生物藥物分析

1、生物藥物分析復(fù)習(xí)第一章 緒論藥物分析的性質(zhì)：應(yīng)用化學(xué)，物理化學(xué)和生物化學(xué)的方法和技術(shù)對(duì)藥物的質(zhì)量進(jìn)行全面控制的學(xué)科。藥物分析的任務(wù)：藥物研制過(guò)程中的“眼睛”；制定藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；生產(chǎn)過(guò)程中的質(zhì)量控制；開(kāi)展臨床藥學(xué)研究；常規(guī)藥品的檢驗(yàn)。*藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)： 國(guó)家對(duì)藥品質(zhì)量及檢驗(yàn)方法所做的技術(shù)規(guī)定。是藥品生產(chǎn)，經(jīng)營(yíng)，使用以及檢驗(yàn)和監(jiān)督管理部門(mén)共同遵循的法律依據(jù)。*中國(guó)藥典的內(nèi)容：凡例，正文，附錄，索引。藥檢工作基本程序：取樣，鑒定，檢查，含量測(cè)定，書(shū)寫(xiě)檢查報(bào)告。酶法分析（終點(diǎn)法，酶循環(huán)放大分析法，速度法） 是利用酶作為工具對(duì)特定物質(zhì)（底物、輔酶、抑制劑和激動(dòng)劑等） 進(jìn)行定量分析的方法。終點(diǎn)法(總變量法

2、) 測(cè)定原理：先借助酶反應(yīng)（單個(gè)酶反應(yīng)或幾種酶構(gòu)成的偶聯(lián)酶反應(yīng)）使被測(cè)物定量的進(jìn)行轉(zhuǎn)變，然后在轉(zhuǎn)變完成后，測(cè)定底物，產(chǎn)物或輔酶物質(zhì)的變化量，因此稱為終點(diǎn)法。終點(diǎn)法的條件： 1.必須有專一地作用該被測(cè)物質(zhì)的酶，并能得到它的制品；2 能夠確定使這種酶反應(yīng)接近進(jìn)行完全的條件；3.反應(yīng)中底物的減少或產(chǎn)物的增加或輔酶物質(zhì)的改變等可以借助某種簡(jiǎn)單的方法進(jìn)行測(cè)定；4.在能滿足這些條件的情況下，最好是采用單一酶反應(yīng)就能進(jìn)行定量檢測(cè)。使用終點(diǎn)法測(cè)定應(yīng)注意的問(wèn)題 ：酶的底物的專一性（最好是絕對(duì)專一性）；反應(yīng)的平衡；反應(yīng)液中的酶量；反應(yīng)產(chǎn)物的抑制。終點(diǎn)法的種類（一）單酶反應(yīng)定量法：1、底物減少量的測(cè)定：胞嘧啶（28

3、0nm ）、腺嘌呤（280nm ）和尿酸（293nm 或 297nm ）。2.產(chǎn)物增加量的測(cè)定：（1）各種氨基酸和草酸（2）黃嘌呤、次黃嘌呤以及 CoA* 3.輔酶變化量的測(cè)定（理解例子 學(xué)會(huì)如何進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析）條件：測(cè)定以 NAD或 NADP為輔酶的脫氫酶的底物的量。原理：NADH 和 NADPH 在 340nm 有特征最大吸收峰，而 NAD 和 NADP 在 340nm 卻無(wú)這一吸收帶，故可應(yīng)用于NAD 或 NADP 為輔酶的脫氫酶反應(yīng)，通過(guò)測(cè)定 340nm 吸光度的變化，就可以對(duì)作用相應(yīng)脫氫酶底物的物質(zhì)進(jìn)行定量分析。（二）和指示酶反應(yīng)偶聯(lián)的定量法1. 以脫氫酶為指示劑（理解例子 學(xué)會(huì)

4、如何進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析）2. 以脫氫酶以外的酶作為指示劑酶循環(huán)放大分析法具有化學(xué)放大作用，理論上可無(wú)限放大其靈敏度。是利用酶循環(huán)設(shè)計(jì)的一種超微分分析法。步驟：轉(zhuǎn)換反應(yīng)，循環(huán)反應(yīng)，指示反應(yīng)轉(zhuǎn)換反應(yīng) ： 以試樣中的待測(cè)組分為底物，經(jīng)特異反應(yīng)生成與待測(cè)組分相當(dāng)?shù)亩垦h(huán)底物。循環(huán)反應(yīng) ：生成的循環(huán)底物反復(fù)參加由兩個(gè)酶反應(yīng)組成的偶聯(lián)反應(yīng)，所得產(chǎn)物量為循環(huán)底物的若干倍。指示反應(yīng) ：采用酶法測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物。由反應(yīng)產(chǎn)物量及循環(huán)次數(shù)，計(jì)算出循環(huán)底物量，再推算出試樣中待測(cè)組分的量。酶循環(huán)放大分析法應(yīng)用范圍1. 有循環(huán)底物參加的酶反應(yīng)的底物或酶可測(cè)定(NAD 、NADP 、CoA)2. 能與以上反應(yīng)偶聯(lián)的酶反應(yīng)的底

5、物或酶可測(cè)定（GATPHK ） 酶循環(huán)放大分析應(yīng)該注意的問(wèn)題:1. 在進(jìn)行循環(huán)之前，必須完全除去轉(zhuǎn)換反應(yīng)中剩余的輔酶；2. 在循環(huán)反應(yīng)中底物（不是輔酶）必須過(guò)量；3. 要用已知量的循環(huán)底物做循環(huán)反應(yīng)和指示反應(yīng)以求得循免疫分析利用抗原抗體反應(yīng)檢測(cè)各種物質(zhì)（藥物、激素、蛋白質(zhì)、微生物等）的方法?？乖c抗體性質(zhì) 及其相互作用免疫球蛋白分子由兩條重鏈（H 鏈）和兩條輕鏈（L 鏈）通過(guò)不同數(shù)目的二硫鍵結(jié)成Y 形。在抗體分子的N 端為“多變區(qū)”（V 區(qū)），是抗體分子與抗原決定簇的結(jié)合部位；抗體分子的 C 端為“穩(wěn)定區(qū)”（C 區(qū)），是抗體抗原特異性部位。 抗原抗體結(jié)合具有 高度特異性 ?？乖奶禺愋匀Q于抗

6、原決定簇的數(shù)目、性質(zhì)和空間構(gòu)型，而抗體的特異性則取決于抗體 Ig Fab段的可變區(qū)與相應(yīng)抗原決定簇的結(jié)合能力?？乖c抗體通過(guò)很弱的短矩引力而結(jié)合，如 范德華引力、靜電引力、氫鍵及疏水性作用等。免疫擴(kuò)散技術(shù)10第 27 頁(yè)共 16 頁(yè)基本原理 ：可溶性的抗原和相應(yīng)的抗體在溶液或凝膠中彼此接觸，形成不溶性抗原-抗體復(fù)合物沉淀。雙向免疫擴(kuò)散基本原理 ：指可溶性抗原與相應(yīng)抗體在瓊脂介質(zhì)中相互擴(kuò)散，彼此相遇后形成一定類型的特異性沉淀線。如果反應(yīng)體系中含兩種以上的抗原抗體系統(tǒng)，則小孔間可出現(xiàn)兩條以上的沉淀線。雙向免疫擴(kuò)散的 應(yīng)用 ：1.抗原、抗體相對(duì)含量測(cè)定；2.抗原、抗體相對(duì)分子量分析酶免疫分析技術(shù)基本

