，同時以質(zhì)粒 pIVEX2.4d 轉(zhuǎn)化的 BL21(DE3)pLysS/pIVEX2.4d 誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物作為空 白對照。1.3.4 融合蛋白 GFP-NB-C1 的純化及鑒定收集破碎上清液，通過 0.45 m 濾膜過濾后， 上樣于 5 mL 的 Ni-NTA 親和層析凝膠柱，首先采 用 10 倍柱體積的清洗緩沖液 (20 mmol/L PBS，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑，pH 8.0) 洗滌凝 膠柱，再用洗脫緩沖液 (20 mmol/L P

23、BS，500 mmol/L NaCl，150300 mmol/L 咪唑，pH 8.0) 梯度洗脫并2結(jié)果2.1融合表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)將重組質(zhì)粒 pIVEX 2.4d-GFP-NB-C1 分別用 Nco /Xma 和 Not /Nco 雙酶切鑒定，得 到150 bp 和 750 bp 的目的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致 (圖1)。DNA 測序結(jié)果證明融合目標(biāo)片段序列正確。重 組菌 BL21(DE3) pLysS/pIVEX2.4d-GFP-NB-C1 進(jìn)行 IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行 SDS-PAGE 分析，結(jié)果表明，在約 32 kDa 處有一條明顯的目標(biāo)蛋白條帶 (圖 2)。SDS-PAGE

24、分析細(xì)胞破碎的上清和沉 淀，表明 GFP-NB-C1 融合蛋白主要以胞內(nèi)可溶形 式存在。2.2 重組融合蛋白 GFP-NB-C1 的純化和鑒定SDS-PAGE 分析蛋白質(zhì)純化樣品，結(jié)果顯示，目的條帶大小為約 32 kDa (圖 3)。Quantity one 軟件 分析表明其純度大于 95。以 BSA 為標(biāo)準(zhǔn)樣品， Bradford 法測定蛋白質(zhì)濃度，結(jié)果表明經(jīng)過一步純 化后，最終可獲得 36.1 mg/L 純化的 GFP-NB-C1 融 合蛋白。980ISSN1000-3061CN11-1998/QChin J BiotechJuly 25, 2011Vol.27No.7圖 1Fig. 1質(zhì)

25、粒 pIVEX 2.4d-GFP-NB-C1 圖示 (A)及酶切鑒定電泳圖 (B)Schematic map of the recombinant plasmid pIVEX 2.4d-GFP-NB-C1 (A) and restriction analysis of the recombinant plasmidpIVEX 2.4d-GFP-NB-C1 (B). M: DNA marker; 1: pIVEX 2.4d-GFP-NB-C1 digested with Nco I/Xma I; 2: pIVEX 2.4d-GFP-NB-C1digested with Not I/Nco I.圖

26、 3純化后融合蛋白的 SDS-PAGE 分析Fig. 3 SDS-PAGE analysis of the purified GFP-NB-C1 fusion protein. M: protein marker; 1: purified GFP-NB-C1.圖 2 GFP-NB-C1 融合蛋白表達(dá)產(chǎn)物的 SDS-PAGE 分析Fig. 2 SDS-PAGE analysis of the fusion protein GFP-NB-C1. M: protein marker; 1: negative control; 2: whole proteins of cell lysate; 3:

27、soluble fraction of cell lysate; 4: insoluble fraction of cell lysate.討論3近年來雖然諸多學(xué)者通過融合方式表達(dá)了抗菌肽，但由于大多以包涵體形式存在13,21，不利于后 續(xù)的活性檢測等工作。本文以 GFP 為融合載體蛋2.3 重組融合蛋白 GFP-NB-C1 的活性鑒定使用固體平板擴(kuò)散法測定融合蛋白 GFP-NB-C1對單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的抑菌活性，結(jié)果如圖4A 所示 ， 培養(yǎng)皿上 出 現(xiàn)明顯的 抑 菌圈，表 明 GFP-NB-C1 對敏感菌 L. monocytogenes 具有明顯的 抑制作用，并且抑菌圈直徑與融合蛋白

28、濃度具有一 定的線性關(guān)系，如圖 4B。白，在大腸桿菌中實現(xiàn)了重組蛋白的高效可溶表達(dá)，并且 GFP 的使用有助于對重組蛋白表達(dá)和純化過程的實時監(jiān)測。為了使融合蛋白以可溶的形式表達(dá)， 本研究對表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，最終確定表達(dá)條件Journals.im.ac 圖 4 不同濃度 GFP-NB-C1 融合蛋白對單核細(xì)胞增生李斯特菌的抑菌圈直徑 (A) 及 GFP-NB-C1 濃度與抑菌圈直徑曲線 (B)Fig. 4 Inhibitory zone evaluation of GFP-NB-C1 fusion protein at different concentration on the growth

