抗HCMV不同多肽McAb的鑒定

1、    抗HCMV不同多肽McAb的鑒定        摘要目的為了將單克隆抗體（McAb）用于診斷技術(shù)，我們首先建立了13株抗人巨細(xì)胞病毒（HCMV）的McAb，選取6株McAb作進(jìn)一步鑒定。方法這6株McAb的鑒定主要采用間接免疫熒光試驗(yàn)、免疫印跡試驗(yàn)等方法。結(jié)果間接免疫熒光試驗(yàn)表明：McAb 8B8相應(yīng)的多肽為早期抗原；而McAb 7B4、7D7、7E7、7E11、8D6的相應(yīng)病毒多肽為晚期抗原。免疫印跡試驗(yàn)的結(jié)果表明：McAb 7B4、7D7、7E7、7E11、8B8

2、、8D6相應(yīng)的病毒多肽分子量分別為46、150、38、51、72、65kd。結(jié)論McAb 8B8可不用于HCMV的快速診斷。關(guān)鍵詞單克隆抗體；人巨細(xì)胞病毒；多肽中分類號R392-11文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號1000-8861（2000）04-0297-03 Identification of McAb against different HCMV polypeptidesYAN Hua，SHEN Hou-feng，LI Guo-cai（Department of Microbiology，School of Medicine，University of Yangzhou，Yongzhou 2250

3、01，China）Abstract Objective To apply monoclonal antibody（McAb） to diagnostic techniques，13 McAbs against different human cytomegalovirus（HCMV） polypeptides were established and 6 McAbs（7B4，7D7，7E7，7E11，8B8，8D6） were selected for further identification.Methods  6 McAbs were mainly identified by

4、indirect immunofluorescence reaction and immunoblot analysis.Results Indirect immunofluorescence reaction of 6 McAbs with HCMV infected cells at different time showed that McAb 8B8 is against the early antigen of HCMV，while McAbs 7B4，7D7，7E7，7E11，8D6 are against the late antigen of HCMV.Immunoblot a

5、nalysis revealed 6 McAbs are directed against different HCMV polypeptides with molecular weight of approximately 46，150，38，51，72，65 kdConclusion McAb 8B8 can be used for rapid assay of HCMVKey words McAb；HCMV；polypeptide人對人巨細(xì)胞病毒（HCMV）普遍易感，多呈非顯性感染、亞臨床和潛伏感染。但對胎兒和免疫功能低下者具有高度危險(xiǎn)性1。這已經(jīng)引起了醫(yī)學(xué)界的重視?？笻CMV-單克隆抗

6、體（McAb）的研制，對于HCMV感染的診斷、預(yù)防和治療具有實(shí)際意義2。本文采用雜交瘤技術(shù)建立了13株分泌HCMV-McAb的雜交瘤細(xì)胞，從中選取效價較高的McAb7B4、7D7、7E7、7E11、8B8、8D6采用免疫熒光試驗(yàn)、免疫印跡試驗(yàn)等作了進(jìn)一步的鑒定。1材料與方法1.16株雜交瘤細(xì)胞的制備方法見參考文獻(xiàn)1。1.26株雜交瘤細(xì)胞的染色體分析采用常規(guī)方法。1.36株雜交瘤分泌McAb的穩(wěn)定性研究采用ELISA和血凝試驗(yàn)。1.46株McAbIg類及亞類的檢定6株雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)液經(jīng)10倍濃縮后與抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM免疫血清（Sigma公司產(chǎn)品）作免疫雙擴(kuò)散

7、試驗(yàn)。1.56株McAb中和滴度的檢定取細(xì)胞病變90以上時的維持液作病毒滴定，稀釋成100TCID500.1ml與等量不同稀釋度的McAb混合，37°C1h，每孔取0.2ml接種2BS細(xì)胞單層，每個稀釋度接種6個孔。觀察2周計(jì)算出保護(hù)50的細(xì)胞不發(fā)生細(xì)胞病變的血清稀釋度，即中和滴度。1.66株McAb的病毒特異性試驗(yàn)4HCMV AD169、單純皰疹病毒（HSV）-1和HSV-2感染24孔培養(yǎng)板孔底蓋玻片上的2BS細(xì)胞（未感染病毒的2BS細(xì)胞作對照），3d后倒去培養(yǎng)液，0.02molL的PBS（pH7.4）洗3次，用24°C冰箱保存的丙酮固定10min，洗3次，每孔加入雜交瘤

