生物測定技術(shù)

1、第四章 除草劑生物測定技術(shù) u除草劑生物測定的意義 u除草劑生物測定的基本原理 u除草劑生物測定技術(shù)程序和原則u除草劑生物測定方法簡介u除草劑田間藥效試驗一、除草劑生物測定的意義一、除草劑生物測定的意義v生物測定是除草劑研究種不可缺少的手段生物測定是除草劑研究種不可缺少的手段v某種化合物是否具有殺草活性某種化合物是否具有殺草活性v為特定雜草篩選一種除草劑為特定雜草篩選一種除草劑v除草劑作用方式的研究除草劑作用方式的研究 二、除草劑生物測定的基本原理二、除草劑生物測定的基本原理 試驗均在同一控制條件下試驗均在同一控制條件下必須設(shè)對照，每一處理重復(fù)必須設(shè)對照，每一處理重復(fù)34次次試材應(yīng)該健壯、整齊

2、、隨機排列試材應(yīng)該健壯、整齊、隨機排列測定結(jié)果應(yīng)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析測定結(jié)果應(yīng)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析在一定范圍內(nèi)，生物試材與除草劑濃度在一定范圍內(nèi)，生物試材與除草劑濃度成比例的傷害反應(yīng)成比例的傷害反應(yīng)三、除草劑生物測定技術(shù)的程序和原則三、除草劑生物測定技術(shù)的程序和原則 （）生物測定材料的選擇試材的選擇應(yīng)兼?zhèn)鋵λ巹┹^感性高和具有一定的可測范圍以及大量易得的均一材料。（二）測定參數(shù)的選擇試材對除草劑的反應(yīng)可以通過各種參數(shù)來評價。除草劑對植物的影響一般為非專一性的，因此，各種器官均能作為某一除草劑的活力指標(biāo)。 種子發(fā)芽率許多除草劑可抑制敏感種子的發(fā)芽及胚根和芽鞘的生長、因此，可以利用觀察種子的萌發(fā)率來測定某種藥劑

3、的存在與否。 植株生長量在生物測定中，試材重量的測定是最常用的。 主要測定參數(shù)生理生化指標(biāo)生理生化指標(biāo)在肉眼可見的反應(yīng)出現(xiàn)之前，試材的生理生化的變化往往可以測定出來。植物呼吸和光合作用以及所含成分或新陳代謝物質(zhì)的變化等都可以作為測定的指標(biāo)。癥狀癥狀有些除草劑可引起試材的典型癥狀，因此，可以利用此種反應(yīng)來鑒定除草劑。 特殊技術(shù)特殊技術(shù)Parker以青萍為試材，以百草枯和脲類除草劑的拮抗作用來測青萍的濃度；若以愈傷組織為試材，則測愈傷組織的生長量。 測定結(jié)果表達(dá)方法測定結(jié)果表達(dá)方法正確地評價某一藥劑的生物測定結(jié)果是很重要的 。常用地上部鮮重減少50（ED50）、地上部干重減少50CR50、株高減少

4、50（LD50?；駿D50）及覆蓋面積減少50（EC50）所需要的除草劑量來表示這一類試驗結(jié)果。 Y=a+bx0級級同對照同對照 1級級抑劑生長抑劑生長25以下以下 2級級抑制生長抑制生長50以下以下 3級級抑制生長抑制生長75以下以下 4級級抑制生長抑制生長75以上以上 5級級死亡死亡目測的分級標(biāo)準(zhǔn)目測的分級標(biāo)準(zhǔn)四、除草劑常用的生物測定方法四、除草劑常用的生物測定方法 v黃瓜幼苗法黃瓜幼苗法v小杯法小杯法v小球藻法小球藻法v去胚乳小麥幼苗法去胚乳小麥幼苗法v浮萍法浮萍法 種子發(fā)芽測定法是一種常用的除草劑種子發(fā)芽測定法是一種常用的除草劑活性測定方法，種子發(fā)芽率、根與莖的生活性測定方法，種子發(fā)芽

