辣根過(guò)氧化物酶

1、辣根過(guò)氧化物酶（HRP一種糖蛋白，由于在辣根中該酶的含量很高，故名。它以鐵嚇咻為輔基，在過(guò)氧化氫存在時(shí)能催化苯酚、苯胺及其取代物聚合。通常用做光學(xué)和電子顯微鏡的組織化學(xué)示蹤物。簡(jiǎn)介：過(guò)氧化物酶，通常來(lái)源于辣根（因此稱辣根過(guò)氧化物酶），是臨床檢驗(yàn)試劑中的常用酶。該產(chǎn)品不但廣泛用于多個(gè)生化檢測(cè)項(xiàng)目，也廣泛運(yùn)用于免疫類（ELISA）試劑盒。過(guò)氧化物酶作為多個(gè)試劑盒顯色體系的關(guān)鍵成分，對(duì)試劑盒的質(zhì)量有重要影響。辣根過(guò)氧化物酶（HorseradishPeroxidase,HRP）比活性高，穩(wěn)定，分子量小，純酶容易制備，所以最常用。HRP廣泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由無(wú)色的酶蛋白和棕色的鐵嚇咻結(jié)合

2、而成的糖蛋白，糖含量18%HRP由多個(gè)同功酶組成，分子量為40,000，等電點(diǎn)為PHA9,酶催化的最適PH因供氫體不同而稍有差異，但多在PH5左右。酶溶于水和58%Z下飽和度硫酸俊溶液。HRP的輔基和酶蛋白最大吸收光譜分別為403nm和275nm,一般以O(shè)D403nm/OD275nm的比值RZ（德文ReinheitZahl）表示酶的純度。高純度的酶RZ值應(yīng)在3.0左右（最高可達(dá)3.4）。RZ值越小，非酶蛋白就越多。用途:1） RZ>3活性>250u/mg,主要應(yīng)用于免疫學(xué)，是高純度的過(guò)氧化酶采用特殊色譜純化技術(shù)以除去會(huì)影響免疫學(xué)反應(yīng)的同工酶B.2） RZ>2活性>180

3、u/mg,主要應(yīng)用于臨床化學(xué)，我們的客戶也有將這個(gè)規(guī)格的產(chǎn)品應(yīng)用于免疫學(xué)研究的。此時(shí)，一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化的分析方法就變得尤為重要。3） RZ>1活性>100u/mg,主要應(yīng)用于血糖試紙和尿液分析試紙。4） RZ>0.6活性>60u/mg,主要應(yīng)用于尿液分析試紙。實(shí)驗(yàn)原理：過(guò)氧化物酶催化以下反應(yīng)：2H2O2->O2+2H2O這一類酶以鐵嚇咻為輔基，所以屬血紅素蛋白質(zhì)類（hemeProteins）過(guò)氧化物酶在生物界分布極廣，在細(xì)胞代謝的氧化還原過(guò)程中起重要的作用。辣根過(guò)氧化物酶的作用機(jī)理可分以下幾步：第一步，形成綠色有活性的酶一底物復(fù)合物I:kHRP+HaOj寧夏管物I第二步

4、，復(fù)合物I轉(zhuǎn)變成紅色有活性的復(fù)合物H:復(fù)合物I+AH>復(fù)合物H+A（AH表示還原型氫供體。）第三步，復(fù)合物II被還原，釋放出酶：K現(xiàn)含柵I*AH-一Uhrp*A*2HQ<3y在一定程度上復(fù)合物H可自發(fā)地分解成HRP和產(chǎn)物（P）,亦可與過(guò)量的過(guò)氧化氫形成無(wú)活性的復(fù)合物mo復(fù)合物11>HRP+P&介物IIiH：O：紅含物IH辣根過(guò)氧化物酶的活力測(cè)定方法有多種，主要原理介紹如下：1、Rz值，提純工作的后幾步以及純酶溶液可用Rz值表明酶的純度CD制Rz=ODj-r403nm處的吸收代表血紅素輔基的吸收，275nm的吸收是蛋白質(zhì)的吸收結(jié)晶的HRP的Rz值為3.04。測(cè)定時(shí)的酶濃

5、度為1毫克蛋白/毫升。2、愈創(chuàng)木酚法：測(cè)k4見(jiàn)反應(yīng)式（3）。以愈創(chuàng)木酚（鄰甲氧基酚，guaiacol）為氫給體，其反應(yīng)如下：L廠一li四鄰甲氧基連酚有色產(chǎn)物四鄰甲氧基連酚（E470nm=26.6mM1cm1）生成的速度（dx/dt）與底物過(guò)氧化氫以及氫供體愈創(chuàng)木酚的濃度有關(guān)。方程如下：Sue一酶濃度；a0一氫供體起始濃度；x0為過(guò)氧化氫的起始濃度。k1x0,可以測(cè)得k1:一測(cè)定過(guò)程中底物減少的速度。本實(shí)驗(yàn)是采用測(cè)定k4的方法來(lái)判斷酶的純度。上述測(cè)定Rz值和k4值的方法雖然比較簡(jiǎn)單，但都不能測(cè)得酶的實(shí)際活力單位。測(cè)定過(guò)氧化物酶的傳統(tǒng)方法是連苯三酚試驗(yàn)法，以過(guò)氧化氫為底物，在酶作用下，連苯三酚可形