8、細(xì)胞培養(yǎng)液0.5ml。37°C1h后倒去,洗3次，每孔加入抗Balbc小鼠IgG熒光抗體（Sigma公司產(chǎn)品120稀釋）0.2ml，洗3次，取出蓋玻片，在雙蒸水中清洗1次，在蓋玻片上加1滴12稀釋的甘油，反貼在載玻片上，熒光顯微鏡檢查。1.76株McAb相應(yīng)抗原多肽在感染細(xì)胞內(nèi)合成時相的檢定HCMV AD169感染2BS細(xì)胞后分別于2、12、24、48、60、72、84、96h從培養(yǎng)板孔中取出蓋玻片，熒光染色的其它步驟同前。1.86株McAb相應(yīng)的抗原多肽分子量的檢定3將HCMV抗原多肽在SDS聚苯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）上展開，將展開后的抗原多肽轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜上（NC

9、），在NC上進(jìn)行ELISA，底物改用3，3-二氨基聯(lián)苯胺四氫氯化物，在暗處顯色15min，蒸餾水終止反應(yīng)。2結(jié)果2.16株雜交瘤的染色體分析結(jié)果6株雜交瘤的染色體的數(shù)目平均為107條。對連續(xù)傳代30代再在液氮中凍存1年后的雜交瘤作染色體檢查仍保持原有染色體數(shù)目。SP20和Balbc小鼠的脾細(xì)胞的染色體數(shù)目分別為70條和40條。1為8B8株的染色體。18B8株的染色體Fig1Chromosomesofclone8B82.26株雜交瘤分泌McAb的穩(wěn)定性研究6株雜交瘤連續(xù)傳代30代，再在液氮中凍存1年后，用ELISA和血凝試驗(yàn)檢測雜交瘤分泌McAb的效價與建株初期比基本一致。2.36株McAbIg

10、類及亞類的檢定免疫雙擴(kuò)散試驗(yàn)的結(jié)果表明：6株HCMV-McAb均為IgG1。2.46株McAb中和滴度的檢定結(jié)果表明：8D6為中和抗體，效價為14。2.56株McAb的病毒特異性試驗(yàn)結(jié)果見表1。表16株HCMV-McAb的特異性反應(yīng)Tab1Specialreactivityof6HCMV-McAbvirusesinfectedcells7B47D77E77E118B88D6HCMVHSV-1HSV-2normalcell2.66株McAb相應(yīng)抗原多肽在感染細(xì)胞內(nèi)合成時相的檢定結(jié)果見表2。8B8McAb相應(yīng)的抗原多肽位于感染細(xì)胞核內(nèi)，感染后12h即可檢測到。7B4、7D7、7E7、7E11和8D

11、6McAb所針對的抗原多肽位于細(xì)胞漿內(nèi)近核膜處，感染24h后才可檢測到。 表2HCMV感染細(xì)胞后不同時間取材與6株McAb的免疫熒光反應(yīng)Tab2IIFAof6McAbwithHCMVinfectedcellsatvarioustimeHCMVpostinfection（hour）7B47D77E77E118B88D6212243648607284962.76株McAb相應(yīng)的抗原多肽分子量的檢定結(jié)果見2。McAb7B4、7D7、7E7、7E11、8B8、8D6相應(yīng)的病毒多肽分子量分別為46、150、38、51、72、65kd。2HCMV多肽免疫印跡示意Fig2ImmunoblotofHCMVpo

12、lypeptidesM：mol，wt，markers；1：7E7-38kd；2：8D6-65kd；3：7D7-150kd；4：7B4-46kd；5：7E11-51kd；6：8B8-72kd3討論融合后的子代細(xì)胞具有每個親代細(xì)胞的大部分染色體。本文的染色體分析結(jié)果證實(shí)了這一點(diǎn)。SP20骨髓瘤細(xì)胞和免疫脾細(xì)胞的染色體數(shù)目分別為70條和40條，兩者之和為110條，雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目為107條接近于110條。雜交瘤細(xì)胞有喪失染色體的傾向。染色體的喪失將會導(dǎo)致Ig合成能力的喪失。6E4、7C3和8F103株在傳代過程中（分別在8，6，10代時）由開始的HCMV-McAb陽性轉(zhuǎn)變?yōu)殛幮?，可能為這種原因

13、所致。對連續(xù)傳代30代再在液氮中凍存1年后的6株雜交瘤細(xì)胞作染色體檢查仍保持原有染色體數(shù)目，而且能穩(wěn)定地分泌HCMV-McAb。HCMV感染敏感細(xì)胞后，病毒基因在即刻早期（02h），早期（24h）和晚期（24h）得到表達(dá)，相應(yīng)的基因產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）稱為即刻早期抗原（IEA）即蛋白、早期抗原（EA）即蛋白和晚期抗原（LA）也稱蛋白。這些細(xì)胞內(nèi)病毒蛋白何時能被檢測到與感染復(fù)數(shù)（MOI）有密切關(guān)系5。本文在MOI為1的情況下，8B8相應(yīng)的病毒多肽最先被檢測到，12h即出現(xiàn)暗淡的核內(nèi)熒光。隨著時間的延長，熒光亮度增加。7B4、7D7、7E7、7E11、8D6相應(yīng)的病毒多肽均在24h以后才被檢測到而且均為