7、原理 ：指酶標(biāo)記抗體或酶標(biāo)記抗體進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)。它采 用抗原與抗體的特異反應(yīng)與酶連接，然后通過(guò)酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測(cè)定。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ ELISA） ：結(jié)合在固相載體上的抗原（抗體）與待檢抗體（抗原）酶偶聯(lián)物（標(biāo)記物）反應(yīng)后， 催化水解或氧化還原酶的相應(yīng)底物呈色，其顏色深淺與待測(cè)抗原（抗體）含量成正比。包被 ：指將抗原或抗體固相化的過(guò)程。它是通過(guò)物理吸附作用，一般靠疏水鍵連接。封閉：指用封閉劑封閉經(jīng)包被的固相載體表面殘留的未飽和位吸附位點(diǎn)的過(guò)程。常規(guī)使用的 ELISA 技術(shù)主要有：直接 ELISA ：測(cè)抗原間接 ELISA ：測(cè)抗體夾心 ELISA ：測(cè)抗原競(jìng)爭(zhēng) ELISA

8、：測(cè)抗體或抗原及半抗原反向捕捉 ELISA ：測(cè)特異性 IgM單位點(diǎn)非競(jìng)爭(zhēng) ELISA ：主要測(cè)半抗原細(xì)胞 ELISA ：測(cè)細(xì)胞表面抗原夾心 ELISA基本原理 ：樣品中抗原與載體上抗體結(jié)合，經(jīng)洗滌加入該抗原的酶標(biāo)記抗體，洗去未結(jié)合的酶標(biāo)抗體，加底物顯色，可定量測(cè)定抗原。雙抗體夾心法測(cè)抗原 ：應(yīng)用針對(duì)抗原兩個(gè)不同決定族的兩種單抗分別作為固相載體包被和酶標(biāo)抗體，以檢測(cè)相應(yīng)的抗原。此法適用于測(cè)定二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原。雙抗原夾心法測(cè)抗體 ：用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物，以檢測(cè)相應(yīng)的抗體。與間接法測(cè)抗體的不同之處為以酶標(biāo)抗原代替酶標(biāo)抗抗體。此法適用于多價(jià)大分子抗原（血清中 HBsAg 、A

9、FP 和尿液 hCG ）的檢測(cè)，而不能用于測(cè)定半抗原等小分子物質(zhì)。競(jìng)爭(zhēng) ELISA競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體 ：待測(cè)抗體和一定量的酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)與固相抗原結(jié)合。當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時(shí)，可用此法檢測(cè)特異性抗體。競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原 ：待測(cè)抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合，結(jié)果如待測(cè)抗原含量越多，與固相抗體結(jié)合的酶標(biāo)抗原就越少，顯色越淺，二者呈負(fù)相關(guān)。放射免疫測(cè)定 RAI 基本原理：放射性標(biāo)記的已知抗原（*Ag ）和非標(biāo)記的待檢抗原（Ag ）同時(shí)與限量的特異性抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合或競(jìng)爭(zhēng)性抑制反應(yīng)，通過(guò)測(cè)定結(jié)合（ *Ag-Ab）的或游離（ *Ag ）的放射性標(biāo)記抗原的量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線

10、即可推算出被測(cè)物含量的一種超微量分析技術(shù)。免疫放射分析（ IRMA）基本原理：用過(guò)量的核素標(biāo)記抗體與待測(cè)抗原形成復(fù)合物，并用固相免疫吸附劑作為B 或 F 的分離手段除去多余的游離抗體，測(cè)量抗原抗體復(fù)合物的放射性。放射免疫與免疫放射原理的區(qū)別IRMA與 RIA 的工作原理的主要區(qū)別項(xiàng)目反應(yīng)機(jī)制反應(yīng)試劑分離方法待測(cè)抗原復(fù)合物放射性非特異性結(jié)合待檢抗原性質(zhì)ELISA 操作要點(diǎn)：RIA （放射免疫） 競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)三種標(biāo)記抗原抗原只需一個(gè)抗原決定簇與待測(cè)抗原呈負(fù)相關(guān)主要影響高劑量反應(yīng)半抗原及大分子IRMA （免疫放射）非競(jìng)爭(zhēng)性全量反應(yīng)靈敏度提高（10-100 倍）二種標(biāo)記抗體一般需單抗作分離劑，抗原需兩個(gè)

11、或兩個(gè)以上決定簇與待測(cè)抗原呈正相關(guān)主要影響低劑量反應(yīng)蛋白質(zhì)、酶等生物大分子加樣 ：即加標(biāo)本、酶結(jié)合物和底物，注意交叉污染和產(chǎn)生氣泡。溫育 ：常采用的溫度：43、37、室溫和 4（冰箱溫度）。洗滌 ：是 ELISA 最主要的關(guān)鍵技術(shù)，目的是分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物。洗滌方式自動(dòng)板機(jī)、手工操作（浸泡式和流水沖洗式）。顯色 ：影響因素：反應(yīng)溫度和時(shí)間；OPD底物液應(yīng)避光顯色，硫酸終止；TMB顯色終止液：疊氮鈉、SDS 、各類酸性終止液。比色 ：以蒸餾水校零點(diǎn)，測(cè)讀底物孔（未經(jīng)任何反應(yīng)僅加底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標(biāo)本作全過(guò)程的孔）。*生物檢定 是利用生物體包括整體動(dòng)物、離體組織/

12、器官、細(xì)胞和微生物等評(píng)估藥物生物活性的一種方法。它以藥物的藥理作用為基礎(chǔ)，以生物統(tǒng)計(jì)為工具，運(yùn)用特定的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在一定條件下比較 供試品 和相當(dāng)?shù)?標(biāo)準(zhǔn)品 或 對(duì)照品所產(chǎn)生的特定反應(yīng)，通過(guò)等反應(yīng)劑量間比例的運(yùn)算或限值劑量引起的生物反應(yīng)程度，從而測(cè)定供試品的效價(jià)、生物活 性或雜質(zhì)引起的毒性。生物檢定的作用：生物檢定法具有獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)，主要表現(xiàn)在： (1)直接關(guān)切生化藥物的有效性和安全性；(2) 量效關(guān)系確切，可為臨床用藥劑量的規(guī)范化提供參考；(3) 是反映產(chǎn)品質(zhì)量的重要指標(biāo)，具有專屬性。生物檢定在藥物分析中的應(yīng)用 ：1、藥物的效價(jià)測(cè)定；2、大分子結(jié)構(gòu)的測(cè)定；3、微量生理活性物質(zhì)的測(cè)定；4、藥物的毒性

13、成分及有害雜質(zhì)的限度檢查；5、新藥研究。電泳技術(shù)的基本原理電泳：帶電粒子在電場(chǎng)中的定向移動(dòng)。在電解質(zhì)溶液中，位于電場(chǎng)中的帶電離子在電場(chǎng)力的作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現(xiàn)象， 稱之為電泳。由于不同離子所帶電荷及性質(zhì)的不同，遷移速率不同，可實(shí)現(xiàn)分離。電泳法:指帶電微粒如蛋白質(zhì)、核苷酸、其他微粒分子或離子在電場(chǎng)的作用下，向其對(duì)應(yīng)的電極方向按各自的速度泳動(dòng)而使組分分離，再進(jìn)行檢測(cè)或計(jì)算百分含量的方法。顆粒在溶液中遷移的 驅(qū)動(dòng)力 ：顆粒的有效電荷和電位梯度。影響電泳速度的 因素 ：顆粒性質(zhì)；電場(chǎng)強(qiáng)度；溶液性質(zhì)；電滲；焦耳熱；篩孔:聚丙烯酰胺凝膠電泳原理：以孔徑大小不同的聚丙烯酰胺

14、凝膠為支持物，采用電泳基質(zhì)的不連續(xù)體系（即凝膠層、緩沖液離子成分、PH 、電位梯度均不連續(xù)），使樣品在不連續(xù)的兩層凝膠之間積聚濃縮成很窄的樣品區(qū)帶（厚度為 0.1毫米），然后再進(jìn)行分離，從而提高了分辨率。PAGE不連續(xù)系統(tǒng)的原理與技術(shù)不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳的三種物理效應(yīng) ：樣品的濃縮效應(yīng) ; 分子篩效應(yīng) ; 電荷效應(yīng)。樣品的濃縮效應(yīng):凝膠孔徑不連續(xù)性 緩沖液離子成份的不連續(xù)性 PH 的不連續(xù)性電位梯度的不連續(xù)性*三種物理效率使樣品分離效果好，分辨率高。一般電泳分離的電荷效應(yīng)：帶電多，MW小，遷移快不連續(xù)系統(tǒng)對(duì)樣品的濃縮效應(yīng)：遷移率，被壓成薄層凝膠對(duì)樣品分子的篩選效應(yīng)影響蛋白質(zhì)與 SDS 的結(jié)