5、率、根與莖的生長量或作長度在一定范圍內(nèi)與藥劑劑量呈長量或作長度在一定范圍內(nèi)與藥劑劑量呈相關(guān)性，因此可用作除草劑的定量測定，相關(guān)性，因此可用作除草劑的定量測定，有較高的靈敏度。有較高的靈敏度。種子發(fā)芽測定法種子發(fā)芽測定法 1發(fā)芽率發(fā)芽率 調(diào)查對照處理和藥劑處理種子的發(fā)芽數(shù)量，然后計算發(fā)芽率。 藥劑處理的發(fā)芽數(shù) 發(fā)芽率（）一一X 100 對照處理的發(fā)芽數(shù) 調(diào)查項目調(diào)查項目2生長抑制率生長抑制率 測定發(fā)芽以后芽或根的長度，或者是測量鮮重或干重（較少）。 對照處理一藥劑處理生長抑制率（%）X100 對照處理1.黃瓜幼苗形態(tài)法黃瓜幼苗形態(tài)法。1234CK57%2,4D丁酯乳油對黃瓜種苗的抑制作用丁酯乳油

6、對黃瓜種苗的抑制作用100mg/L10mg/L1mg/L1mg/L0.01mg/LCK 本方法是測定激素類除草劑及其他植物生長調(diào)節(jié)劑活性的常用方法，具有 反 應(yīng) 靈 敏 、 測 定 范 圍 大（0.11000ppm），操作簡便等優(yōu)點。 2.小杯法小杯法4 5 CK 1 2 3 該法是上海植物生理研究所于該法是上海植物生理研究所于1972年建立的。年建立的?？梢詼y定二苯醚類，酰胺類和氨基甲酸酯類、氯可以測定二苯醚類，酰胺類和氨基甲酸酯類、氯代脂肪酸類等除草劑的活性，但對抑制植物光合代脂肪酸類等除草劑的活性，但對抑制植物光合作用的除草劑則幾乎不能采用。作用的除草劑則幾乎不能采用。該法具有操作簡便，

7、測定周期短、范圍較廣的該法具有操作簡便，測定周期短、范圍較廣的優(yōu)點。優(yōu)點。 試材選用小麥、油菜、水稻、稗草等。以直徑3.5 cm，高5.0cm的玻璃杯為容器（亦可用50ml 的小燒杯代替）。杯底放一張圓濾紙片，吸取一定量的有機溶劑溶解的待測藥液倒入杯內(nèi)，揮發(fā)干溶劑。若以水稻、稗草等水生雜草種子為試材，則在小燒杯中加入2ml蒸餾水；3d后分別記載株高或測定鮮重。計算抑制生長50所需要的濃度（LC50）。 若以小麥、油菜種子為試材、則在濾紙片下放一層直徑約為0.5cm大小的玻璃珠（短玻棒也可）再加入3ml蒸餾水。選擇剛萌動的種子10粒，排放到濾紙片上，置28恒溫箱培養(yǎng)，白天給予日光燈照。培養(yǎng)期間每

8、天加入一定量蒸餾水來補充揮發(fā)掉的水份。 0級級同對照同對照 1級級抑制生長抑制生長25以下以下 2級級抑制生長抑制生長50以下以下 3級級抑制生長抑制生長75以下以下 4級級抑制生長抑制生長75以上以上 藥效的分級標(biāo)準(zhǔn)為藥效的分級標(biāo)準(zhǔn)為然后計算每一濃度處理的抑制指數(shù)： （級別X各級代表株數(shù)）抑制指數(shù)X100總株數(shù)X最高級別 將抑制指數(shù)（抑制百分?jǐn)?shù)）轉(zhuǎn)換為機率值，濃度（劑量）以對數(shù)值表示，求出EC50。 本法是本法是Parker于于1966年首先報道年首先報道的，后經(jīng)改進(jìn)，縮短測定時間。高的，后經(jīng)改進(jìn)，縮短測定時間。高粱法適宜于測定非光合作用抑制劑，粱法適宜于測定非光合作用抑制劑，它具有操作簡便