14、胞漿局部（包涵體）熒光染色。結(jié)果表明：8B8是針對HCMV早期蛋白的，其它5株HCMV-McAb均是針對HCMV晚期蛋白的。McAb8B8相應(yīng)的病毒多肽的分子量為72kd，該肽為即刻早期基因編碼的早期蛋白6，HCMV感染敏感細(xì)胞后幾個小時就被合成，針對早期蛋白的McAb可用作HCMV的早期診斷試劑，國外已開展了這方面的應(yīng)用7，但國內(nèi)尚未開展這方面的工作，McAb 8B8的研究成功為這項(xiàng)工作的開展創(chuàng)造了條件。6株HCMV-McAb中，5株沒有中和活性，僅1株（8D6）有低滴度的中和活性。本文認(rèn)為：以感染細(xì)胞外的病毒或提取病毒的包膜成份作為免疫原可獲得高滴度的具有中和活性的McAb。McAb 7D

15、7相應(yīng)的病毒多肽分子量為150kd。該肽是一種堿性磷酸化蛋白，在病毒體內(nèi)位于衣殼和包膜之間，故也稱殼皮、披膜蛋白、基質(zhì)蛋白3。由于它與其它皰疹病毒的開放閱讀框架（ORF）無任何同源性，被認(rèn)為是HCMV的特異性多肽。不僅特異性高，而且免疫原性也強(qiáng)，能被HCMV陽性血清中IgG和IgM所識別。McAb 8D6相應(yīng)的病毒多肽分子量為65kd。65kd肽也是一種基質(zhì)蛋白，存在于致密體里3，但也有人認(rèn)為是核衣殼的成分或是與核衣殼緊密相連的包膜基質(zhì)成分或是與66kd的披膜蛋白有關(guān)。這種肽的分子量各家報(bào)道的不一致（6469kd）可能是由于電泳條件不同、試驗(yàn)毒株不一所致。有的研究結(jié)果表明：不論在病毒體內(nèi)還是在

16、感染細(xì)胞內(nèi)，F(xiàn)c受體總存在于65kd肽上。65kd肽是不是早期抗原有相互矛盾的報(bào)道。McAb 7E7相應(yīng)的病毒多肽分子量為38kd。38kd肽位于病毒體內(nèi)衣殼上，故稱衣殼蛋白，因有裝備功能也稱裝備蛋白（assemblyprotein）5。38kd肽可用于血清學(xué)診斷抗原。有文獻(xiàn)報(bào)道：針對38和66kd肽的IgM出現(xiàn)較早，針對150kd肽的IgM出現(xiàn)較晚。McAb 7E11相應(yīng)的病毒多肽分子量為51kd。51kd肽是不是52kd還難以確認(rèn)，從分子量大小上看僅相差1kd，可能是同一肽。對52kd的認(rèn)識尚不一致，有的認(rèn)為是DNA結(jié)合蛋白7，有的則認(rèn)為是包膜糖蛋白，52kd肽的確切的生物學(xué)功能不很清楚，

17、REVELLO7將針對52kd肽的McAb標(biāo)上酶用于捕獲法ELISA中檢測HCMV-SIgM受到很好的效果。McAb 7B4相應(yīng)的病毒多肽的分子量為46kd。目前對這種肽的研究報(bào)告很少。有人報(bào)告：分子量與它接近的49kd肽可作先天性感染診斷用的抗原。基金項(xiàng)目江蘇省衛(wèi)生廳（H9515）；計(jì)生委科研基金（J9506）作者簡歷嚴(yán)華（1955），男，江蘇泰興市人，副教授，碩士，主要從事醫(yī)學(xué)診斷試劑盒的研究工作。嚴(yán)華（揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室，江蘇 揚(yáng)州 225001）申厚風(fēng)（揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室，江蘇 揚(yáng)州 225001）李國才（揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室，江蘇 揚(yáng)州 225001）參考

18、文獻(xiàn)1  嚴(yán) 華，戴 斌.HCMV-McAb的研制、檢定和應(yīng)用J.單克隆抗體通訊，1994，10（3）：27302  關(guān)明旭，劉蘭青，陳淑榮，等.檢測抗巨細(xì)胞病毒IgM抗體的ABC-ELISA法與常規(guī)ELISA法的比較研究J.中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1988，17（3）：182186.3  JAHN G，SCHOLL BC，TRAUPE B，et al.The two major structural phosphoproteins （pp65 and pp150） of human cytomegalovirus and their antigenic propert

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