15、合程度的因素：溶液中 SDS 單體的濃度；樣品緩沖液的離子強(qiáng)度；二硫鍵是否完全被還原SDS-PAGE測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的原理和技術(shù)十二烷基硫酸鈉（SDS ）是一種陰離子表面活性劑，能使蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵打開(kāi)，并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上，形成蛋白質(zhì)SDS 復(fù)合物。蛋白質(zhì)帶上相同密度的負(fù)電荷；SDS 與蛋白質(zhì)結(jié)合后，還引起了蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變；凝膠電泳中的遷移率，不再受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響，只與蛋白質(zhì)分子量相關(guān)。蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于它 的分子量大小，而與所帶電荷和形狀無(wú)關(guān)。影響遷移率的因素：二硫鍵是否完全被還原；溶液中 SDS 的濃度；溶液的離子強(qiáng)度等電聚焦電泳(IEFE)是一種利用具有

16、 pH 梯度 的支持介質(zhì)分離 等點(diǎn)電不同 的蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)。等電聚焦 就是在電泳介質(zhì)中放入載體兩性電解質(zhì)，當(dāng)通以直流電時(shí)，兩性電解質(zhì)即形成一個(gè)由陽(yáng)極到陰極逐步增加的 pH 梯度，在此體系中，不同的蛋白質(zhì)即移動(dòng)到或聚焦于其相當(dāng)?shù)牡入婞c(diǎn)位置上，也就是說(shuō)被聚焦于一個(gè)狹的區(qū)帶中。*理想的載體兩性電解質(zhì)應(yīng)具備的特征：分子量要小，以便與被分離大分子物質(zhì)分離；化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定；各成分的 pI 彼此接近，并在其pI值附近有良好的緩沖能力；在 pI 處具有足夠的電導(dǎo)，導(dǎo)電性均勻；兩性電解質(zhì)載體的數(shù)目要足夠多；可溶性好；對(duì) 280nm 的紫外光沒(méi)有或僅有很低的吸光度，不干擾樣品的測(cè)定。高效毛細(xì)管電泳 HPCE ：是

17、以毛細(xì)管為分離通道，以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，根據(jù)樣品各組分之間遷移率和分配行為的差異，而實(shí)現(xiàn)分離的一種新型電泳技術(shù)。雙向電泳 ：將樣品進(jìn)行電泳后，為了不同的目的在它的垂直方向再進(jìn)行一次電泳的方法。雙向電泳的種類：第一向等電聚焦，第二向 SDS 電泳第一向 SDS 電泳，第二向等電聚焦。常用的雙向電泳為第一向等電聚焦，第二向 SDS 電泳。1. 抗原與抗體通過(guò)很弱的短矩引力而結(jié)合，如_范德華引力_、_靜電引力 、_氫鍵_及 疏水性作用 等。2. 免疫分析法利用_ 抗原抗體 反應(yīng)檢測(cè)各種物質(zhì)（藥物、激素、蛋白質(zhì)、微生物等）的方法。3. RIA 是以放射性核素標(biāo)記抗原，使標(biāo)本中 非標(biāo)記抗原與試劑中

18、標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體，通過(guò)測(cè)定結(jié)合相的放射性強(qiáng)度，推定標(biāo)本含量。4. 免疫印跡技術(shù)指的是將凝膠電泳與固相免疫測(cè)定結(jié)合，先把電泳分區(qū)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體，再用酶免疫、放射免疫等技術(shù)測(cè)定 。5. *標(biāo)準(zhǔn)品 是指用于生物檢定、抗生素或生物藥品中含量或效價(jià)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以效價(jià)單位(U)表示。6. 聚丙烯酰胺凝膠制備時(shí)，聚合反應(yīng)所使用的化學(xué)催化劑是 過(guò)硫酸銨TEMED 光聚合催化劑是 核黃素 。7. 帶電粒子在電場(chǎng)中的移動(dòng)速度主要決定于 顆粒性質(zhì)電場(chǎng)強(qiáng)度 和 溶液性質(zhì)。8. 蛋白質(zhì)分子在 pH 高于其等電點(diǎn)的緩沖溶液中帶 負(fù) 電，在電場(chǎng)中向 正 極移動(dòng)。色譜分析按操作形式分類:紙色譜,薄層色譜,柱色

19、譜.紙色譜 ：以紙為載體,紙上所含水分或其他物質(zhì)為固定相,用展開(kāi)劑進(jìn)行展開(kāi)的分配色譜.紙色譜的影響因素 ：1 濾紙的影響 2 展開(kāi)劑的影響 3 物質(zhì)極性的影響 4 pH 的影響 5 溫度和時(shí)間的影響薄層色譜選擇吸附劑的原則（1） 樣品組分的性質(zhì)（2） 吸附劑的性質(zhì)根據(jù)薄層色譜的分離機(jī)制，選擇適宜活性的吸附劑。吸附劑對(duì)樣品的作用：薄層的顯色方法不同，所用的吸附劑也不同。吸附劑的規(guī)格對(duì)展開(kāi)劑的要求(1) 能夠溶解待測(cè)組分；(2) 能使待測(cè)組分與雜質(zhì)分開(kāi)；(3) 使待測(cè)組分的 Rf 值在 0.2-0.8之間；(4) 不能與待測(cè)組分或吸附劑發(fā)生化學(xué)反應(yīng) ； (5)具有適中的沸點(diǎn)和比較小的粘度；(6)展

20、開(kāi)后組分的斑點(diǎn)圓且集中； (7)混合溶劑最好臨用前新鮮配制薄層色譜法常見(jiàn)的問(wèn)題和消除的方法：(一)斑點(diǎn)拖尾現(xiàn)象(二)邊緣效應(yīng)(三)S 形及波浪形斑點(diǎn)(四)斑點(diǎn)呈念珠狀(五)展速慢(六) Rf值不穩(wěn)定N = 16 (tr / w)2 = 5.54 (tr / w1/2)2 HETP=A+B/v+Cv分子篩的優(yōu)缺點(diǎn)？1. 凝膠層析操作簡(jiǎn)便，所需設(shè)備簡(jiǎn)單。2. 分離效果較好，重復(fù)性高。最突出的是樣品回收率高，接近 100。3. 分離條件緩和。4. 應(yīng)用廣泛。適用于各種生化物質(zhì)，如肽類、激素、蛋白質(zhì)、多糖、核酸的分離純化、脫鹽、濃縮以及分析測(cè)定等。分離的分子量范圍也很寬。5. 分辨率不高，分離操作較慢

21、。對(duì)于分子量相差不多的物質(zhì)難以達(dá)到很好的分離。此外，凝膠層析要求樣品粘度不宜太高。凝膠顆粒有時(shí)還有非特異吸附現(xiàn)象 。檢測(cè)器的類型 ： 紫外檢測(cè)器；熒光檢測(cè)器；示差折光檢測(cè)器；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器；質(zhì)譜檢測(cè)器；電導(dǎo)檢測(cè)器；PH 檢測(cè)器。蒸發(fā)散射質(zhì)量檢測(cè)器的優(yōu)缺點(diǎn)：1 與示差折光檢測(cè)器相比：靈敏度高; 對(duì)流動(dòng)相系統(tǒng)溫度變化不敏感 ; 可進(jìn)行梯度洗脫.2 與光吸收檢測(cè)器相比：能解決最困難的 HPLC 檢測(cè)問(wèn)題。如磷脂、皂甙、糖類、聚合物、樹(shù)脂等無(wú)紫外吸收或紫外吸收系數(shù)很小的化合物的檢測(cè) ; 減低流動(dòng)相溶劑的純度要求; 無(wú)需測(cè)定定量校正因子.親和色譜也稱為 親和層析，是一種利用固定相 的結(jié)合特性來(lái)分離分子