9、，培養(yǎng)期間不用管它具有操作簡便，培養(yǎng)期間不用管理、周期短，測定范圍廣等優(yōu)點。理、周期短，測定范圍廣等優(yōu)點。還可改用燕麥、黃瓜等為材料來擴(kuò)還可改用燕麥、黃瓜等為材料來擴(kuò)大測試范圍。大測試范圍。3.高梁法簡介高梁法簡介培養(yǎng)皿黃砂除草劑高梁種子 上海植生所的方法是：用直徑9cm的培養(yǎng)皿，裝滿干燥黃砂并刮平，每皿加人30ml藥液，正好使全皿黃砂浸透，然后用有十個齒的齒板在皿的適當(dāng)位置壓孔（或用細(xì)玻棒均勻壓10個孔）以便每皿能排10位根長12mm（根尖尚未長出根鞘）的萌發(fā)高粱種子（一般于試驗前的一天在25溫箱內(nèi)催芽）。為了縮短測試時間，在排種培養(yǎng)的前一天，將上述培養(yǎng)好的培養(yǎng)皿、置于34恒溫箱中過夜，以提

10、高砂溫（室溫低時尤為重要），排種工作在恒溫室中進(jìn)行，然后放在34恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，隔8小時左右，就可劃道標(biāo)記每一株根尖位置起點，過1416h，對照根長30mm左右，即可測量，求出抑制生長50的除草劑濃度。 此法對高粱種子要求嚴(yán)格，雜交高粱種子因生長勢不整齊不適于作試材，農(nóng)家品種生長勢整齊?？刹捎?。此外，培養(yǎng)皿內(nèi)裝砂量要適合，少了會使植物材料與藥劑接觸不良，砂多則使植物生長受阻礙，這都會影響到測定結(jié)果的精確性本方法是在Jaworski的黑麥草測定法啟發(fā)下，由沈陽化工研究院除草劑組建立的。它適宜于測定一氯代乙酰胺類除草劑，敏感度達(dá)0.01PPm；亦可測除草醚、五氯酚鈉等除草劑，但敏感度較低。測定原理是

11、利用稗草中胚軸（從種子到芽鞘節(jié)處的長度）在黑暗中伸長的特點，以藥劑抑制中胚軸的長度來測定藥劑的活性。 4.稗草胚軸中胚軸法稗草胚軸中胚軸法 將一系列濃度的敵草胺藥液或待測液50ml注入50ml小燒杯中。每杯投入10顆剛剛露白的稗草籽。為了避免在測定中可能有個別幼芽浮起，可以在種子周圍撒一些石英砂，使種子固定。放入恒溫箱中，在2830下黑暗培養(yǎng)，經(jīng)4天后測定中胚軸的長度。u建立時間：1964年由上海植生所建立u適用范圍：用于測定光合作用抑制劑類除草劑u優(yōu)點：與其他測定光合作用抑制劑的方法相比，具有操作簡便、測定周期短、專一性好等優(yōu)點。5.去胚乳小麥幼苗法去胚乳小麥幼苗法（1）選擇飽滿度一致的小麥