29、 of L. monocytogenes (A) and the concentration-inhibitory zone curve (B). 1: negative control; 2: 40 mg/L GFP-NB-C1; 3: 60 mg/L GFP-NB-C1; 4: 80 mg/L GFP-NB-C1; 5: 100 mg/L GFP-NB-C1.為誘導(dǎo)前 OD600 為 0.6，IPTG 終濃度為 0.8 mmol/L，20 低溫誘導(dǎo) 20 h，目的蛋白以胞內(nèi)可溶形式表達(dá)， 避免了包涵體形成。表達(dá)載體 pIVEX 2.4d 具有 6 個 His 組成的標(biāo) 簽 ，所以重組蛋白可

30、以通過 Ni-NTA 親和層析凝膠 柱 純 化 。為得 到較 純的目 的蛋 白，洗 脫時 采用 150300 mmol/L 咪唑梯度洗脫，當(dāng)洗脫液中咪唑濃 度為 250 mmol/L 和 300 mmol/L 時，目的蛋白被洗 脫下，SDS-PAGE 分析顯示為單一條帶。本研究中 純化條件溫和，步驟簡單，這均有利于蛋白活性的 保持，并大大簡化了純化過程和降低了純化難度， 純化后樣品可直接用于活性檢測。圖 4 表明目的蛋 白對指示菌形成了明顯的抑菌圈，而在其邊界外還 具有一層界限模糊的外圈，這可能是因為少量抑菌 物質(zhì)向平皿內(nèi)部擴(kuò)散后對邊界周圍的菌具有一定的 抑制作用而形成，抑菌圈直徑按照具有清晰

31、邊界的 內(nèi)圈進(jìn)行計算。抑菌實驗表明融合蛋白 GFP-NB-C1 對單核細(xì)胞增生李斯特氏菌具有較好的抑菌活性， 說明經(jīng) GFP 融合后 NB-C1 保留了生物活性。本 文 成 功 構(gòu) 建 并 表 達(dá) 了 可 溶 性 融 合 蛋 白GFP-NB-C1，經(jīng)一步純化，可獲得 36.1 mg/L 純度大于 95的融合蛋白，為其生物學(xué)性質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的探討奠定了基礎(chǔ)。另外本研究建立了一條 IIa 類細(xì) 菌素從基因搜索、重組表達(dá)到獲得活性蛋白的 通 路 ，這對新型細(xì)菌素的挖掘和研究提供了新的思路 和借鑒。REFERENCES1Jack RW, Tagg JR, Ray B. Bacteriocins of g

32、ram-positivebacteria. Microbiol Rev, 1995, 59(2): 171200.Ennahar S, Sashihara T, Sonomoto K, et a1. Class IIa bacteriocins: biosynthesis, structure and activity. FEMS Microbiol Rev, 2000, 24(1): 85106.Muriana PM, Klaenhammer TR. Purification and partial characterization of lactacin F, a bacteriocin

33、produced by Lacobacillus acidophilus 11088. Appl Environ Microbiol,1991, 57(1): 114121.Hoskins J, Alborn Jr WE, Arnold J, et a1. Genome of the baeterium Streptococcus pneumoniaestrain R6. J Bacteriol, 2001, 183(19): 57095717.Saizieu AD, Gardes C, Flint N, et a1. Mieroarray-based identification of a

34、novel Streptococcus pneumoniaeregulon controlled by an autoinduced peptide. Bacteriol, 2000,182(17): 46964703.Nes IF, Johnsborg O. Exploration of antimicrobial23456982ISSN1000-3061 CN11-1998/QChin J BiotechJuly 25, 2011 Vol.27 No.7中的融合表達(dá). 生物工程學(xué)報, 2008, 24(1): 2126.Chen HQ, Fan LM, Xu ZN, et al. Effi

35、cient production of soluble human beta-defensin-3-4 fusion proteins in Escherichia coli cell-free system. Process Biochem, 2007,42(3): 423428.Drider D, Fimland G, Héchard Y, et al. The continuing story of class IIa bacteriocins. Microbiol Mol Biol Rev,2006, 70(2): 564582.Klocke M, Mundt K, Idle

36、r F, et a1. Heterologous expression of enterocin A, a bacteriocin from Enterococcus faecium, fused to a cellulose-binding domain in Escherichia coli results in a functional protein with inhibitory activity against Listeria. Appl Microbiol Biot,2005, 67(4): 532538.Chen HQ, Xu ZN, Xu NZ, et a1. Effici

37、ent production of a soluble fusion protein containing human beta-defensin-2 in E. coli cell-free system. J Biotechnol, 2005, 115(3):307315.Valore EV, Ganz T. Laboratory production of antimicrobial peptides in native conformation. Methods Mol Biol, 1997(78): 115131.Piers KL, Brown MH, Hancock REW. Re

38、combinant DNA procedures for producing small antimicrobial cationic peptides in bacteria. Gene, 1993, 134(1): 713.Sambrook J, Russell DW. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed. Beijing: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.Barrell PJ, Liew OW, Conner AJ. Expressing anpotential in LAB by genomics. Curr Opin Biotechnol,2004, 15(2): 100104.Diep DB, Godager LD, Brede D, et al. Data mining and characterization of a novel pediocin-like bacteriocin system from the genome of Pediococcus pentosaceus ATCC 25745. Microbiology, 2006,