22、的色譜方 法。原理：將一對(duì)能可逆結(jié)合和解離生物分子 的一方最為配基（也稱 為配體），與具有大 孔徑、親水性的固相載體相偶聯(lián) 、制成專一的親和吸附劑 ，再用此親和吸附劑填充 色譜柱，當(dāng)含有被分 離物質(zhì)的混合物隨著流動(dòng)相流經(jīng)色譜柱時(shí) ，親和吸附劑上的配基就有 選擇地吸附能與其結(jié)合的物質(zhì) ，而其他的蛋白質(zhì)及 雜質(zhì)不被吸附，從色譜柱中流出，使 用適當(dāng)?shù)木彌_液使被分離物質(zhì)與 配基解吸附，即可獲得純化的 目的產(chǎn)物。高效液相色譜基本儀器裝置： 輸液系統(tǒng)，進(jìn)樣系 統(tǒng)，分離系統(tǒng)，檢測(cè)系統(tǒng)，數(shù) 據(jù)處理系統(tǒng)。容量因子：是指 在分配“平衡”后，組分在固 定相中的質(zhì)量與在流動(dòng)相中質(zhì)量 的比值。也稱為質(zhì)量分配系數(shù)。拖尾因

23、子：T=W0.05h/2A 。0.95-1.05之間為對(duì)稱峰，小于 0.95為前延峰，大于 1.05為拖尾峰。質(zhì)譜分析法(mass spectrometry)將: 分和結(jié)構(gòu)分析的一種分析方法?；衔镄纬呻x子和碎片離子，按其質(zhì)荷比(/值)的不同進(jìn)行分離測(cè)定，來(lái)進(jìn)行成蛋白質(zhì)質(zhì)譜:是通過(guò)電離源將蛋白質(zhì)分子轉(zhuǎn)化為氣相離子，然后利用質(zhì)譜分析儀的電場(chǎng)、磁場(chǎng)將具有特定質(zhì)量與電荷比值(/值)的蛋白質(zhì)離子分離開(kāi)來(lái)，經(jīng)過(guò)離子檢測(cè)器收集分離的離子，確定離子的/值，分析鑒定已知或未知蛋白質(zhì)。質(zhì)譜儀至少由以下四部分組成：進(jìn)樣系統(tǒng)按電離方式的需要，將樣品送入離子源的適當(dāng)部位；離子源用來(lái)使樣品分子電離生成離子，并使生成的離

24、子會(huì)聚成有一定能量和幾何形狀的離子束；質(zhì)量分析器利用電磁場(chǎng)（包括磁場(chǎng)、磁場(chǎng)和電場(chǎng)的組合、高頻電場(chǎng)和高頻脈沖電場(chǎng)等）的作用將來(lái)自離子源的離子束中不同質(zhì)荷比的離子按空間位置，時(shí)間先后或運(yùn)動(dòng)軌道穩(wěn)定與否等形式進(jìn)行分離；檢測(cè)器用來(lái)接受、檢測(cè)和記錄被分離后的離子信號(hào)。離子源的功能 是將進(jìn)樣系統(tǒng)引入的氣態(tài)樣品分子轉(zhuǎn)化成離子。由于離子化所需要的能量隨分子不同差異很大，因此， 對(duì)于不同的分子應(yīng)選擇不同的離解方法。硬電離方法能給樣品較大能量的電離方法軟電離方法給樣品較小能量的電離方法，該方法適用于不穩(wěn)定或易電離的樣品。電噴霧離子化技術(shù)（electrospray ionizati，onESI）利用強(qiáng)靜電場(chǎng)從溶液直

25、接產(chǎn)生氣態(tài)離子化分子的電離方式。ESI 可以與液相色譜、高效液相色譜、毛細(xì)管 IEF 以及毛細(xì)管電泳等多種進(jìn)樣器聯(lián)用。ESI-MS 特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：解決了極性大、熱不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)與多肽分子的離子化和大分子質(zhì)量、一級(jí)結(jié)構(gòu)和共價(jià)修飾位點(diǎn)的測(cè)定問(wèn)題， 并可用于研究 DNA 與藥物、金屬離子、蛋白質(zhì)和抗原與抗體的相互作用。缺點(diǎn)：樣品中的鹽類對(duì)樣品結(jié)果影響很大，而且單個(gè)分子帶電荷不同可形成多種離子分子峰（重疊峰），所以對(duì)混合物的圖譜解析比較困難?；|(zhì)輔助激光解析電離(matrix-assisted laser desorption ionization,MALDI)待檢樣品與含有在特定波長(zhǎng)下吸光的發(fā)光團(tuán)的化學(xué)

26、基質(zhì)(matrix混) 合，此樣品混合物隨即滴于一平板或載玻片上進(jìn)行揮發(fā)，樣品混合物殘余水份和溶劑的揮發(fā)使樣品整合于格狀晶體中，樣品然后置于激光離子發(fā)生器(lasersourc。e)激光作用于樣品混合物，使化學(xué)基質(zhì)吸收光子而被激活。此激活產(chǎn)生的能量作用于多肽，使之由固態(tài)樣品混合物變成氣態(tài)。MALDI-MS特點(diǎn)對(duì)于一些分子量較大(1000000Da)或疏水性強(qiáng)的蛋白質(zhì)，MALDI比 ESI 更有效。MALDI能有效地分析較復(fù)雜的肽混合物或物理化學(xué)性質(zhì)相差較大的蛋白質(zhì)混合物。只要能與所選擇的底物形成穩(wěn)定的分散體系的樣品都能用 MALDI進(jìn)行分析。MALDI不受樣品所含的添加物、緩沖液或鹽的影響，且

27、靈敏度也比別的離子化方式高。核磁共振光譜學(xué).具有非零自旋量子數(shù)的原子核具有自旋角動(dòng)量,因而也就具有磁矩, 例如象 1H, 31P, 13C, 15N 等原子核.磁矩是一矢量. 如果含有此類核的物質(zhì)置放于磁場(chǎng)中 ,原來(lái)無(wú)規(guī)則的磁矩矢量會(huì)重新排列而平行于外加的磁場(chǎng) .與外磁場(chǎng)同向和反向的磁矢量符合 Boltzmann分布.在數(shù)量上同向與反向的差別很小,但正是這一微小的差別造就了核磁共振光譜學(xué).x-射線衍射技術(shù)和 NMR技術(shù)在研究蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)中的優(yōu)缺點(diǎn)? x-射線衍射技術(shù)固體狀態(tài)，可以測(cè)定中-大蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，技術(shù)更成熟；需結(jié)晶，經(jīng)常存在相位問(wèn)題。NMR技術(shù)溶液狀態(tài)，接近生理狀態(tài)，不需結(jié)晶，可研究蛋白

28、質(zhì)動(dòng)力學(xué)過(guò)程，可以較方便地研究蛋白質(zhì)-配體相互作用；只能測(cè)定小-中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，技術(shù)還在發(fā)展。蛋白質(zhì)類藥物分析來(lái)源：天然來(lái)源(提取)；化學(xué)合成或者半合成；現(xiàn)代生物技術(shù)制備。近年來(lái) SFDA批準(zhǔn)的生物技術(shù)藥物：干擾素（1b，2b，2a，）；白細(xì)胞介素-11；重組人胰島素、重組甘精胰島素注射液、重組賴脯胰島素注射液；白細(xì)胞介素 -2；G-集落刺激因子、GM- 集落刺激因子；腫瘤壞死因子-；紅細(xì)胞生成素；鏈激酶、葡激酶；人、牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、重組人表皮生長(zhǎng)因子。氨基酸重要化學(xué)反應(yīng)：*a. 與茚三酮反應(yīng):用于氨基酸定量定性測(cè)定.b. 與 2,4一二硝基氟苯(DNFB) 的反應(yīng)（sanger反應(yīng)）