12、種子，浸種2h后，排列在鋪有濾紙或紗布的搪瓷盤中，在室溫20左右進(jìn)行催芽，34d后苗高達(dá)23cm。 (2)精選高度一致的幼苗，輕輕取出；免得傷害根部，然后用鑷子摘除胚乳，再用水漂洗掉附在上面的胚乳成分，準(zhǔn)備種植。去胚乳小麥幼苗法去胚乳小麥幼苗法（3）在直徑4.5cm高5.0cm的小玻璃杯注入不同濃度的供試藥液3ml和稀釋10倍的培養(yǎng)液6ml，每杯播入上述去胚乳小麥幼苗10株。（4）在溫度2126左右和光照下培養(yǎng)67d后觀察藥效。注意每天應(yīng)該給每個小杯稱重，補足損失的水分。12345CK測量所有小麥苗的生長量，即從芽鞘到最長葉尖的距離，并按下式求出生長抑制率，繼而求出EC50 對照生長量一處理生

13、長量對照生長量一處理生長量 生長抑制率（）生長抑制率（）X 100 對照生長量對照生長量結(jié)果檢查與計算結(jié)果檢查與計算 本法是由南開大學(xué)元素所譚惠芳等建立本法是由南開大學(xué)元素所譚惠芳等建立的。對測定觸殺型除草劑較敏感，如百草枯、的。對測定觸殺型除草劑較敏感，如百草枯、殺草快、除草醚、敵稗等。另外，對通過干殺草快、除草醚、敵稗等。另外，對通過干擾體內(nèi)含氮化合物代謝而殺草的除草劑也很擾體內(nèi)含氮化合物代謝而殺草的除草劑也很敏感，如殺草強、殺草胺，敏感，如殺草強、殺草胺， 2 2，4 4D D， 2 2，4 4，5 5T T、二氯丁酸等。、二氯丁酸等。 6.蘿卜子葉法蘿卜子葉法 將洗凈的水蘿卜種子播種在

14、墊有二層濾紙的大將洗凈的水蘿卜種子播種在墊有二層濾紙的大培養(yǎng)皿內(nèi)，加入適量蒸餾水，加蓋后置培養(yǎng)皿內(nèi)，加入適量蒸餾水，加蓋后置27恒溫恒溫箱黑暗培養(yǎng)約箱黑暗培養(yǎng)約30h后，從幼苗上切下子葉，選擇大后，從幼苗上切下子葉，選擇大小一致的小一致的10片放于墊有一層濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)（皿片放于墊有一層濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)（皿直徑直徑5cm），皿內(nèi)盛有），皿內(nèi)盛有2mm磷酸緩沖液配制的一磷酸緩沖液配制的一系列不同濃度除草劑溶液系列不同濃度除草劑溶液5ml，加蓋置于，加蓋置于25土土l的恒溫室內(nèi)培養(yǎng)，給予的恒溫室內(nèi)培養(yǎng)，給予20003000lx螢光燈連續(xù)螢光燈連續(xù)光照光照3d后，稱子葉鮮重，求出抑制葉片生長后，稱子葉

15、鮮重，求出抑制葉片生長50的除草劑濃度，也可測定葉綠素的含量。的除草劑濃度，也可測定葉綠素的含量。該法是由沈陽化工研究院建立的，適用于脲類及均三氮苯類光合作用抑制劑的生物測定方法。對綠麥隆、利谷隆的敏感度可達(dá)0.025ppm。 7.番茄水培法番茄水培法 首先用盆栽法培養(yǎng)番茄苗，待二片真葉時，作水培試材用。取30ml試管編號。將供試藥劑用培養(yǎng)液稀釋成一系列濃度的溶液，每只試管加入10ml。挑選生長健壯，大小高度一致的番茄苗，將主根及子葉剪掉后插入試管，每管插苗4株（播前稱重，使各管苗重相等）。在光照下25培養(yǎng)2周左右（反應(yīng)速度與光照及溫度有關(guān)），測定苗的鮮重。培養(yǎng)期間應(yīng)每天補加蒸發(fā)掉的水分。以生