29、:用于蛋白質(zhì) N-端測(cè)定.c. 與苯異硫氰酯（PITC ）的反應(yīng)（ Edman反應(yīng)）：用于蛋白 N-端測(cè)定，蛋白質(zhì)順序測(cè)定儀設(shè)計(jì)原理的依據(jù)。蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)：兩性解離性質(zhì)及等電點(diǎn)： 蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)； 蛋白質(zhì)的沉淀；蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性；蛋白質(zhì)的紫外吸收特性； 蛋白質(zhì)呈色反應(yīng)。氨基酸組成分析的步驟：水解，衍生（柱前衍生化和柱后衍生化），色譜流程：樣品陽(yáng)離子交換柱衍生化（茚三酮）檢測(cè)柱后衍生化：將水解后的氨基酸樣品經(jīng)過(guò)離子交換柱分離。原理：1.氨基酸具有不同的酸堿性，極性，可用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂在色譜柱上進(jìn)行吸附，用不同PH 和離子強(qiáng)度的緩沖液依次將它們洗脫；2.酸性氨基酸對(duì)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的親和力最弱，

30、先洗脫下來(lái)； 3. 中性氨基酸對(duì)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的親 和力次弱，跟著洗脫下來(lái)；4. 堿性氨基酸對(duì)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的親和力最強(qiáng)，最后被洗脫下來(lái)；5.洗脫后用茚三酮顯色， 進(jìn)行定量測(cè)定。蛋白質(zhì)常用的水解方法：酸性水解（鹽酸水解和磺酸水解）；堿性水解；酶水解；微波輻射能水解；膜上蛋白質(zhì)印跡樣品的水解（原位分析）。鹽酸水解得到除色氨酸和胱氨酸外的氨基酸；堿性水解得穩(wěn)定色氨酸。幾種常見(jiàn)的氨基酸分析方法： 1、茚三酮反應(yīng)2、熒光胺法3、鄰苯二甲醛(OPA)法4、PTC-AA分析法5、Dansyl-Cl（DNS-Cl ）法6、磺酰氯二甲胺偶氮苯（Dabsyl-Cl）法蛋白質(zhì)的 N-末端的測(cè)定1、二硝基氟苯法（D

31、NFB法、Sanger法）2、二甲氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl 法）3、異硫氰酸苯酯法（PITC 法）4、DABITC法5、氨肽酶法蛋白質(zhì)的 C 末端的測(cè)定1、羧肽酶法2、硼.氫化鋰法（LiBH4 法，還原法）3、肼解法蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定:采用 圓二色光譜 測(cè)定溶液狀態(tài)下的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)含量。蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定X 射線衍射法和核磁共振技術(shù) 是研究蛋白質(zhì)三維空間結(jié)構(gòu)最準(zhǔn)確的方法。蛋白質(zhì)純度檢查： 非還原SDS-PAGE電泳法 和 HPLC 法 (分子篩層析、反相 HPLC 、離子交換層析等)蛋白質(zhì)含量測(cè)定Folin酚- 試劑法(Lowry 法)、染色法(Bradford法)、雙縮脲法、紫外吸收法

32、、HPLC法和凱氏定氮 ELISA 法考馬斯量藍(lán) G250BCA 法（4-甲酸喹啉法）等方法。凱氏定氮法原理：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)與濃硫酸共熱時(shí)，被氧化為二氧化碳和水，而氮轉(zhuǎn)化為氨，氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨，稱 為“消化”。硫酸銅用作催化劑。消化液轉(zhuǎn)入凱氏定氮儀反應(yīng)室中，加入過(guò)量濃氫氧化鈉，使硫酸銨分解放出氨，將氨驅(qū)入過(guò)量的標(biāo)準(zhǔn)硼酸溶液中，用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸進(jìn)行滴定。雙縮脲法原理：蛋白質(zhì)含有兩個(gè)以上的肽鍵。在堿性溶液中與Cu2+ 形成紫紅色絡(luò)合物，其顏色的深淺與蛋白質(zhì)的含量成正比。540nm 比色。福林酚法原理：蛋白質(zhì)用堿性銅溶液（酚試劑）處理，使其形成銅蛋白質(zhì)絡(luò)合物。該絡(luò)合物中的酪氨酸，色氨酸能還原磷鉬酸-磷鎢酸試

33、劑（Folin試劑），產(chǎn)生深藍(lán)色。660nm 比色。蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定 ：還原型 SDS-PAGE 法測(cè)定；凝膠過(guò)濾(分子篩)法：根據(jù)蛋白分子大小和形狀進(jìn)行測(cè)定，誤差比 SDS-PAGE 大；質(zhì)譜法；梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳。梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳原理 ：在梯度凝膠電泳中，蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中向著凝膠濃度逐漸增高的方向即孔徑逐漸減小的方向遷移，隨著電泳的繼續(xù)進(jìn)行，蛋白質(zhì)受到孔徑的阻力越來(lái)越大。在梯度凝膠電泳中，蛋白質(zhì)的最終遷移位置 僅取決于它本身分子的大小，與蛋白質(zhì)電荷密度無(wú)關(guān)。蛋白質(zhì)的相對(duì)遷移率與其分子量的對(duì)數(shù)在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān) 系。肽圖常用的分析方法有：（1）SDS-PAGE 電泳（2）反相

34、 HPLC(RP-HPLC) （3）毛細(xì)管電泳（4）液質(zhì)分析。糖蛋白的糖基化分析 : 糖基化位點(diǎn),分子量,糖的組成,連接方式,分析方法: 酶解,質(zhì)譜,LC/MS,GC/MS宿主細(xì)胞蛋白含量：雙抗體夾心 ELISA概念：宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)一般簡(jiǎn)稱宿主蛋白，是指生產(chǎn)過(guò)程中來(lái)自宿主或培養(yǎng)基的殘留肽等雜質(zhì)?；蚬こ趟幬镏械乃拗鞯鞍缀?，可用 ELISA 法測(cè)定。測(cè)定方法 包被；加樣；加抗體；檢測(cè)。*宿主細(xì)胞 DNA 殘留量測(cè)定方法概念：供試品中的DNA 經(jīng)變性為單鏈后吸附與固相膜上，在一定溫度下?？膳c相匹配的單鏈 DNA 復(fù)性而重新結(jié)合成雙鏈 DNA ，稱為“雜交”。將特異性 DNA 探針標(biāo)記后，與吸附在

35、固相膜上的供試品單鏈 DNA 雜交，并使用與標(biāo)記物相應(yīng)的顯示系統(tǒng)顯示雜交結(jié)果，與已知含量的陽(yáng)性 DNA 對(duì)照對(duì)比后，可測(cè)定供試品中外源性 DNA 的含量。*宿主細(xì)胞 DNA殘留量測(cè)定方法： 標(biāo)記 ；雜交；免疫檢測(cè)蛋白質(zhì)最終產(chǎn)品的控制*1物理化學(xué)鑒定（1）氨基酸組成（2）氨基酸末端序列 N-端和C-端氨基酸（3）肽譜（4）巰基和二硫鍵巰基和/或二硫鍵的數(shù)量和位置（5）碳水化合物結(jié)構(gòu)中性糖、氨基糖、唾液酸（6）分子量應(yīng)用分子篩層析法、SDS-PAGE（還原和/或非還原條件下）、質(zhì)譜測(cè)定法（7）等電點(diǎn) 通過(guò)等電聚焦電泳或其他適當(dāng)?shù)姆椒y(cè)定。（8）消光系數(shù)（或克分子吸光度）（9）電泳圖型（10）液相層

36、析圖譜 分子篩層析、反相液相層析、離子交換液相層析、親和層析獲得目的產(chǎn)品/藥物的一致性、同一性和純度的層析圖譜和數(shù)據(jù) （11）光譜分析2. 雜質(zhì)檢查（1）工藝相關(guān)雜質(zhì)（2）產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)3. 生物學(xué)測(cè)定（1）鑒別試驗(yàn)應(yīng)用免疫印跡法（2）效價(jià)測(cè)定（3）特異比活性測(cè)定（4）熱原質(zhì)試驗(yàn)（5）無(wú)菌試驗(yàn)（6）抗原性物質(zhì)檢查（7）異常毒性試驗(yàn)氨基酸定量法：茚三酮法，三硝基苯磺酸法，銅復(fù)合物紫外吸收法，甲醛滴定法，非水溶液滴定法，雙波長(zhǎng)分光光度法，導(dǎo)數(shù)分光光度法，HPLC 。*茚三酮法：茚三酮在酸性條件下和氨基酸反應(yīng)，氨基酸被氧化分解生成醛，放出氨和二氧化碳，還原型茚三酮。還原型茚三酮與氨及另一分子茚三酮縮合

37、生成藍(lán)紫色的物質(zhì)。最大吸收值波長(zhǎng) 570nm.*甲醛滴定法：在 PH 中性下，甲醛迅速與氨基酸上的氨基結(jié)合，使平衡向右移動(dòng)，促使氫離子釋放，使溶液酸度增加。每釋放出一個(gè)氫離子，相當(dāng)有一個(gè)氨基酸。(成品測(cè)定)非水溶液滴定法：是氨基酸在冰醋酸中用高氯酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定其含量。適合成品測(cè)定)，有直接滴定法和回滴法。合成多肽藥物類藥物分析化學(xué)合成多肽分類:純天然多肽；經(jīng)結(jié)構(gòu)修飾的天然多肽；人工設(shè)計(jì)出的多肽。制備方法：液相合成和固相合成液相合成的優(yōu)點(diǎn):中間產(chǎn)物純化、中間產(chǎn)物的理化常數(shù)、可以隨意進(jìn)行非氨基酸修飾、可以避免氨基酸缺失。缺點(diǎn)：是較為費(fèi)時(shí)、費(fèi)力等。固相合成優(yōu)點(diǎn)：是簡(jiǎn)化了每步反應(yīng)的后處理操作，避免因

38、手工操作和物料轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生的損失，產(chǎn)率較高且能夠?qū)崿F(xiàn)自動(dòng)化等。缺點(diǎn)：是每步中間產(chǎn)物不可以純化，必須采用較大的氨基酸過(guò)量投料，粗品純度不如液相合成物，必需通過(guò)可靠的分離手段進(jìn)行純化等。液相合成法較適于合成 短肽；固相合成法更適于合成 中、長(zhǎng)肽 。多肽藥物不穩(wěn)定的原因:水解、氧化、外消旋化、二硫鍵的斷裂及重排、消除、凝聚、沉淀、吸附等。結(jié)構(gòu)確證研究1. 短肽 ：元素分析、紅外光譜、核磁共振譜、氨基酸組成分析、質(zhì)譜等常見(jiàn)方法，氨基酸序列測(cè)定。2. 中、長(zhǎng)肽 ：氨基酸組成，氨基酸序列分析。（Edman 降解，質(zhì)譜：分子量及其序列信息，是對(duì) Edman 降解的很好補(bǔ)充。）原料藥的質(zhì)量研究項(xiàng)目一般包括：外觀

39、性狀、理化常數(shù)、鑒別、氨基酸組成分析、水分、反離子含量、純度、有機(jī)溶劑和反應(yīng)試劑殘留量、生物學(xué)安全性檢查、含量和/或活性效價(jià)測(cè)定等。相關(guān)肽檢查（或稱有關(guān)物質(zhì)檢查）：RP-HPLC ，（HPIEC ）、毛細(xì)管電泳技術(shù)，高效分子排阻色譜（ HPSEC ）、（PAGE ）以及激光散射粒度測(cè)定等技術(shù)。酶類藥物分析酶的分類：氧化還原酶;轉(zhuǎn)移酶；水解酶；裂合酶；異構(gòu)酶；合成酶（或稱連接酶）酶活力單位定義：在規(guī)定的條件下，每分鐘能轉(zhuǎn)化 1mol 底物所需要的酶量，稱一個(gè)酶的活力單位。酶的比活力每毫克酶蛋白所含酶活力，U/mg 。*酶活性測(cè)定影響因素 ：底物；pH ；溫度；酶濃度 ；空白和對(duì)照。以 Km 最小

40、者作為此酶的生理底物底物與產(chǎn)物的測(cè)定方法 （酶反應(yīng)的檢測(cè)方法）1、化學(xué)方法：用化學(xué)法測(cè)定其中某一底物或產(chǎn)物的變化值。2、分光光度法： 常用的有比色法和紫外分光光度法。3、熒光測(cè)定法： 簡(jiǎn)單、靈敏、快速。4、電化學(xué)分析法（1）離子選擇性電極分析法（2）微電流法5、其他方法：如測(cè)定氣體的測(cè)壓法，測(cè)定產(chǎn)物旋光度變化值的旋光測(cè)定法。酶活力測(cè)定方法（固定時(shí)間法，連續(xù)監(jiān)測(cè)法，固定濃度法）1. 固定時(shí)間法在適宜的條件下，使酶和底物共同保溫 一定時(shí)間 ，然后測(cè)定 產(chǎn)物生成的量或底物消耗的量 ，從而計(jì)算出酶的含量（或活力）。2.連續(xù)監(jiān)測(cè)法在酶反應(yīng)過(guò)程中，連續(xù)記錄不同時(shí)間的底物消耗量或產(chǎn)物生成量。（一）、需 NA

41、D+ 或 NADP+作指示的連續(xù)監(jiān)測(cè)法：直接測(cè)定法 ；偶聯(lián)法 ； 三聯(lián)酶活測(cè)定還原型輔酶（NADH和 NADPH）在 340nm 處有紫外吸收，氧化型輔酶（NAD+ 和 NADP+ ）在 340nm 處無(wú)紫外吸收.利用 340nm 處每分鐘吸收度升高或降低的速率與酶活性成正比的關(guān)系，推算出酶的活力單位。A. 直接測(cè)定法大多數(shù)需 NADH （NADPH ）參加的脫氫酶，可利用紫外分光光度法直接測(cè)定反應(yīng)體系在 340nm 處吸收度的變化， 計(jì)算酶活力單位。B. 偶聯(lián)法此類酶催化反應(yīng)不需 NAD+ 或 NADP+ ，但當(dāng)與需 NAD+ 或 NADP+ 的脫氫酶反應(yīng)偶聯(lián)以后，能用紫外分光光度法測(cè)定.C

42、. 三聯(lián)酶活測(cè)定引入一個(gè)輔助酶反應(yīng)，將被測(cè)酶反應(yīng)系統(tǒng)與指示酶反應(yīng)系統(tǒng)聯(lián)系起來(lái)，組成一個(gè)“三合一”酶反應(yīng)系統(tǒng)，使底物轉(zhuǎn)化率、輔助酶反應(yīng)和 NADH （NADPH ）氧化速率之間成正比函數(shù)關(guān)系，輔助酶和指示酶的活力必須大大超過(guò)測(cè)定酶活力。（二）、不需 NAD+ 或 NADP+作指示的連續(xù)監(jiān)測(cè)法：酶底物大多是人工合成的“色素元”，其本身無(wú)色，經(jīng) 酶作用后釋放出有色的反應(yīng)產(chǎn)物 。根據(jù)反應(yīng)過(guò)程中吸收度增高速率，算出酶活力單位。3.固定濃度法根據(jù)酶催化反應(yīng)，使 反應(yīng)產(chǎn)物 達(dá)到額定的濃度時(shí)其反應(yīng)時(shí)間與酶濃度成反比的原理進(jìn)行設(shè)計(jì)的。正交設(shè)計(jì)多因素選擇正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)（Orthogonal experimental