16、長抑制率來評價活性，亦可求出EC50。 和番茄水培法相似的還有燕麥法將土壤和供試藥劑和番茄水培法相似的還有燕麥法將土壤和供試藥劑混合，在大玻璃管內(nèi)裝入混合，在大玻璃管內(nèi)裝入200g土壤（以干土計），播土壤（以干土計），播入挑選的燕麥種子，土壤水分保持在入挑選的燕麥種子，土壤水分保持在50左右，自然左右，自然光下培養(yǎng)光下培養(yǎng)2周后，測量地上部分的鮮重。周后，測量地上部分的鮮重。 菜豆葉片法土壤內(nèi)混入一定量藥劑，然后播入菜菜豆葉片法土壤內(nèi)混入一定量藥劑，然后播入菜豆種子，土壤含水量豆種子，土壤含水量60左右，自然光下培養(yǎng)，當(dāng)?shù)谧笥?，自然光下培養(yǎng)，當(dāng)?shù)谝黄貜?fù)葉長全，第二片又剛剛出現(xiàn)時，測量其葉一

17、片三重復(fù)葉長全，第二片又剛剛出現(xiàn)時，測量其葉面積。面積。 Taylor和和Loader，1984年建立了該種方年建立了該種方法，目的是篩選防治野燕麥的除草劑混劑，法，目的是篩選防治野燕麥的除草劑混劑，該法快速、簡便。該法快速、簡便。8.葉鞘滴注法葉鞘滴注法具體方法是：當(dāng)正常生長的燕麥具體方法是：當(dāng)正常生長的燕麥長至長至1個半葉（即個半葉（即1葉葉1心）時，在心）時，在第一片葉張開的葉鞘里，滴加第一片葉張開的葉鞘里，滴加10ul供試的一定濃度的藥液。供試的一定濃度的藥液。24-28h后，切下根，取上部約后，切下根，取上部約2cm長長的一段，插入清水洋菜培養(yǎng)基上。的一段，插入清水洋菜培養(yǎng)基上。再經(jīng)

18、再經(jīng)24h，取出測量每一劑量處理，取出測量每一劑量處理的葉片延伸長度，并以此評判除的葉片延伸長度，并以此評判除草劑活性。草劑活性。本法是Suwunnamek設(shè)計的，用來測定內(nèi)吸傳導(dǎo)性且作用緩慢的除草劑，如草甘膦等。該法既可反應(yīng)藥劑的傳導(dǎo)性能，又能反映藥劑對地下部分再生能力的抑制程度。9.再生苗測重法再生苗測重法 用盆栽法種植香附子，等長成苗后，葉面噴灑一定濃度的草甘膦藥液，一周后剪除香附子苗（離土表1cm），再經(jīng)過一個月左右測再生苗的的鮮重。沈陽化工研究院改進(jìn)了此方法，利用玉米做試材。具體方法：將6粒已催芽的玉米種子種在花盆內(nèi)，在3葉期時噴施草甘膦，24h 后，從第一片玉米葉基部剪去頂端。經(jīng)一定時間后，測量再生苗的鮮重或高度。也可在噴藥后不同時期剪去苗的地上部，測其是否再生或再生后地上部分的鮮重。五、除草劑田間藥效試驗調(diào)查除草劑效果或調(diào)查除草劑增產(chǎn)情況都要堅持隨機取樣，隨機取樣的方法有五點法，對角線法、棋盤式取樣法等。生育期施用除草劑，應(yīng)在施藥前13天先調(diào)查一次雜草基數(shù)，作物播前或播后苗前施用除草劑則不進(jìn)行用藥前的雜草基數(shù)調(diào)查。施藥后調(diào)查除草效果應(yīng)根據(jù)除草劑的作用快慢決定調(diào)查時間，還要根據(jù)除草劑持效長短作第二次甚至第三次調(diào)查，每兩次調(diào)查之間相隔715天。調(diào)查點的數(shù)量應(yīng)由小區(qū)面積決定，小區(qū)試驗一般每小區(qū)取35點調(diào)查，示范性試驗每區(qū)調(diào)查點應(yīng)在5個