43、design）是一種高效的利用正交表來(lái)安排多因素多水平設(shè)計(jì)試驗(yàn)的方法。通過(guò)巧妙的安排和分組，用較少的試驗(yàn)次數(shù)，就能分析各因素的作用大小，找出最佳的試驗(yàn)條件。利用各因素所對(duì)應(yīng)指標(biāo)的極差 R 及平均極差 D 作出判斷。*酶類藥物的檢測(cè) （底物，原理，靶點(diǎn)）1. 肽鍵水解酶 ：1、胰蛋白酶 2、彈性蛋白酶 3、尿激酶（氣泡上升法）*胰蛋白酶原理胰蛋白酶專一作用于 賴氨酸、精氨酸 等堿性氨基酸的羧基組成的肽鍵、酰胺鍵及酯鍵，水解速度為酯鍵>酰胺鍵> 肽鍵。底物：BAEE；BAA苯甲酰L精氨酸乙酯（BAEE ）在胰蛋白酶的作用下， 酯鍵 被水解生成苯甲酰L精氨酸，在 253nm 波長(zhǎng)處的吸收

44、度隨酶促反應(yīng)遞增，因此連續(xù)記錄不同時(shí)間的產(chǎn)物生產(chǎn)量，根據(jù)活力單位定義計(jì)算酶活力。*胰彈性蛋白酶（肽鍵水解酶） 底物：剛果紅彈性蛋白胰彈性蛋白酶測(cè)定原理剛果紅彈性蛋白法：以剛果紅彈性蛋白為底物，由于剛果紅彈性蛋白結(jié)合的共價(jià)鍵能被彈性酶水解，根據(jù)剛果紅在 495nm 處有最大吸收，由標(biāo)準(zhǔn)曲線即可查得彈性酶單位數(shù)。單位：20 分鐘水解 1mg 剛果紅彈性蛋白所需的酶量為一個(gè)彈性酶活力單位。尿激酶（堿性蛋白水解酶）作用于纖維蛋白溶解酶原的賴氨酸或精氨酸鍵使其裂解成纖維蛋白溶解酶。效價(jià)測(cè)定原理(氣泡上升法)尿激酶激活人體內(nèi)纖維蛋白溶酶原使其轉(zhuǎn)化成纖維蛋白溶酶；纖維蛋白原在凝血酶的作用下，轉(zhuǎn)變成纖維蛋白凝

45、塊，此凝塊在纖維蛋白溶酶作用下，水解為可溶性小分子多肽。在纖維蛋白溶酶原過(guò)量的情況下，尿激酶量與纖維蛋白凝塊的溶解時(shí)間的對(duì)數(shù)成直線關(guān)系。反應(yīng)系統(tǒng)應(yīng)在 3045 秒內(nèi)凝結(jié)，當(dāng)凝塊內(nèi)小氣泡上升到系統(tǒng)體積一半時(shí)作為反應(yīng)終點(diǎn)。以尿激酶的濃度為橫坐標(biāo)，以反應(yīng)時(shí)間的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)。底物：纖維蛋白溶酶原2. 脂鍵水解酶胰脂肪酶底物: 橄欖油3. 糖苷鍵水解酶 溶菌酶（能分解粘多糖的堿性水解酶）效價(jià)測(cè)定 比濁法底物: 溶酶小球菌以 溶酶小球菌 為底物，主要成分為粘多糖，粘多糖由 NAG和 NAM重復(fù)而成。只能水解 NAM C1和 NAG C4之間的1，4 糖苷鍵。4. 超氧化物歧化酶 SOD測(cè)定方法：間接法：使

46、用氧自由基指示清除劑， SOD與指示清除劑競(jìng)爭(zhēng) O2- ，從而抑制指示清除劑與 O2- 的結(jié)合，根據(jù)指示清除劑與 O2- 反應(yīng)速度的變化可間接測(cè)定 SOD 的活性。間接法包括：黃嘌呤氧化酶細(xì)胞色素 C 法和鄰苯三酚法。*黃嘌呤氧化酶細(xì)胞色素 C 法原理：在有氧條件下，黃嘌呤氧化酶能催化黃嘌呤成尿酸，與此同時(shí)產(chǎn)生O2- ，氧化型細(xì)胞色素C 被 O2- 還原為還原型細(xì)胞色素 C ，后者在 550nm 有最大吸收，因此測(cè)定氧化性細(xì)胞色素 C 在加入 SOD 前后的光吸收變化可間接計(jì)算酶活性。鄰苯三酚法原理：在堿性條件下，鄰苯三酚會(huì)發(fā)生自氧化生成紅 棓酚，同時(shí)生成 O2- ，當(dāng)有 SOD存在時(shí)由于它能

47、催化O2- 與 H+ 結(jié)合生成 O2 和 H2O2 ，從而阻止了中間產(chǎn)物的積累。定義:在一定條件下， 每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達(dá) 50的酶量 為一個(gè)酶活力單位。多糖類藥物分析多糖的理化性質(zhì): 旋光性 ; 硫酸蒽酮反應(yīng)（620nm ）硫酸苯酚反應(yīng)(490nm) ;氨基己糖乙酰丙酮(525nm) 糖; 醛酸硫酸咔唑(520nm) .多糖的純度測(cè)定：超離心法，電泳法，凝膠色譜法，旋光法。多糖的分子量測(cè)定1. 凝膠層析法 ：將分子量不同的蛋白質(zhì)通過(guò)一定孔徑的凝膠固定相，由于各組分流經(jīng)體積的差異，使不同分子量的組分得以分離。最先淋出的是最大的分子。Sephadex G-200，多糖標(biāo)準(zhǔn)品。分部收集，

48、硫酸-苯酚檢測(cè)，分別求得洗脫體積 Ve， Ve 與 1gM 之間存在著線性關(guān)系， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。Ve=-KlogM+C將待測(cè)樣品上柱，待測(cè)多糖 Ve。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出待測(cè)多糖分子量。2. 粘度法3. 超離心法4. 高效液相色譜（重均分子量）色譜條件： 凝膠柱（分子量大?。?，示差折光檢測(cè)器。標(biāo)準(zhǔn)曲線：LogMW = a+b tRMW為重均分子量，tR 為保留時(shí)間待測(cè)多糖分子量 （重均分子量）Mw= (RIiMi)/RIiMi 為供試品在保留時(shí)間 ti時(shí)的分子量，RIi在第 i部分中被洗脫物質(zhì)的量（重量）。多糖的含量測(cè)定比色法（硫酸咔唑法、乙酰丙酮法、硫酸苯酚法、蒽酮法） 生物測(cè)定法（肝素鈉）生色

49、底物法（低分子量肝素鈉） 1.乙酰丙酮法氨基己糖原理：氨基己糖在堿性條件下加熱，可與乙酰丙酮縮合成吡咯衍生物，該衍生物與對(duì)二甲氨基苯甲醛反應(yīng)，反應(yīng)物呈紅色，于 525nm 測(cè)定吸收度。2.硫酸咔唑法測(cè)糖含量（己糖醛酸測(cè)定）在濃硫酸中，己糖醛酸與咔唑溶液反應(yīng)生成的反應(yīng)物呈紅色。520nm 比色3.硫酸苯酚法測(cè)定糖含量（總糖）原理：多糖在濃硫酸作用下水解成單糖，該單糖在強(qiáng)酸性條件下，與苯酚反應(yīng)生成橙色衍生物。它在 490nm 處有最大吸收，其吸光度與濃度呈線性關(guān)系。4.蒽酮法測(cè)定糖含量（總糖）原理：多糖在濃硫酸中水解后，進(jìn)一步脫水生產(chǎn)糠醛類衍生物，與蒽酮作用形成藍(lán)色化合物，620nm 進(jìn)行比色測(cè)定

50、。*生色底物法原理肝素、低分子肝素當(dāng)?shù)鞍酌福‵a）從生色底物分裂出 pNA 時(shí)，發(fā)色物的產(chǎn)生量 與剩余的酶量成正比，與 肝素效價(jià)成反比 。405 nm 測(cè)定。（pNA 對(duì)硝基苯胺）酰胺分解法當(dāng)?shù)鞍酌笍纳孜锓至殉?pNA 時(shí)，發(fā)色物的產(chǎn)生量與剩余的酶量成正比，與 肝素效價(jià) 成 反比 。405 nm測(cè)定。*生色底物法(抗 Xa 因子活性測(cè)定 )以溶液吸收度和濃度的對(duì)數(shù)，照生物檢定統(tǒng)計(jì)法中 量反應(yīng)平行線 測(cè)定法計(jì)算出供試品的抗 Xa 因子活性. 生色底物：Bz：苯甲酰，Pip：哌啶酰， Tos：甲苯磺酰；對(duì)-硝基苯胺（pNA ）。多糖類藥物的結(jié)構(gòu)分析1. 糖苷鍵連接方式的測(cè)定 A.紅外光譜糖苷鍵

51、類型確定吡喃糖糖苷鍵時(shí)，用紅外光譜，在 890cm-1 處有特征吸收者，示有-型糖苷鍵在 840cm-1 處有特征吸收者，示有-型糖苷鍵。B.核磁共振譜糖苷鍵（型或型）。2. 糖苷鍵連接位置的測(cè)定*（一）、高碘酸氧化、Smith 降解原理：選擇性的氧化降解反應(yīng)，能夠作用于多糖分子中 1，2二羥基和 1，2，3三羥基，生成 過(guò)碘酸氧化產(chǎn)物 ； 此產(chǎn)物用 硼氫化鈉 還原后，再用酸水解，生成相應(yīng)的醛、甲酸。室溫下用 稀無(wú)機(jī)酸 水解還原產(chǎn)物。A. 1，2 連接的糖苷鍵1，2 連接的糖苷鍵經(jīng) 高碘酸氧化 后的產(chǎn)物用 硼氫化鈉還原 得到穩(wěn)定的多羥基化合物，再用 稀鹽酸 水解，得到甘油及甘油醛。B. 1，3

52、 連接的糖苷鍵1，3 連接的糖苷鍵與高碘酸不起反應(yīng)，經(jīng)還原與水解后得到原來(lái)的 單糖 。C. 1，4 連接的糖苷鍵1，4 連接的糖苷鍵經(jīng)高碘酸氧化后的產(chǎn)物用硼氫化鈉還原，用稀鹽酸水解得到最終產(chǎn)物為赤蘚醇和乙醇醛。D. 1，6 連接的糖苷鍵1，6 連接的糖苷鍵經(jīng)高碘酸氧化后的產(chǎn)物用硼氫化鈉還原得到穩(wěn)定的多羥基化合物，再用稀鹽酸水解，得到甘油及乙醇醛。（二）、甲基化反應(yīng)產(chǎn)物分析原理：多糖經(jīng)甲基化試劑作用使分子中的羥基甲基化，然后用甲酸和三氟醋酸水解，以 氣相色譜 鑒定甲基化水解產(chǎn)物。如多糖分子中帶有支鏈，甲基化水解后可生成 二甲基單糖 。（三）、乙酰解后質(zhì)譜分析原理：多糖經(jīng)過(guò)乙酰化反應(yīng)（醋酐、冰醋酸

53、）生成乙?；瘑翁呛凸烟恰Ｓ寐确鲁樘?，蒸去氯仿，進(jìn)行質(zhì)譜分析。分子離子峰如有二乙酰葡萄糖或二乙酰單糖碎片峰，表明有支鏈結(jié)構(gòu)。抗生素類藥物分析*微生物檢定法定義：是利用微生物發(fā)育時(shí)對(duì)某些物質(zhì)的特殊依賴性，按這些物質(zhì)對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響，對(duì)他們作出定量鑒定的方法。*微生物檢定法可分為三類：稀釋法；比濁法 ；瓊脂擴(kuò)散法（管碟法）。*牛津單位:抑制 50 毫升肉湯培養(yǎng)基中金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的青霉素的最低含量為一個(gè)牛津單位.一個(gè)牛津單位相當(dāng)于 0.6ug的青霉素鈉鹽所具有的抗生活力，1mg 青霉素G 鈉鹽含有 1667 個(gè)牛津單位,(IU)（一）稀釋單位 (u/ml，u/mg)將 1mg 抗生素配成溶液，在

54、一定條件下進(jìn)行稀釋，對(duì)某一細(xì)菌能抑制其生長(zhǎng)的最高稀釋度，即為1mg 抗生素中可含有的單位。（二）重量單位 (u/mg)以抗生物有效成分（即生理活性部分）的重量作為抗生素的單位。稱重量單位.1 類似重量單位: 以抗生素鹽類純品的重量為單位。包括無(wú)生物活性的酸根和金屬離子。2 重量折算單位：以與原始的生物活性相當(dāng)?shù)募兛股貙?shí)際重量為一個(gè)單位，3 特定單位 ：以特定抗生素某一批產(chǎn)品的某一重量為一個(gè)單位，經(jīng)有關(guān)國(guó)家權(quán)威機(jī)構(gòu)認(rèn)可而定.效價(jià)測(cè)定的方法：稀釋法；比濁法；瓊脂擴(kuò)散法。稀釋法原理 ：用液體培養(yǎng)基逐級(jí)將抗生素稀釋，在各管中加入等量的試驗(yàn)菌液，進(jìn)行培養(yǎng)，觀察抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低抗生素濃度，再與同法測(cè)定

55、的標(biāo)準(zhǔn)品終點(diǎn)作比較，從而求得被測(cè)抗生素的效價(jià)。比濁法原理 ：將一定量的抗生素加至接種有試驗(yàn)微生物的液體培養(yǎng)基內(nèi)，混勻后，經(jīng)短期培養(yǎng)（約 3-4h），測(cè)量培養(yǎng)基濁度，其濁度與細(xì)菌數(shù)、細(xì)菌群體質(zhì)量存在直接關(guān)系，在一定的范圍內(nèi)符合比耳定律。細(xì)菌數(shù)、細(xì)菌群體質(zhì)量又直 接受抗生素效價(jià)的影響。影響因素：一、影響比濁法的物理因素：1、散射現(xiàn)象 2、菌液濃度 3、細(xì)菌體大小的變化二、培養(yǎng)基：在沒(méi)有外加抑制劑的情況下，菌體的生長(zhǎng)受培養(yǎng)基的成分、酸度、培養(yǎng)溫度、通氣等條件影響。三、培養(yǎng)：溫度、振搖。一般培養(yǎng)時(shí)間 3 小時(shí)，可縮短為 2 小時(shí)。*管碟法原理: 抗生素在涂布特定菌的瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)擴(kuò)散，形成一定濃度抗生素

56、的 球型區(qū) ，抑制試驗(yàn)菌生長(zhǎng)，通過(guò)透明培養(yǎng)基觀察抑菌圈， 抗生素劑量的對(duì)數(shù)與抑菌圈面積或直徑成正比 。在同樣條件下將已知效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)品溶液與未知效價(jià)的供試品溶液的劑量反應(yīng)(抑菌圈)進(jìn)行比較；當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品和供試品是屬于同一性質(zhì)的抗生素時(shí) ，標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液對(duì)一定試驗(yàn)菌所得的劑量反應(yīng)曲線，在一定劑量范圍內(nèi)應(yīng)互相平行。根據(jù)以上原理，可設(shè)計(jì)為一劑量法、 二劑量法 及三劑量法。從而可以較為準(zhǔn)確地測(cè)定供試品的效價(jià)。log M(1 /9 .21 DT )r 2log C4 DTH)T = 擴(kuò)散時(shí)間M = 抗生素在管中的量L = 管的高度H = 培養(yǎng)基的厚度D = 擴(kuò)散系數(shù)r = 抑菌圈半徑c = 最低抑菌濃度影響抑菌圈半徑的因素： D 的影響因素 ：抗生素本身結(jié)構(gòu)、分子量等，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單者容易擴(kuò)散，分子量大的擴(kuò)散就慢，雜質(zhì) ：抗生素或培養(yǎng)基中含有雜質(zhì)，雜質(zhì)本身也有擴(kuò)散系統(tǒng)，看干擾抗生素的擴(kuò)散，影響抑菌圈的大小和清晰度。瓊脂含量